Potentiel neuroprotecteur des isothiocyanates dans un modèle in vitro de neuroinfammation

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Tiziana Latronico1 · Marilena Larocca2 · Serafna Milella1 · Anna Fasano1 · Rocco Rossano2 · Grazia Maria Liuzzi1

Reçu : 10 juillet 2020 / Accepté : 25 octobre 2020 / Publié en ligne : 16 novembre 2020

© Les auteurs 2020

Fonction de poudre à base de plantes Cistanche: a un très boneffet neuroprotecteur

Résumé

Les isothiocyanates (ITC), présents comme précurseurs des glucosinolates dans les légumes crucifères, ont montréanti-inflammatoire, activités antioxydantes et anticancéreuses. Ici, nous avons comparé les effets de trois ITC différents sur la production de ROS et sur l'expression de la métalloprotéinase matricielle (MMP) -2 et -9, qui représentent des facteurs pathogéniques importants de diverses maladies neurologiques. Des cultures primaires d'astrocytes de rat ont été activées par le LPS et traitées simultanément avec différentes doses d'isothiocyanate d'allyle (AITC), de 2-isothiocyanate de phénéthyle (PEITC) et de 2-sulforaphane (SFN). Les résultats ont montré que le SFN et le PEITC étaient capables de contrecarrer la production de ROS induite par H2O2. L'analyse zymographique des surnageants de culture cellulaire a mis en évidence que le PEITC et le SFN étaient les inhibiteurs les plus efficaces de MMP-9, alors que seul le SFN inhibait de manière significative l'activité de MMP-2. L'analyse par PCR a montré que tous les ITC utilisés inhibaient de manière significative l'expression de MMP-2 et de MMP-9. L'étude de la voie de signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) a démontré que les ITC modulent la transcription des MMP en inhibant l'activité de la protéine kinase régulée par les extracellulaires (ERK). Les résultats de cette étude suggèrent que les ITC pourraient être des agents nutraceutiques prometteurs pour la prévention et le traitement complémentaire des maladies neurologiques associées à l'implication des MMP.

Mots clésAntioxydant · Anti-inflammatoire · Isothiocyanate · Métalloprotéinases matricielles · Maladies neurodégénératives

Introduction

La neuroinflammation est une réponse complexe à une lésion cérébrale impliquant une cascade d'événements biochimiques conduisant à l'activation des cellules résidentes du système nerveux central (SNC). L'activation aberrante des astrocytes compromet leur rôle neuroprotecteur conduisant à la libération de médiateurs inflammatoires, tels que les espèces réactives de l'oxygène (ROS), l'oxyde nitrique (NO), les cytokines, les chimiokines et les métalloprotéinases matricielles

(MMP).

Les MMP sont une grande famille d'endopeptidases neutres dépendantes de Zn2 plus qui ont comme cibles principales les composants de la matrice extracellulaire (ECM) tels que la fibronectine, le collagène, l'élastine et la laminine (Latronico et Liuzzi 2017).

Tiziana Latronico

tiziana.latronico@uniba.it

Département de Biosciences, Biotechnologies et Biopharmaceutique, Université de Bari "Aldo Moro",

Bari, Italie

Département des sciences, Université de Basilicate, Potenza,

Italie

Dans le SNC, les MMP sont impliquées dans diverses réponses physiologiques, telles que la morphogenèse, le renouvellement et le remodelage de la MEC, l'embryogenèse et la réparation des plaies ; cependant, lorsque les MMP échappent aux mécanismes de régulation, elles deviennent nocives (Rosenberg 2009 ; Agrawal et al. 2008).

À cet égard, il est connu que les altérations de l'expression et de l'activité des MMP sont des événements pathogéniques clés dans plusieurs troubles neurologiques (Latronico et Liuzzi 2017 ; Mastroianni et Liuzzi 2007 ; Brkic et al. 2015). Des preuves expérimentales ont suggéré que parmi les MMP, les gélatinases A (MMP-2) et B (MMP-9) sont particulièrement impliquées dans la neuroinflammation puisque leur régulation à la hausse peut compromettre l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BBB). Cela conduit à un recrutement et à une infiltration accrus de cellules immunitaires du sang périphérique dans le parenchyme cérébral, perpétuant le processus inflammatoire qui est la cause de la perte neuronale progressive et de la fonction neuronale altérée (Rivest 2009). Plusieurs études in vitro et in vivo ont montré que la production de ROS est l'un des facteurs impliqués dans la régulation à la hausse de l'expression de MMP -9 dans les cellules cérébrales via des mécanismes dépendants de la voie de signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) (Hsieh et Yang 2013).

Sur la base de ces preuves, il est clair que la régulation à la baisse des facteurs neurotoxiques, entraînant une réduction des réponses neuro-inflammatoires, peut représenter une stratégie thérapeutique efficace pour prévenir l'apparition ou atténuer la progression des maladies cérébrales.

Depuis quelques années, l'intérêt biomédical dans le domaine neurologique se porte de plus en plus sur la recherche de composés naturels capables de moduler les processus associés aux réponses neuro-inflammatoires. À cet égard, plusieurs études ont montré que les composés phytochimiques, tels que les polyphénols, les isothiocyanates (ITC) et autres, ont un potentiel neuroprotecteur qui découle également de leur capacité à inhiber l'expression des MMP et à contrecarrer la production de ROS (Dinkova-Kostova et Kostov 2012 ; Liuzzi et al. 2007, 2011).

