Abstrait

Cistanche tubuleuse(Schenk) Wight, une précieuse plante médicinale homologue de la famille des Orobanchaceae, est largement cultivée dans le sud du Xinjiang en Chine. Ses principaux constituants bioactifs glycosides phényléthanoïdes,échinacosideetActéoside (verbascoside), assurent de multiples activités pharmacologiques, notamment l'antioxydation, l'anti-inflammatoire et la régulation immunitaire. Les procédures de transformation traditionnelles non standardisées entraînent souvent des pertes substantielles de ces composés actifs essentiels, limitant ainsi l'application des médicaments et des aliments fonctionnels.Cistanche tubuleusemorceaux de décoction. Cette recherche visait à optimiser les paramètres de traitement modernes des produits fraisCistanche tubuleusetranches pour maximiser la récupération de l'acteoside et de l'échinacoside, et clarifier davantage le stress oxydatif et la bioactivité anti-inflammatoire ainsi que le mécanisme moléculaire sous-jacent des morceaux de décoction traités de manière optimale au niveau cellulaire.

Des expériences à un seul facteur ont été réalisées pour déterminer les plages appropriées d'épaisseur de tranche, de durée de cuisson à la vapeur et de température de séchage au four. Une méthodologie de surface de réponse Box‑Behnken à trois facteurs et à trois niveaux a été adoptée pour établir des modèles d'interaction multifactorielle, en utilisant la teneur en actéoside et en échinacoside comme doubles indicateurs d'évaluation. Par la suite, un modèle de cellules macrophages de souris RAW264.7 stimulées par les lipopolysaccharides (LPS) a été construit pour simuler la peroxydation lipidique et les dommages inflammatoires aigus. Une série de tests biochimiques, notamment le MTT, la détection fluorescente des ROS, l'ELISA et le Western blot, ont été mis en œuvre pour évaluer le pouvoir anti-oxydant du stress et explorer les voies de transduction du signal.

Selon les résultats expérimentaux, les paramètres de traitement optimaux ont été déterminés comme une épaisseur de tranche de 0,6 cm, un traitement à la vapeur pendant 6 minutes et une température de séchage réglée à 57 degrés. Dans ces conditions pratiques de traitement, les teneurs mesurées en acteoside et en échinacoside ont atteint respectivement 7,25 % et 31,62 %, montrant une bonne cohérence avec les valeurs de prédiction théoriques. Des analyses cellulaires ont révélé que le traitement optimalCistanche tubuleuseLes extraits de morceaux de décoction ont réduit de manière significative les concentrations d’oxyde nitrique (NO) et de malondialdéhyde (MDA) dans les macrophages RAW264.7 soumis au LPS. Parallèlement, il a nettement augmenté les activités enzymatiques antioxydantes intracellulaires de la superoxyde dismutase (SOD), de la catalase (CAT), de la lactate déshydrogénase (LDH), ainsi qu'une teneur accrue en glutathion (GSH). Les niveaux de sécrétion de médiateurs pro-inflammatoires, notamment le TNF-, l'IL-1 et l'IL-6, ont également été supprimés de manière dose-dépendante. La détection par Western Blot a validé queCistanche tubuleuseles extraits ont limité la phosphorylation excessive des protéines clés dans les cascades de signalisation p38/AKT/JNK/NF-κB.

En résumé, ce protocole de traitement moderne et optimisé améliore efficacement les rendements en glycosides phényléthanoïdes caractéristiques (acteoside et échinacoside) dansCistanche tubuleusemorceaux de décoction. Les matières végétales transformées exercent des effets anti-oxydatifs et anti-inflammatoires importants dans le modèle de lésion macrophage induite par le LPS, dont le mécanisme pharmacologique est partiellement réalisé via l'inhibition de la suractivation de l'axe de signalisation inflammatoire p38/AKT/JNK/NF-κB. Ce travail fournit des paramètres techniques fiables pour une fabrication industrielle standardisée et fournit un support expérimental pour le développement d’aliments fonctionnels antioxydants dérivés deCistanche tubuleuse.

Mots-clés: Cistanche tubuleuse; technologie de traitement des morceaux de décoction ; l'actéoside; l'échinacoside; stress antioxydant; Macrophages RAW264.7 ; Voie de signalisation p38/AKT/JNK/NF‑κB

1. Présentation

Cistanche tubuleuse(Schenk) Wight appartient à la famille des Orobanchaceae et sa tige charnue et écailleuse est la partie médicinale officielle. Cette plante médicinale du désert est largement plantée dans le sud aride du Xinjiang, en Chine. Dans la pratique traditionnelle chinoise des plantes médicinales,Cistanche tubuleusesert d'herbe tonique classique avec des fonctions thérapeutiques documentées de tonification du yang des reins, de reconstitution de l'essence du sang et de relaxation des selles. Cliniquement, il est utilisé pour soulager les douleurs, la faiblesse des lombaires et des genoux, l'infertilité causée par une insuffisance rénale et la constipation induite par la sécheresse intestinale.

Les glycosides phényléthanoïdes représentent les marqueurs bioactifs les plus critiques deCistanche tubuleuse. La Pharmacopée chinoise stipule que la teneur totale en échinacoside et en acéoside ne doit pas être inférieure à 1,50 % pour les matières médicinales qualifiées. Néanmoins, la fabrication traditionnelle actuelle deCistanche tubuleuseLes morceaux de décoction suivent encore pour la plupart d'anciens flux de travail manuels : trempage d'herbes fraîches crues, humidification approfondie, tranchage et séchage naturel ou traitement du vin à la vapeur. Ces approches conventionnelles manquent de spécifications techniques quantitatives précises. L'instabilité thermique des glycosides phényléthanoïdes entraîne fréquemment une grave dégradation des principes actifs au cours du traitement, ce qui diminue la qualité du produit final et limite une production de haute qualité à grande échelle. À l’heure actuelle, seules quelques recherches limitées combinent simultanément l’optimisation des technologies de transformation et la validation de l’activité biologique ; la plupart des études détectent simplement la teneur en constituants chimiques sans vérification fonctionnelle cellulaire, créant ainsi des lacunes pour la transformation industrielle de Google pour....

Le stress oxydatif agit comme principal déclencheur pathologique de plusieurs maladies métaboliques et inflammatoires chroniques. L’accumulation excessive d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) perturbe l’homéostasie rédox, provoquant en outre une suractivation des macrophages et une libération massive de cytokines pro-inflammatoires, formant ainsi un cercle vicieux entre oxydation et inflammation. Les recherches pharmacologiques existantes ont prouvé queCistancheLes glycosides phényléthanoïdes d'origine naturelle possèdent des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. Des expériences antérieures sur des animaux ont démontré queCistanche tubuleuseles glycosides totaux ont amélioré les lésions hépatiques chez les modèles de rongeurs atteints de sepsie en activant la signalisation antioxydante Nrf2/HO‑1. Composants lignan‑glycoside isolés deCistanche tubuleusepourrait atténuer les réponses inflammatoires provoquées par le LPS via la modulation de la voie PI3K/AKT dans les macrophages RAW264.7. Cependant, la question de savoir si les morceaux de décoction fabriqués dans des conditions de traitement nouvellement optimisées conservent une puissante bioactivité anti-oxydante sous l’effet du stress n’a pas été systématiquement évalué. Le mécanisme concret de régulation moléculaire nécessite encore une exploration plus approfondie.