Les isothiocyanates sont des métabolites produits par plusieurs plantes appartenant à la famille des Brassicacées comme système de défense contre les attaques de pathogènes (Bones et Rossiter 2006). Ils proviennent de la dégradation enzymatique des glucosinolates (GSL) par l'enzyme myrosinase. Les ITC sont présents dans les légumes crucifères couramment consommés tels que le brocoli, les choux de Bruxelles, le chou, le navet, le raifort, le chou-rave, la moutarde, le radis, le cresson et le chou frisé. Leurs quantités dans les aliments sont très variables et dépendent de la transformation et de la préparation des aliments.

Récemment, il a été démontré que les TIC possèdent une variété d'effets thérapeutiques, notamment une action antioxydante, antibactérienne, anti-inflammatoire et chimiopréventive (Dufour et al. 2015 ; Marzocco et al. 2015).

L'activité protectrice des ITC s'exerce par la modulation de différentes voies de signalisation impliquées dans la détoxification, l'inflammation, l'apoptose et la régulation du cycle cellulaire. Plusieurs éléments de preuve indiquent que les propriétés anti-cancérigènes et anti-inflammatoires des ITC pourraient être principalement attribuées à leur capacité à activer la voie du facteur 2 (Nrf2) lié au facteur nucléaire érythroïde 2-. Nrf2 est un facteur transcriptionnel sensible à l'oxydoréduction qui, en présence d'agents électrophiles et de conditions de stress oxydatif, se transloque dans le noyau où il se lie aux éléments de réponse antioxydante (ARE), induisant l'expression de gènes cytoprotecteurs impliqués dans la détoxification et dans la modulation des conditions oxydatives et processus inflammatoires (Heiss et al 2001). À cet égard, il a été rapporté que les ITC sont capables d'augmenter la capacité antioxydante des cellules humaines en induisant l'expression d'enzymes détoxifiantes de phase II et en régulant à la hausse la production de GSH (Wagner et al 2010). De plus, il a été rapporté l'existence d'une interférence entre Nrf2 et la voie du facteur nucléaire (NF)-κB qui entraîne la modulation de l'inflammation (Sturm et Wagner 2017 ; Lee et Johnson 2004). À cet égard, divers modèles expérimentaux in vitro et in vivo de neuroinflammation ont démontré que les ITC sont capables de diminuer de manière significative la translocation de NF-κB avec pour conséquence l'inhibition des cytokines pro-inflammatoires et des MMP (Lee et al. 2015 ; Subedi et al. 2017).

Dans cet article, nous avons étudié l'effet de trois ITC, à savoir l'isothiocyanate d'allyle (AITC), le 2-isothiocyanate de phénéthyle (PEITC) et le 2-sulforaphane (SFN) sur la libération de MMP-2 et -9 ainsi que sur la production de ROS par les astrocytes activés par le LPS. Nos résultats ont mis en évidence que PEITC, SFN et AITC sont capables d'inhiber in vitro l'expression de MMP-9 et MMP-2 dans les astrocytes activés par le LPS et de contrecarrer la production de ROS induite par H2O2. De plus, nous avons démontré que les ITC modulent la surexpression des MMP avec des mécanismes liés à l'inhibition de l'activité de la protéine kinase régulée extracellulaire (ERK). Ces résultats suggèrent qu'une alimentation riche en légumes crucifères peut avoir des avantages potentiels pour la prévention et le traitement complémentaire des maladies neurologiques.

matériaux et méthodes

produits chimiques et réactifs

Le milieu de Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), le sérum bovin fœtal (FBS), la pénicilline et la streptomycine ont été fournis par GIBCO (Paisley, Écosse). Gélatine, DNase 1, poly-L-lysine

(PLL), trypsine, lipopolysaccharide (LPS), bleu trypan et 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2.5-bromure de diphényltétrazolium (MTT ), isothiocyanate d'allyle (AITC) [cod. 377 430, pureté 95 % (HPLC)], 2-Phenethyl isothiocyanate (PEITC) [cod. 253 731, pureté 99 pour cent)], 2- Sulforaphane (SFN) [cod. S6317, pureté supérieure ou égale à 95 % (HPLC)] ont été fournis par Sigma (St. Louis, MO, USA). Le diacétate de 2',7'-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) a été acheté chez Calbiochem. Les protéines standard et le R-250 Coomassie Brilliant Blue provenaient de Bio-Rad (Hercules, CA, USA). Les anticorps anti-protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) (RRID : AB_2294571) ont été achetés auprès de Serotec (Oxford, Royaume-Uni). Les anticorps contre les protéines kinases régulées extracellulaires (ERK) 1/2 et ERK 1/2 phosphorylée (p-ERK 1/2) provenaient de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Les membranes Hybond-P PVDF, le système d'analyse Western Blotting par chimiluminescence améliorée (ECL) et l'anticorps secondaire anti-souris-HRP provenaient de GE

Santé Sciences de la vie (Little Chalfont, Buckinghamshire,

La Grande-Bretagne). Les paires d'amorces spécifiques aux ARNr MMP-2, MMP-9 et 18S provenaient de Sigma Genosys (Cambs, Royaume-Uni). Le mini kit RNeasy et le kit de transcription inverse QuantiTect ont été achetés auprès de Qiagen (Valencia, CA, USA). Les réactifs Econo-Taq PLUS GREEN 2X Master Mix pour PCR ont été achetés auprès de Lucigen Corporation (Middleton, WI, USA).