Le macrophage RAW264.7 stimulé par le LPS est un modèle de dommages inflammatoires et oxydatifs in vitro bien accepté, largement adopté pour évaluer les effets antioxydants et anti-inflammatoires des produits naturels. Dans cette étude, nous effectuons d’abord un criblage à un seul facteur, suivi d’une optimisation de la surface de réponse de Box‑Behnken pour obtenir des paramètres techniques standardisés de tranchage, de cuisson à la vapeur et de séchage ciblant des rendements élevés en actéoside et en échinacoside. Après avoir obtenu des produits de décoction optimisés, nous préparons des extraits de plantes et adoptons le modèle de lésion cellulaire RAW264.7 induit par le LPS. Plusieurs plates-formes expérimentales, notamment la mesure des marqueurs biochimiques du stress oxydatif, la quantification ELISA des cytokines et l'analyse de la voie Western-blot, sont utilisées pour clarifier l'efficacité du stress oxydatif et le mécanisme de transduction du signal. Cette recherche fournit des paramètres de processus pratiques pour la production à l'échelle pilote de produits de haute qualité.Cistanche tubuleusemorceaux de décoction ayant une activité anti-stress oxydative stable, et jette les bases expérimentales du développement ultérieur d'aliments fonctionnels et de compléments alimentaires provenant du XinjiangCistanche tubuleuseressources.

2. Matériels et méthodes

2.1 Matières premières, réactifs et instruments

FraisCistanche tubuleusedes tiges charnues ont été récoltées en automne à Hotan, dans la région autonome ouïghoure du Xinjiang, en Chine. La lignée cellulaire de leucémie monocytes-macrophages de souris RAW264.7 a été achetée auprès de Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Chine). L'acétonitrile et le méthanol de qualité chromatographique ont été fournis par Merck (Allemagne). Les substances étalons de référence, l'échinacoside et l'actéoside (pureté supérieure ou égale à 98 %), ont été obtenues auprès de l'Institut de recherche technologique en métrologie North Weiye de Pékin. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) a été acheté auprès de Sigma‑VETEC (USA). Le milieu DMEM à haute teneur en glucose et le kit de dosage des protéines totales BCA étaient des produits de Thermo Fisher Scientific (USA). Le sérum bovin fœtal (FBS) a été acheté auprès de BI (Israël). La solution de double anticorps pénicilline‑streptomycine provenait de HyClone (États-Unis). Des kits de dosage commerciaux pour NO, MDA, SOD, CAT et GSH ont été acquis auprès de Beyotime Biotechnology (Shanghai, Chine). Kit de détection LDH et lipopolysaccharide (LPS,E. coli055: B5) ont été obtenus auprès de Solarbio (Beijing, Chine).

Les principaux instruments de laboratoire comprenaient le système de chromatographie liquide haute performance (HPLC) Shimadzu, l'évaporateur rotatif LabTech, le pulvérisateur d'herbes chinoises à grande vitesse de type oscillant, l'étuve thermostatique, l'équipement de marmite à vapeur, le lecteur de microplaques multimode BioTek SYNERGY-H1, la balance analytique électronique FA1204N, la centrifugeuse réfrigérée CF1524R, l'enceinte de biosécurité BSC-1300IIA2 et Microscope optique inversé BDS200‑PH.

2.2 Expériences de traitement à facteur unique

FraisCistanche tubuleuseles tiges charnues ont été coupées en tranches d'épaisseur différente (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Les tranches ont été cuites à la vapeur pendant des durées variées (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Ensuite, les matériaux ont été séchés sous différents gradients de température (ambiante 25 degrés, 40 degrés, 50 degrés, 60 degrés, 70 degrés, 80 degrés). Les échantillons de morceaux de décoction entièrement séchés ont été pulvérisés et tamisés à travers un tamis de 40 mailles pour une quantification ultérieure des composants HPLC.

2.3 Détermination de la teneur en actéoside et en échinacoside

Préparation de la solution d'échantillon : Peser avec précision 1,0 g de poudre pulvérisée en morceaux de décoction dans une fiole conique bouchée. Ajouter précisément 100 mL de solution de méthanol à 50 %. Effectuez un trempage de 30 minutes suivi d’une extraction par ultrasons de 40 minutes. Après refroidissement, reconstituer la perte de poids du solvant avec 50 % de méthanol, mélanger uniformément et permettre la sédimentation statique. Le surnageant a été filtré à travers une membrane microporeuse de 0,22 µm pour injection HPLC.