Déclaration d'éthique

Les expériences impliquant des animaux ont été réalisées conformément aux recommandations du NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et avec l'approbation du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Bari, Italie (numéro de permis : 23-98- UN).

Préparation des cultures d'astrocytes

Les astrocytes ont été préparés à partir des tissus néocorticaux de {{0}}rats Wistar âgés d'un jour (RRID : RGD_737960, Harlan Laboratories srl, Udine, Italie). Pour la préparation des astrocytes, 6 portées de 12 petits, chacun des deux sexes, ont été utilisées. Les animaux ont été euthanasiés par exposition au dioxyde de carbone (CO2) et tués par décapitation rapide. Les tissus néocorticaux ont été disséqués et utilisés pour la purification des cultures de cellules gliales primaires suivant la méthode rapportée par Latronico et al. (2018). En bref, après la dissection, les cerveaux de rats ont été appauvris en méninges et en vaisseaux sanguins, hachés mécaniquement et digérés avec 0.25 % de trypsine en présence de 0.01 % de DNase. Après centrifugation et évaluation de la viabilité cellulaire, les cellules ont été étalées dans des flacons revêtus de PLL (75 cm2) à une densité de 1,5 × 107 cellules/flacon dans du DMEM, 10 % de FBS, 100 UI mL −1 de pénicilline, 100 µg mL −1 de streptomycine , et maintenu à 37 degrés dans un 5 pour cent de CO2. Après 7 jours, les flacons ont été secoués pour éliminer les oligodendrocytes et la microglie. La pureté des astrocytes, obtenus par trypsinisation (0,25 % trypsine/0,02 % EDTA), a été évaluée par immunocoloration pour GFAP.

Traitement des astrocytes activés par le LPS avec l'isothiocyanate d'allyle, l'isothiocyanate de phénéthyle ou le 2-sulforaphane

Des astrocytes confluents, ensemencés dans des plaques à 96 puits, ont été stimulés avec 10 µg mL -1 de LPS et traités simultanément avec différentes concentrations d'isothiocyanate d'allyle (AITC), de 2-isothiocyanate de phénéthyle (PEITC) ou de 2-sulforaphane (SFN) dans du DMEM sans sérum. Les astrocytes dans le DMEM sans sérum et les astrocytes activés par le LPS représentaient respectivement des témoins négatifs et positifs. De plus, étant donné que les solutions mères d'AITC (100 μM), de PEITC (67 μM) et de SFN (56,4 μM) ont été préparées dans du DMSO, une courbe dose-réponse au DMSO, dilué dans un milieu de culture à la même concentration de solvant présente dans les échantillons analysés, a été exécuté pour estimer la toxicité du composé. Après 20 h d'incubation à 37 degrés, 5% de CO2, les surnageants ont été collectés et stockés à -20 degrés jusqu'à leur utilisation, tandis que les cellules ont été soumises à un test MTT pour évaluer la viabilité cellulaire.

Test de viabilité cellulaire MTT

La cytotoxicité de l'AITC, du PEITC et du SFN sur les astrocytes a été détectée à l'aide du MTT [{{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,{{5 }}bromure de diphényltétrazolium]. Ce test est basé sur la réduction du MTT par la succinate déshydrogénase mitochondriale dans les cellules viables, en un produit de formazan bleu insoluble qui peut être mesuré par spectrophotométrie. Brièvement, après un traitement de 20 h avec AITC, PEITC ou SFN, le milieu de culture a été retiré et les cellules ont été chargées avec 0,5 mg mL-1 de MTT. Après incubation pendant 2 h à 37 degrés, le milieu à 5 % de CO2 a été éliminé et les cristaux de formazan dans les cellules ont été solubilisés avec de l'éthanol à 90 %. Après agitation des plaques pendant 15 min pour obtenir une solubilisation complète des cristaux, la quantité du produit formazan a été déterminée par absorbance optique à 560 nm avec une longueur d'onde de référence de 690 nm. La viabilité cellulaire a été exprimée en pourcentage du contrôle (CTRL), représenté par les cellules non traitées, qui a été fixée à 100 %. Pour chaque composé, une courbe dose-réponse de la viabilité cellulaire a été obtenue.

Détection des espèces réactives de l'oxygène

La détection des espèces réactives de l'oxygène (ROS) a été réalisée en chargeant des astrocytes avec 10 μM de diacétate de 2 ', 7'-dichlorofluorescéine (DCFH-DA) dans du DMEM sans rouge de phénol à 37 degrés pendant 30 min. Ensuite DCFH-DA a été retiré des puits et les cellules ont été traitées pendant 1 h avec AITC (400 μM), PEITC (10 μM) ou SFN (25 μM) dans du DMEM sans rouge de phénol en présence de H2O2 à la concentration finale de 100 μM . Les cellules traitées uniquement avec DCFH-DA ou avec H2O2 représentaient les témoins négatifs (CTRL) et positifs (H2O2), respectivement. Après incubation, les cellules ont été rincées avec du PBS et lysées avec

Tris–HCl 10 mM/NaCl 150 mM/Triton X-100 0.5 %, pH 7,5,

puis centrifugé à 10,000×g, 4 degrés pendant 10 min. Les surnageants ont été collectés et leur analyse spectrofluorimétrique a été réalisée à 525 nm sous excitation à 485 nm. Les résultats ont été normalisés à la teneur totale en protéines et la production de ROS a été exprimée en pourcentage relatif de l'intensité de la photoluminescence (PL) par rapport au contrôle positif.

Détection des gélatinases

L'activité gélatinase dans les surnageants cellulaires (SN) a été détectée par analyse zymographique comme rapporté par Latronico et al. (2013). En bref, une quantité de SN, correspondant à environ 10 ug de protéines totales, a été solubilisée avec 30 ul de tampon d'échantillon Laemmli sans -mercaptoéthanol. Les échantillons ont été analysés dans un gel de polyacrylamide à 7,5 % copolymérisé avec de la gélatine à 0,1 % (poids/volume). Après l'électrophorèse, les gels ont été rincés deux fois avec 2,5 % de Triton X-100/CaCl2 10 mM dans du Tris-HCl 50 mM, pH 7,4 et incubés pendant 24 h à 37 degrés dans 1 % de Triton X-100 /Tris–HCl 50 mM/CaCl2 10 mM, pH 7,4. Les gels ont été colorés avec du bleu brillant de Coomassie R-250 et décolorés dans du méthanol/acide acétique/H2O (4:1:5 v/v). L'activité gélatinase a été visualisée sous la forme d'une bande claire de digestion sur un fond bleu du gel et a été quantifiée par analyse d'image densitométrique informatisée à l'aide du logiciel Image LabTM (Bio-Rad Laboratories). Gélatinase

l'activité a été exprimée en densité optique (DO) × mm2, représentant la zone de balayage sous les courbes qui prend en compte à la fois la luminosité et la largeur de la zone de lyse du substrat. Les données ont été exprimées à l'aide de l'équation suivante : pourcentage d'inhibition=[100 - (échantillon DO/contrôle positif DO) × 100].

Transcription inverse‑amplification en chaîne par polymérase (RT‑PCR)

Les astrocytes, ensemencés dans des plaques à 6 puits, ont été activés avec du LPS (10 µg mL-1) et traités simultanément avec des ITC à la concentration maximale non toxique. Après 20 h d'incubation, l'ARN total a été extrait des astrocytes à l'aide du mini kit Qiagen RNeasy selon les instructions du fabricant. L'ADN complémentaire (ADNc) a été synthétisé à partir de 500 ng d'ARN en utilisant le kit QuantiTect Reverse Transcription selon les instructions du fabricant. Un total de 25 ng de produits de transcription inverse ont été utilisés pour amplifier un fragment de 591 pb à l'aide d'amorces spécifiques (sens 5′-GTC ACT CCG CTG CGC TTT TCT CG-3′ ; antisens 5′-GAC ACA TGG GGC ACC TTC TGA-3′) pour la séquence MMP-2 de rat et un fragment de 541 bp utilisant des amorces spécifiques (sens 5′-CGG AGC ACG GGG ACG GGT ATC 3′ ; anti-sens 5′-AAG ACG AAG GGG AAG ACG CAC ATC 3′) pour la séquence MMP-9 du rat. En parallèle, l'amplification d'un fragment de 308 pb d'ARNr 18S de rat (sens 5′-GCCTAGATA CCGCAGCTAGGA-3′ ; antisens 5′-TCATGGCCTCAG TTCCGAA-3′), un gène de référence interne relativement invariant, a été réalisée . Les jeux d'amorces, déjà validés dans d'autres études (Latronico et al. 2013 ; Liuzzi et al. 2004 ; Gramegna et al. 2011) ne reconnaissent spécifiquement que les gènes d'intérêt comme indiqué par l'amplification d'une seule bande de la taille attendue de la PCR des produits. L'amplification par PCR a été réalisée pendant 25 cycles, chacun consistant en une dénaturation à 94 degrés, un annelage à 59 degrés et une extension à 72 degrés. Après amplification, les produits ont été analysés dans des gels d'agarose à 1,5 %. Après l'analyse densitométrique des gels, l'amplification des gènes cibles a été normalisée à l'expression de l'ARNr 18S et les résultats ont été exprimés en pourcentage d'inhibition par rapport au contrôle positif, comme indiqué pour la quantification de la gélatinase.

Détection de la phosphorylation de ERK 1/2 par analyse Western blot

ERK 1/2 ont été détectés par analyse immunoblot comme indiqué dans Latronico et al. (2018). En bref, primaire confluente

les astrocytes étalés dans des plaques {{0}}puits, rendus quiescents dans un milieu sans sérum pendant 24 h, ont été prétraités pendant 1 h avec AITC (400 μM), PEITC (10 μM), ou SFN (25 μM) dans du DMEM sans rouge de phénol. Après stimulation pendant 2 h avec 10 μg mL-1 de LPS, les cellules ont été lysées avec du Tris-HCl 20 mM, du NaCl 150 mM, du pyrophosphate de Na 2,5 mM, du glycérophosphate 1 mM et du Triton X -100 à 1 %, 1 mM fluorure de phénylméthylsulfonyle, aprotinine 20 ug/mL, EGTA 1 mM, fluorure de Na 1 mM, Na3VO4 1 mM, pH 7,5. Soixante ug de protéines totales de chaque échantillon ont été résolus par électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide à 10% et les protéines ont ensuite été immunotransférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène. Après blocage pendant une nuit à 4 degrés avec 0,05 % de Tween 20, 1 % de lait, 1 % d'albumine de sérum bovin dans 150 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), les membranes ont été sondées pendant une nuit à 4 degrés avec un anti-p- monoclonal. Anticorps ERK 1/2 (1:500). Ensuite, les membranes ont été lavées trois fois avec 0,05 % de Tween 20 dans une solution saline tamponnée au Tris, sondées avec un anticorps secondaire anti-souris-peroxydase de raifort (1:20, 000) pendant 2- h à 24 degrés et détectées avec une chimiluminescence améliorée. Pour évaluer la quantité totale d'ERK, les membranes ont été décapées et incubées avec un anticorps spécifique de l'ERK 1/2 non phosphorylé (1: 500). Les intensités des bandes ont été quantifiées par balayage densitométrique des blots et les niveaux de phosphorylation de l'ERK 1/2 ont été normalisés à l'ERK 1/2 non phosphorylé et exprimés en pourcentage par rapport au contrôle positif (astrocytes traités au LPS), selon le équation suivante :