Préparation de la solution étalon de référence : peser avec précision la quantité appropriée de substances de référence actéoside et échinacoside, dissoudre avec 50 % de méthanol dans des fioles jaugées, préparer des solutions étalons à gradient en série, filtrer avec une membrane filtrante de 0,22 μm.

Montage chromatographique : colonne analytique COSMOSIL C₁₈ ; système à phase mobile : phase mobile A : solution aqueuse d'acide phosphorique à 0,1 % ; phase mobile B : acétonitrile. La longueur d'onde de détection a été fixée à 330 nm ; température de la colonne 35 degrés ; débit 1 mL/min. Une méthode standard externe a été appliquée pour le calcul quantitatif de la teneur en actéoside et en échinacoside. Score d'évaluation complet=(teneur en échinacoside × 50 %) + (teneur en actéoside × 50 %). Des scores complets ont servi d'indicateur composite d'évaluation de la performance des conditions de traitement.

2.4 Plan expérimental de surface de réponse Box‑Behnken

Sur la base des résultats expérimentaux à un seul facteur, le logiciel Design‑Expert 13.0 a été utilisé pour mettre en œuvre un dispositif expérimental à trois niveaux à trois facteurs de Box‑Behnken. L'épaisseur de la tranche (X₁, cm), la durée du traitement à la vapeur (X₂, min), la température de séchage (X₃, degré) ont été sélectionnées comme variables indépendantes. La teneur en actéoside (Y₁, %) et la teneur en échinacoside (Y₂, %) étaient des valeurs de réponse. Dix-sept groupes d'expériences ont été menés. Le niveau zéro pour chaque facteur a été sélectionné en fonction du paramètre optimal acquis lors de tests à un seul facteur. Après avoir terminé les essais de surface de réponse, l'analyse de la variance du modèle, le tracé de la surface de réponse en 3D et la prévision des conditions ont été réalisés. Des expériences de vérification pratique ont été réalisées après ajustement des paramètres théoriques prévus aux valeurs de production réelles exploitables.

2.5 Culture cellulaire et préparation des échantillons

La matière première des morceaux de décoction a été fabriquée dans des conditions de traitement optimisées. La poudre d'herbes a été extraite selon le protocole de préparation d'échantillons mentionné ci-dessus, concentrée par évaporation rotative et séchée sous vide pour obtenir une poudre d'extrait solide. La solution mère a été préparée en dissolvant la poudre d'extrait dans du DMSO, puis diluée avec du milieu DMEM complet (contenant 10 % de FBS et 1 % de pénicilline-streptomycine) pour les expériences cellulaires ; La concentration finale de travail en DMSO a été contrôlée en dessous de 0,1 % (v/v). Les macrophages RAW264.7 ont été cultivés dans un milieu complet DMEM dans un environnement d'incubateur humidifié à 37 degrés et 5 % de CO₂.

2.6 Test de cytotoxicité du MTT

Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées sur des microplaques à 96 puits à une densité cellulaire de 8 × 10⁴ cellules/mL. Les groupes expérimentaux comprenaient le groupe témoin avec solvant (milieu DMSO à 0,1 %), le groupe modèle LPS (concentration finale en LPS 1 ug/mL) et plusieursCistanche tubuleusegroupes de concentration d’extrait (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Après 2 heures de pré-incubation avec un échantillon d'herbes, du LPS (concentration finale de 1 ug/mL) a été ajouté à chaque groupe, à l'exception du groupe témoin avec solvant. L'incubation s'est poursuivie pendant 24 h. Ensuite, le réactif MTT (5 mg/mL) a été ajouté et incubé pendant 4 h. Jeter le surnageant, ajouter 150 μL de DMSO par puits, agiter à 37 degrés pendant 15 min. La valeur d'absorbance à une longueur d'onde de 490 nm a été lue sur un lecteur de microplaques et le taux de survie cellulaire a été calculé. Une plage de concentrations de travail sûre a été déterminée pour les tests fonctionnels de suivi.

2.7 Mesure des ROS intracellulaires

Les macrophages RAW264.7 ont été inoculés sur des plaques à six puits à une densité de 4 × 10⁵ cellules par puits. Après l'adhésion cellulaire, un traitement de regroupement a été effectué : groupe témoin solvant, groupe modèle LPS et groupes de traitement par extrait CT (12,5, 25, 50, 100 ug/mL). Après 2 heures de prétraitement avec l'échantillon, 1 ug/mL de LPS a été ajouté, sauf pour le groupe témoin avec solvant, incuber 24 h. Le niveau de ROS intracellulaire a été détecté à l'aide de la méthode de chargement de sonde fluorescente conformément aux instructions du kit. L'intensité fluorescente a été mesurée avec un lecteur de microplaques à fluorescence (excitation 488 nm, émission 525 nm).

2.8 Détection de NO, MDA, SOD, CAT, LDH et GSH

Après le traitement cellulaire correspondant, le surnageant de culture cellulaire a été collecté pour la mesure du NO en adoptant la réaction de Griess. Les cellules attachées ont été lavées avec du PBS pré-refroidi, lysées sur de la glace, le surnageant du lysat cellulaire a été récolté après centrifugation (10 000 tr/min, 4 degrés, 5 min). Le kit BCA a déterminé la concentration en protéines totales de chaque échantillon. Le contenu des indicateurs MDA, GSH et d'activité enzymatique SOD, CAT, LDH a été analysé en suivant strictement les manuels opérationnels du kit.

2.9 Détermination ELISA des cytokines pro-inflammatoires

Les cellules RAW264.7 ont reçu un prétraitement de l'échantillon et une stimulation par le LPS pendant 16 h au total. Le surnageant de culture cellulaire a été collecté et centrifugé. Les concentrations de TNF-, IL-1, IL-6 dans le surnageant ont été quantifiées par des kits ELISA commerciaux.

2.10 Analyse par Western‑Blot

Après 45 minutes de LPS et de co-incubation d'échantillons, les cellules RAW264.7 ont été lysées à l'aide d'un tampon de lyse RIPA complété par un cocktail d'inhibiteurs de protéase-phosphatase. Le lysat cellulaire a été centrifugé à 10 000 tr/min à moins de 4 degrés pendant 5 min. Le kit BCA quantifie la concentration totale en protéines. Les échantillons de protéines (50 µg par piste) ont été dénaturés dans un bain métallique à 100 degrés pendant 5 min. L'électrophorèse sur gel SDS‑PAGE a séparé les protéines cibles, qui ont ensuite été transférées sur des membranes PVDF. Les membranes ont été bloquées pendant 1 h avec une solution de TBST à 5 % de lait écrémé. Les anticorps primaires ciblant p38, p‑p38, AKT, p‑AKT, JNK, p‑JNK, NF‑κB p65, p‑NF‑κB p65 et GAPDH ont été incubés pendant la nuit à 4 degrés. Après lavage au TBST, les anticorps secondaires correspondants ont été incubés à température ambiante pendant 1 h. Après des lavages répétés, le réactif chimioluminescent ultrasensible ECL a été appliqué pour l’imagerie des bandes protéiques. Une analyse quantitative en échelle de gris en bande a été mise en œuvre pour évaluer le niveau d'expression relatif des protéines de phosphorylation.

2.11 Analyse statistique

Le logiciel GraphPad Prism 8.0.2 a été utilisé pour le calcul statistique et le traçage graphique. Les résultats des données expérimentales quantitatives ont été exprimés en moyenne ± écart type (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Une ANOVA unidirectionnelle suivie de tests de comparaisons multiples post-hoc a été appliquée pour la comparaison intergroupe. \\(P<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Résultats expérimentaux

3.1 Résultats des expériences à facteur unique

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) a empêché la libération de substances internes, réduisant ainsi la teneur finale en composants détectables. Sous un temps de cuisson à la vapeur fixe (10 minutes) et une température de séchage (60 degrés), une épaisseur de tranche de 0,4 cm a obtenu le score d'évaluation globale le plus élevé.