pourcentage pERK 1/2=(échantillon DO/contrôle positif DO) × 100.

analyses statistiques

L'analyse des données a été effectuée à l'aide du GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, Californie, États-Unis). Les données ont été exprimées en valeurs moyennes ± ET. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) suivie du test post hoc de comparaison multiple de Dunnett.

Résultats

Effet des composés isothiocyanates sur la viabilité des astrocytes

Des expériences préliminaires ont été réalisées pour évaluer la cytotoxicité de l'AITC, du PEITC ou du SFN. A cet effet, des astrocytes purifiés ont été traités pendant 20 h avec les composés ITC à des concentrations comprises entre 5 et 400 µM ou avec du DMSO dilué dans du milieu de culture comme décrit dans la section Méthode. Comme le montre la figure 1, le DMSO n'était pas toxique à toutes les concentrations utilisées qui correspondent à celles des solutions ITC testées. Parmi les ITC étudiés, l'AITC

Fig. 1 Viabilité cellulaire des astrocytes traités avec des composés d'isothiocyanate. Les astrocytes primaires confluents ont été traités pendant 20 h avec de l'isothiocyanate d'allyle (AITC), du 2-isothiocyanate de phénéthyle (PEITC) ou du 2-sulforaphane (SFN) aux concentrations indiquées, puis soumis au test MTT. De plus, comme c'est dans les solutions mères qui ont été dissoutes dans du diméthylsulfoxyde (DMSO), une courbe dose-réponse au DMSO, dilué dans un milieu de culture à la même concentration de solvant (pourcentage) présente dans les échantillons ITC a été exécutée dans chaque expérience pour obtenir une estimation fiable de la toxicité de l'ITC. Le contrôle (CTRL) était représen-

parfumé à partir d'astrocytes non traités dans du DMEM sans sérum. Les graphiques représentent les courbes dose-réponse de la viabilité cellulaire exprimée en pourcentage de survie cellulaire par rapport au témoin. Les doses de composés qui déterminaient la viabilité cellulaire au-dessus de 60 % ont été choisies comme concentrations maximales non toxiques. Les valeurs sont la moyenne ± SD de n=3 expériences réalisées sur différentes populations de cellules. Les micrographies montrent des résultats représentatifs de la morphologie cellulaire observée au microscope à contraste de phase (grossissement 50X) après traitement avec les différents composés

était le moins toxique pour les astrocytes. En particulier, l'AITC n'était pas toxique pour les cellules jusqu'à 400 µM tandis que le PEITC et le SFN étaient toxiques à des concentrations supérieures à 10 et 25 µM, respectivement. L'observation microscopique a confirmé les résultats du test MTT montrant qu'aux concentrations toxiques de PEITC et de SFN, les astrocytes étaient réduits en nombre et ceux qui restaient présentaient des changements cytotoxiques dans leur cytoplasme.

Effet protecteur des composés ITC sur la production de ROS dans les astrocytes traités au peroxyde d'hydrogène

Pour évaluer l'effet protecteur des ITC contre le stress oxydatif, les astrocytes ont été prétraités avec PEITC, AITC et SFN à la concentration maximale non toxique puis stimulés avec H2O2. La production intracellulaire de ROS, induite par H2O2, a été dosée par DCFH-DA. Comme le montre la figure 2, l'exposition au signal fluorescent amélioré par H2O2 dans

Fig. 2 Production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les astrocytes traités avec des ITC. La présence de ROS a été dosée en mesurant les changements du signal fluorescent de la 2',7'-dichlorofluorescéine (DCFA) comme indiqué dans la section Matériels et méthodes. Les astrocytes, ensemencés dans des plaques à 6 puits, ont été prétraités pendant 30 min avec DCFA puis traités pendant 1 h avec 10 μM PEITC, 400 μM AITC ou 25 μM SFN en présence de H2O2 à une concentration finale de 100 μM . Les astrocytes traités avec DCFA seul (CTRL) ou avec 100 μM H2O2 représentaient respectivement le contrôle négatif et positif. Le signal fluorescent détecté dans les lysats cellulaires a été mesuré par un fluorimètre à 525 nm sous excitation à 485 nm. La production de ROS a été exprimée en pourcentage (%) de l'intensité de la photoluminescence (PL) par rapport au contrôle positif. Les valeurs sont la moyenne ± SD de n=3 expériences réalisées sur différentes populations de cellules. La diminution statistiquement significative par rapport à H2O2 est indiquée par des astérisques (ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Dunnet ; *p <>

astrocytes par rapport au contrôle (CTRL). Comme en témoigne la diminution de l'intensité de fluorescence DCF, le prétraitement des astrocytes avec des composés ITC a contrecarré la génération de ROS induite par H2O2. Parmi les ITC testés, seuls le PEITC et le SFN ont pu réduire de manière significative la production de ROS d'environ 20 et 24 %, respectivement, par rapport à un témoin positif (H2O2).

Les composés isothiocyanates inhibent les niveaux de MMP‑2 et MMP‑9 dans les astrocytes activés par le LPS

L'effet des composés ITC sur les niveaux de MMP-2 et MMP-9 a été évalué sur des astrocytes activés avec du LPS, qui est connu pour induire l'expression de gélatinases (Gottschall et Deb 1996), et traités simultanément avec AITC, PEITC, ou SFN dans la gamme de concentrations qui n'étaient pas toxiques pour les cellules. Comme le montre la figure 3a, deux bandes claires de digestion de 72 et 92 kDa étaient présentes sur le gel correspondant, respectivement, à MMP-2 et MMP-9. L'activation des astrocytes avec le LPS a augmenté les niveaux de MMP-2 et induit la synthèse de MMP-9. Le traitement par AITC (Fig. 3b), PEITC (Fig. 3c) ou SFN (Fig. 3d) a déterminé une dose-dépendante

réduction des niveaux de MMP-9, qui variaient selon le composé utilisé. En particulier, parmi les ITC utilisés, le SFN était le plus efficace pour inhiber la MMP-9 puisqu'il déterminait 70 % d'inhibition à la dose de 10 μM et 100 % d'inhibition à la dose de 25 μM. De plus, seul le SFN à la concentration maximale non toxique a pu inhiber de manière significative le MMP -2 (Fig. 2d).

Les composés isothiocyanates inhibent l'expression des gènes MMP‑2 et MMP‑9 dans les astrocytes activés par le LPS

Pour déterminer si les composés ITC étudiés étaient capables d'inhiber l'expression de MMP-2 et MMP-9, une RT-PCR a été réalisée sur des astrocytes activés par LPS traités avec la concentration maximale non toxique d'ITC. Comme le montrent les gels représentatifs de la figure 4a, le traitement des astrocytes activés par le LPS avec les ITC individuels a pu contrecarrer l'expression accrue de l'ARNm de MMP-2 et de MMP-9. Comme le montre la figure 4b, l'analyse quantitative des résultats a mis en évidence qu'à la concentration maximale non toxique, les composés ITC ont déterminé une inhibition statistiquement significative de l'expression de MMP-2 et de MMP-9 en comparaison à un témoin positif (LPS). En particulier, PEITC et SFN exercent le même pourcentage d'inhibition sur MMP-2 (85 %) et MMP-9 (100 %) alors que AITC était moins efficace que PEITC et SFN pour inhiber MMP{{17} } (65 %) et MMP-9 (90 %) expression.

ERK 1/2 est impliqué dans l'inhibition de l'expression de MMP par ITC

Étant donné que ERK 1/2 est la principale voie de transduction de signalisation impliquée dans la régulation de l'expression de MMP-2 et MMP-9 dans les astrocytes activés par le LPS (Lee et al. 2003), l'effet des composés ITC sur le l'activation des protéines kinases régulées extracellulaires (ERK) 1/2 a été testée.

Comme le montre la figure 5, le LPS a induit une augmentation statistiquement significative des niveaux d'ERK 1/2 phosphorylée (p-ERK) qui a été contrecarrée par un prétraitement avec les composés ITC.

Discussion

Il est largement admis que les principales stratégies de défense contre de nombreuses maladies consistent principalement à éviter les facteurs de risque et à adopter un mode de vie correct. De nombreuses preuves scientifiques soutiennent l'hypothèse selon laquelle certains métabolites naturels, généralement produits par divers types de fruits et légumes, sont capables de moduler des phénomènes pathologiques tels que le cancer, les maladies neurologiques et d'autres maladies multifactorielles. Dans ce scénario, les isothiocyanates (ITC) ont suscité un grand intérêt compte tenu de leurs propriétés antifongiques, antibactériennes,

Fig. 3 Effet des composés isothiocyanates sur les niveaux de MMP-2 et MMP-9 dans les astrocytes activés par le LPS. En a est rapporté un gel zymographique représentatif de l'analyse des surnageants de culture d'astrocytes activés avec LPS (10 ug mL-1) et traités simultanément pendant 20 h avec AITC, PEITC ou SFN aux concentrations indiquées (μM). Des témoins négatifs et positifs ont été obtenus à partir d'astrocytes non stimulés et non traités dans un milieu sans sérum (CTRL) et LPS-

cellules activées (LPS), respectivement. Les histogrammes b–d représentent les résultats (moyenne ± SD) de n {{0}} expériences réalisées sur différentes populations cellulaires, exprimées en pourcentage d'inhibition de MMP par rapport au LPS, calculées après densitométrie à balayage et analyse informatisée des gels . Une diminution statistiquement significative par rapport au LPS est indiquée par des astérisques (ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Dunnet ; *p < 0.05,="" **p=""><>