Résultats de la durée du traitement à la vapeur : lorsque l'épaisseur des tranches était fixée à 0,4 cm et la température de séchage maintenue à 60 degrés, un temps de cuisson à la vapeur insuffisant ne pouvait pas détruire suffisamment la structure des cellules végétales, de sorte que les composés actifs étaient difficiles à dissoudre. Une fois que le temps de cuisson à la vapeur dépassait 6 minutes, une cuisson excessive à la vapeur endommageait les tissus végétaux et induisait une dégradation de l'échinacoside et de l'actéoside. Par conséquent, une durée de 6 minutes a été préalablement identifiée comme étant la durée préférable du traitement à la vapeur.

Pour les expériences de gradient de température de séchage au four : une épaisseur de tranche de 0,4 cm et un temps de cuisson à la vapeur de 6 minutes ont été fixés. La teneur en composants augmente avec l'augmentation de la température de séchage dans une certaine plage. Une fois que la température de séchage dépassait 60 degrés, la décomposition thermique à haute température provoquait une diminution notable de la teneur en substance cible. Par conséquent, 60 degrés ont été choisis comme condition initiale optimale de température de séchage pour une optimisation ultérieure de la surface de réponse.

3.2 Optimisation et vérification de la surface de réponse Box‑Behnken

Dix-sept groupes d'essais expérimentaux Box‑Behnken ont été terminés conformément à la matrice de conception. Les résultats de l’analyse de variance ont indiqué que les modèles de régression pour la teneur en acéoside et en échinacoside ont atteint une signification statistique (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >épaisseur de tranche.

Grâce à un modèle de calcul mathématique, les paramètres théoriques optimaux de traitement étaient : épaisseur de tranche 0,600 cm, temps de traitement à la vapeur 5,685 min, température de séchage 57,009 degrés. Compte tenu de la faisabilité réelle de l'exploitation industrielle, les paramètres ont été ajustés pour une épaisseur de tranche de 0,6 cm, un temps de cuisson à la vapeur de 6 minutes et une température de séchage de 57 degrés. Trois expériences de validation parallèles ont été réalisées. Dans ces conditions pratiques, la teneur en acéoside mesurée était de 7,25 %, la teneur en échinacoside atteignait 31,62 %. L'écart entre les valeurs mesurées et la prédiction théorique est resté inférieur à 5 %, prouvant que ce modèle de surface de réponse était fiable et applicable pour guider la production de morceaux de décoction dans le monde réel.

3.3 Dépistage de la cytotoxicité des produits optimisésCistanche tubuleuseExtraire dans des cellules RAW264.7

Les résultats de cytotoxicité du MTT ont révélé qu'une concentration d'extrait comprise entre 0 et 100 ug/mL n'exerçait aucun effet toxique évident sur les macrophages RAW264.7 et présentait même une légère tendance favorisant la prolifération cellulaire. Lorsque la concentration du traitement a grimpé jusqu'à 200 ug/mL et 400 ug/mL, le taux de survie cellulaire a diminué de manière significative par rapport au groupe témoin avec solvant, montrant une cytotoxicité dépendante de la concentration. Par conséquent, des gradients de concentration de 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL ont été sélectionnés comme concentrations de travail sûres pour les tests cellulaires ultérieurs liés au stress oxydatif et à l’inflammation.