propriétés biologiques anticancérigènes, antimutagènes, antioxydantes et anti-inflammatoires (Dufour et al. 2015 ; Marzocco et al. 2015 ; Vig et al., 2009 ; Talalay et Fahey 2001). Les isothiocyanates proviennent de la dégradation enzymatique des glucosinolates (GSL) qui sont des métabolites secondaires présents dans 15 familles botaniques de l'ordre des Capparales et très abondants dans la famille des Brassicacées (Fahey et al. 2001). Les GSL sont hydrolysées par la myrosinase ( -thioglucoside glucohydrolase e; EC 3.2.3.147) dans une variété de composants tels que les ITC, les nitrites, les thiocyanates, les épithionitriles, le SFGate, le glucose et les oxazolidines (Li et Kushad 2005). Bien que les ITC aient été largement étudiés dans le domaine de la chimiothérapie (Grundemann et Huber 2018), peu d'investigations ont été faites sur leur potentiel thérapeutique dans les maladies neurologiques bien qu'il ait été démontré la capacité du SFN et de l'AITC à traverser la BHE et à s'accumuler dans le parenchyme cérébral. (Clarke et al. 2011 ; Jazwa et al. 2011 ; Zhang 2010). Dans cet article, nous avons comparé les effets de trois TIC,

présent dans plusieurs légumes crucifères couramment consommés, sur la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et l'expression de la métalloprotéinase matricielle (MMP) dans un modèle in vitro de neuroinflammation représenté par des astrocytes activés avec du lipopolysaccharide (LPS) ou traités avec H2O2. Les astrocytes, le type de cellules gliales le plus abondant du SNC, jouent un rôle crucial dans le maintien de l'homéostasie cérébrale et sont caractéristiques de différentes maladies neurologiques (Cekanaviciute et Buckwalter 2016 ; Colombo et Farina 2016). Ils sont considérés comme des régulateurs cruciaux de la réponse immunitaire innée et leur réponse aux agressions nocives, telles que le stress oxydatif, peut exacerber les réactions inflammatoires et les lésions tissulaires ou favoriser la réparation des tissus. Il est bien connu que les astrocytes activés produisent des facteurs neurotoxiques tels que les MMP qui ont un rôle clé dans la promotion de la neuroinflammation et de la perte neuronale progressive dans les maladies neurologiques (Hsieh et Yang 2013). Par conséquent, la modulation de la

Fig. 4 Effet des composés ITC sur l'expression de MMP-2 et MMP-9 dans les astrocytes activés par le LPS. Les astrocytes, ensemencés dans des plaques 6 puits, ont été activés avec du LPS (10 µg mL-1) et traités simultanément pendant 20 h avec AITC (400 μM), PEITC (10 μM) ou SFN (25 μM), puis soumis à RT-PCR. Des gels d'agarose représentatifs de l'expression de MMP-2 et MMP-9 sont rapportés en (a). Les histogrammes en (b) représentent les résultats (moyenne ± SD) de n=3 expériences réalisées sur différentes cellules

les événements qui surviennent après l'activation des astrocytes pourraient atténuer la réponse inflammatoire et les dommages neuronaux.

Les résultats de cette étude ont indiqué que parmi les ITC étudiés, l'AITC était moins toxique car il n'entraînait aucune réduction de la viabilité cellulaire à toutes les concentrations utilisées. En revanche, de manière similaire à ce qui a été observé par d'autres auteurs sur diverses lignées de cellules gliales, le PEITC et le SFN ont montré une toxicité cellulaire à des concentrations supérieures à 10 et 25 µM, respectivement (Lee et al. 2015 ; Eren et al. 2018 ; Su et al. 2015).

Dans la littérature scientifique actuelle, il existe de nombreuses données controversées sur les mécanismes moléculaires sous-jacents aux effets des TIC sur la viabilité cellulaire. À cet égard, la plupart des études ont suggéré que les ITC inhibent l'apoptose induisant la croissance cellulaire, l'arrêt du cycle cellulaire, la génération de ROS dans les cellules cancéreuses mais pas dans les cellules normales (Fofaria et al. 2015 ; Qin et al. 2018 ; Sestili et Fimognari 2015). Nous avons constaté que le SFN et le PEITC, mais pas l'AITC, ont un rôle protecteur contre le stress oxydatif chez les astrocytes, en effet aux concentrations maximales non toxiques, ils ont pu contrecarrer la production de ROS induite par l'exposition au H2O2. Le SNC est particulièrement vulnérable au stress oxydatif en raison de sa forte consommation d'oxygène, de ses systèmes antioxydants faibles et de sa forte teneur en biomacromolécules sensibles à l'oxydation. On pense que la génération de ROS et de dommages oxydatifs est impliquée dans la pathogenèse de troubles neurologiques tels que la maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), la sclérose latérale amyotrophique (SLA) et la sclérose en plaques (SEP) (Lee et al. 2015). Par conséquent, bien que dans nos expériences in vitro, le SFN et le PEITC aient contrecarré la production de ROS dans une mesure modérée, nous pourrions supposer qu'in vivo, une administration prolongée d'ITC peut conduire à une réduction plus significative des ROS qui, au fil du temps, peut entraîner des effets significatifs. pour les populations exprimées en pourcentage d'inhibition des MMP par rapport au témoin positif (LPS), calculée après densitométrie à balayage et analyse informatisée des gels. Une diminution statistiquement significative de l'expression de MMP-2 et de MMP-9 par rapport au LPS est indiquée par des astérisques (ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de Dunnet ; *p <>

la prévention et la modulation des maladies du cerveau. Les ROS agissent comme une molécule de signalisation critique pour déclencher la cascade de réponses inflammatoires dans le SNC. À cet égard, il est bien connu que les ROS régulent l'expression de nombreux gènes impliqués dans la neuroinflammation par l'activation de facteurs de transcription pro-inflammatoires tels que le facteur nucléaire-κB (NF-κB) (Lee et al. 2015 ; Chiurchiù et al. 2016 ; Martorana et al. 2019). Dans ce scénario, un rôle important est joué par les MMP dont l'expression est régulée positivement par les ROS via l'activation de NF-κB (Yan et Boyd 2007).