3.4 Cistanche tubuleuseExtraire le niveau de ROS intracellulaire réduit dans les macrophages stimulés par le LPS

Par rapport au groupe témoin avec solvant, l’intensité fluorescente intracellulaire des ROS du groupe modèle LPS a augmenté de manière extrêmement significative (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubuleuseextrait, l’accumulation intracellulaire de ROS a diminué de manière dose-dépendante. Chaque groupe de traitement médicamenteux a présenté une réduction statistiquement significative des ROS par rapport au groupe modèle LPS (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Effets sur la teneur en NO et MDA

Le NO sert de médiateur inflammatoire classique libéré par les macrophages activés. Le MDA est un biomarqueur de référence reflétant les lésions oxydatives liées à la peroxydation lipidique. En comparaison avec le groupe témoin avec solvant, la stimulation par le LPS augmentait nettement la teneur en NO et en MDA dans les cellules RAW264.7 (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubuleusele traitement de l'extrait pourrait réduire considérablement la concentration de NO. Pour l'indicateur MDA : le groupe 12,5 ug/mL n'a pas produit d'amélioration statistiquement significative ; Les groupes de concentration de 25 à 100 ug/mL ont observé une diminution du taux de MDA (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Impacts sur les indicateurs biochimiques liés aux antioxydants SOD, CAT, LDH, GSH

Après la provocation par le LPS, l'activité enzymatique intracellulaire de la SOD, de la CAT, de la LDH ainsi que la teneur en GSH ont fortement chuté par rapport au groupe témoin au solvant (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubuleusedes extraits de morceaux de décoction pourraient restaurer la capacité de défense antioxydante endogène cellulaire contre les agressions oxydatives induites par le LPS.

3.7 Effet inhibiteur sur la libération des cytokines pro-inflammatoires TNF-, IL-1 et IL-6

Les résultats de détection ELISA ont montré que la stimulation du LPS favorisait fortement la sécrétion de TNF‑, IL‑1, IL‑6 à partir des macrophages RAW264.7 (\\(P<0.001\)). With the increase of Cistanche tubuleuseÀ la concentration du traitement d'extrait, la quantité libérée de ces trois cytokines pro-inflammatoires clés a été progressivement supprimée, présentant une corrélation dose-réponse claire. Elle a confirmé que l'extrait de plante exerçait une puissante fonction anti-inflammatoire en limitant la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires par les macrophages activés.

3.8 Règlement sur la phosphorylation des voies de signalisation p38/AKT/JNK/NF‑κB

Les données expérimentales de Western-blot ont montré que les ratios p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK et p-NF-κB/NF-κB étaient significativement élevés dans le groupe modèle LPS par rapport au groupe témoin solvant (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubuleusel’intervention d’extraction a remarquablement diminué le rapport p‑p38/p38 et p‑JNK/JNK (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubuleuseL'extrait de décoction a soulagé les lésions inflammatoires oxydatives en supprimant l'activation de l'hyperphosphorylation du réseau de signalisation p38/AKT/JNK/NF-κB.

4. Discussion

Exigences de traitement traditionnelles enregistrées dans la pharmacopée chinoise pourCistanche tubuleusecomprennent principalement l'élimination des impuretés, le lavage, l'humidification, le tranchage et le séchage, sans spécifier de paramètres numériques précis pour l'épaisseur des tranches, la durée de cuisson à la vapeur et la température de séchage. Le traitement manuel non standard entraîne de grandes fluctuations de la qualité des produits commerciaux en décoction. Les glycosides phényléthanoïdes (échinacoside et actéoside) sont des composés bioactifs thermiquement labiles. Un temps de chauffage ou une température inappropriés déclencheront une décomposition chimique et réduiront la valeur médicinale. Nos expériences à facteur unique ont révélé qu'une cuisson à la vapeur insuffisante et excessive ainsi qu'une température de séchage trop élevée entraîneraient une perte des composants glycosides cibles. Une optimisation multifactorielle supplémentaire de Box‑Behnken a permis d'obtenir des paramètres de fabrication pratiques : épaisseur de tranche 0,6 cm, cuisson à la vapeur 6 min, séchage 57 degrés. Dans ces conditions, la teneur en actéoside et en échinacoside a atteint 7,25 % et 31,62 %, dépassant largement le seuil de qualité minimum de la pharmacopée. Ce protocole optimisé fournit des références techniques quantitatives réalisables pour le traitement industriel standardisé des produits originaires du Xinjiang.Cistanche tubuleuse.

Le stress oxydatif et l’inflammation sont des processus pathologiques étroitement liés. Un excès de ROS induit une peroxydation lipidique et génère du MDA, qui active davantage les macrophages immunitaires innés. Les macrophages activés sécrètent du NO en abondance et de multiples cytokines pro-inflammatoires, qui à l'inverse amplifient la production intracellulaire de ROS, formant ainsi un cercle vicieux oxydatif-inflammatoire auto-amplifié. Les substances antioxydantes naturelles d’origine végétale peuvent briser cette boucle pathologique en élevant le système enzymatique antioxydant endogène et en limitant la transduction du signal inflammatoire. Dans cette étude in vitro, traité de manière optimaleCistanche tubuleuseLes extraits de morceaux de décoction ont réduit les niveaux de ROS, NO et MDA, tout en améliorant les activités SOD, CAT, LDH et la teneur en GSH dans les macrophages RAW264.7 stimulés par le LPS. Simultanément, il a inhibé la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires de TNF-, IL-1, IL-6, démontrant ainsi une capacité anti-oxydante et anti-inflammatoire intégrée.

Les molécules de la famille des protéines kinases activées par les mitogènes p38, JNK, ainsi que l'AKT et le NF-κB, composent le centre central de transduction du signal médiateur des réponses inflammatoires-oxydatives des macrophages. Lors de la stimulation du LPS, le signal en amont déclenche l'activation de la phosphorylation de p38, JNK et AKT, ce qui favorise séquentiellement la phosphorylation de la sous-unité NF-κB p65 et la translocation nucléaire. Le NF‑κB activé agit comme facteur de transcription et initie la transcription de grands lots de cytokines pro-inflammatoires et de gènes liés au stress oxydatif. Nos résultats de Western‑blot ont démontré queCistanche tubuleusel'extrait pourrait supprimer la phosphorylation de p38, JNK, AKT et NF‑κB p65. Par conséquent, nous déduisons que sa bioactivité anti-oxydante et anti-inflammatoire est obtenue, au moins partiellement, en bloquant la suractivation de l'axe de signalisation p38/AKT/JNK/NF-κB.

Il existe plusieurs limites dans les recherches actuelles. Toutes les vérifications fonctionnelles sont limitées au niveau de la culture cellulaire in vitro. D’autres expériences in vivo sur des modèles animaux sont nécessaires pour vérifier les performances pharmacodynamiques in vivo des morceaux de décoction optimisés. De plus, cette étude a adopté un extrait mixte total de morceaux de décoction, de sorte que nous ne pouvons pas distinguer la contribution individuelle de l'échinacoside, de l'actéoside et d'autres métabolites secondaires mineurs. Des recherches de suivi peuvent isoler des composés monomères pour comparer leur puissance anti-oxydante respective et mener une enquête sur les effets de compatibilité. Malgré cela, nos travaux actuels fournissent toujours des paramètres pratiques de technologie de traitement et des preuves mécanistiques préliminaires pour le développementCistanche tubuleuse‑produits de santé liés.

5. Conclusion

En conclusion, le flux de travail de traitement modernisé optimisé par la méthodologie de surface de réponse Box-Behnken (épaisseur de tranche 0,6 cm, cuisson à la vapeur 6 min, température de séchage 57 degrés) peut augmenter considérablement la teneur en actéoside et en échinacoside deCistanche tubuleusemorceaux de décoction. Les extraits préparés à partir de ces tranches de plantes traitées de manière optimale exercent des effets anti-oxydants et anti-inflammatoires importants contre les dommages causés par les macrophages RAW264.7 induits par le LPS. Le mécanisme sous-jacent est corrélé à la restauration du système de défense antioxydant intracellulaire et à l'inhibition de l'activation excessive de la voie de signalisation inflammatoire p38/AKT/JNK/NF-κB. Cette étude fournit une base expérimentale solide pour une production industrielle standardisée et une exploitation des aliments fonctionnels.Cistanche tubuleuseressources.

Références

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