Étant donné que la dérégulation des MMP contribue à la pathogenèse de nombreuses maladies neuro-inflammatoires et neurodégénératives, leur inhibition représente une stratégie thérapeutique importante. Pour cette raison, un intérêt croissant s'est concentré au cours de la dernière décennie sur le potentiel des médicaments et des composés naturels pour inhiber les MMP. De nombreuses études in vitro ont mis en évidence que l'action anti-inflammatoire et antioxydante de plusieurs médicaments et composés bioactifs présents dans les végétaux et organismes marins est associée à leurs capacités à inhiber l'expression des MMPs (Latronico et al. 2016, 2018 ; Di Bari et al 2015). Dans cette étude, nous avons démontré que parmi les ITC testés, le SFN et le PEITC étaient les plus efficaces pour inhiber les niveaux et l'expression de MMP-2 et MMP-9 dans les astrocytes activés par le LPS. L'inhibition des MMP par les ITC a été rapportée dans d'autres études in vivo et in vitro. En particulier, Li et al. (2013) ont démontré que le SFN est capable d'atténuer les dommages causés par la BBB en inhibant l'expression de MMP-9 dans un modèle in vivo d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale. D'autres auteurs ont rapporté que le SFN était capable d'atténuer l'expression de MMP-9 après une lésion de la moelle épinière chez la souris (Mao et al. 2010a). De plus, des études in vitro ont démontré que la suppression par les CTI de la migration cellulaire et

Fig. 5 La kinase 1/2 régulée par un signal extracellulaire (ERK 1/2) est impliquée dans l'inhibition de l'expression de MMP par les composés ITC. Films autoradiographiques représentatifs de l'analyse Western Blot de lysats d'astrocytes prétraités pendant 1 h avec AITC (400 μM), PEITC (10 μM) ou SFN (25 μM), puis activés pendant 2 h avec LPS (10 μm mL{{ 13}}). Les cellules non traitées et non stimulées représentent le contrôle négatif (CTRL). L'histogramme en (b) représente l'invasion des niveaux de pERK1/2 dans les cellules de gliome C6 associée à l'inhibition de l'expression de MMP-9 médiée par NF-κB (Lee et al. 2015).

Les mécanismes moléculaires par lesquels les ITC inhibent les MMP ne sont pas clairs et il n'existe aucune étude portant sur les propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires des ITC sur des cultures primaires d'astrocytes. Plusieurs études soutiennent l'hypothèse que l'effet inhibiteur des ITC est une conséquence de leur capacité à bloquer NF-κB par la voie de signalisation Nrf2. À cet égard, une étude in vivo a montré que les souris knock-out Nrf2 étaient plus sensibles à la réponse inflammatoire médiée par NF-κB de la moelle épinière et à l'expression accrue de gènes dépendants de NFκB, y compris MMP-9 (Mao et al. 2010b ). Bien que les voies NF-κB et Nrf2 puissent interagir, nous avons démontré que la régulation de NF-κB se produit également par la modulation de mécanismes moléculaires indépendants de Nrf2. En effet, nous avons constaté que l'AITC, le PEITC et le SFN inhibaient l'activation de ERK1/2 qui joue un rôle central dans la cascade d'événements de transduction du signal qui régulent finalement la transcription du gène MMP.

Cependant, la preuve expérimentale que le SFN à la concentration maximale non toxique inhibait complètement à la fois l'expression et les niveaux de MMP-9, tandis que l'AITC et le PEITC inhibaient au maximum l'expression de MMP-9, mais ne laissaient tomber que MMP{{3} } à environ 50 %, pourrait suggérer que ces composés modulent la transcription MMP-9 avec différents mécanismes d'action. À cet égard, il a été rapporté que le SFN, en plus de l'inhibition de l'activation de NF-κB induite par le LPS, interfère avec la liaison du LPS au récepteur TLR4 (Koo et al 2013). L'effet inhibiteur du SFN sur TLR4 pourrait empêcher l'activation des astrocytes par le LPS, ce qui pourrait entraîner l'inhibition en amont de l'expression de MMP-9 avec un manque conséquent de production de MMP-9.

obtenu après balayage densitométrique des films autoradiographiques et normalisation à ERK 1/2 non phosphorylé. Les données représentent les moyennes ± SD de n=3 expériences réalisées sur différentes populations de cellules. Les astérisques représentent des valeurs statistiquement différentes du contrôle positif (astrocytes activés par le LPS), qui a été fixé à 100 % (ANOVA unidirectionnelle suivie du test post hoc de comparaison multiple de Dunnett ; *p <>

conclusion

En résumé, nos données indiquent que le traitement des astrocytes avec des ITC réduit la formation de ROS et inhibe la libération de MMP-2 et de MMP-9, fournissant de nouvelles informations sur les propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires des ITC sur les cellules gliales. cellules. Ces résultats suggèrent que les TIC pourraient être des agents nutraceutiques prometteurs pour le développement d'interventions de neuro-nutrition, basées sur l'utilisation d'aliments sains, pour la prévention et le traitement complémentaire des maladies neurologiques.

Financement Financement en libre accès fourni par l'Università Degli Studi di Bari Aldo Moro dans le cadre de l'accord CRUI-CARE.

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