Surmonter le déficit immunitaire grâce à l'allorooming

Résumé simple :

Nous avons étudié si deux espèces de termites étroitement apparentées diffèrent par leur dépendance à l'égard de l'immunité sociale ou individuelle contre deux espèces de champignons pathogènes, qui ont toutes été collectées au même endroit. Nos résultats indiquent que le toilettage mutuel (allogrooming) est très efficace pour limiter les infections mortelles dans la mesure où il peut compenser des défenses immunitaires individuelles relativement faibles. Après avoir rencontré des agents pathogènes, les termites utilisent une stratégie alternative pour se distancer socialement et limiter la propagation des maladies contagieuses et se rassemblent pour se nettoyer les uns les autres. La variation de l'intensité de cette réponse comportementale indique une réponse nuancée au niveau de menace.

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Abstrait:

L'allorooming semble être essentiel chez de nombreux animaux sociaux pour se protéger d'une exposition systématique aux parasites. Chez les insectes sociaux, il semble essentiel d’éliminer les propagules pathogènes de la cuticule avant qu’elles ne puissent démarrer un cycle infectieux. Pour les termites souterrains, cela inclut les spores fongiques couramment rencontrées dans le sol, telles que les conidies Metarhizium, qui peuvent rapidement germer et pénétrer dans la cuticule. Nous avons étudié s'il existait une différence dans le recours à l'immunité sociale et innée chez deux termites souterrains étroitement apparentés pour se protéger contre les infections mortelles causées par deux espèces de Metarhizium rencontrées localement. Nos résultats indiquent qu'une immunité innée relativement faible chez une espèce de termite est compensée par un allogrooming plus soutenu. Cela comprend un allogrooming amélioré en réponse à des concentrations de conidies qui reflètent une contamination plus courante de la cuticule ainsi qu'à une forte contamination cuticulaire qui suscite une réponse d'urgence en réseau.

Mots clés:

immunité sociale; l'immunité innée; les entomopathogènes ; comportement d'alarme ; terminus

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1. Présentation

Les mécanismes sociaux de défense peuvent être très efficaces pour contrecarrer la susceptibilité aux maladies contagieuses malgré une sociabilité favorisant sa propagation [1,2]. Chez les termites et les fourmis, l’évolution de mécanismes sociaux efficaces de défense immunitaire semble avoir relâché la pression sélective sur les mécanismes immunitaires innés individuels [3–6]. Une fois les agents pathogènes rencontrés, la menace de maladie chez les insectes sociaux dépendra de l’efficacité des défenses innées de première ligne, qui comprennent des barrières physiques contre l’infection. De nombreux agents pathogènes fongiques produisent des spores asexuées (conidies) qui peuvent pénétrer directement dans la cuticule de l'insecte. Les défenses immunitaires sociales qui aident à protéger la cuticule, y compris l'allorooming et les antifongiques sécrétés, semblent être particulièrement importantes chez les termites pour se défendre contre Metarhizium spp [7-9]. Les conidies de Metarhizium sont omniprésentes dans le sol dans lequel de nombreux termites se déplacent en quête de nourriture et atteignent des concentrations qui maintiennent une menace constante d'infection [10]. Les termites en quête de nourriture, tels que les espèces du genre Reticulitermes, se déplacent dans le sol pour étendre l'aire de répartition de leurs colonies et accéder à de multiples sites d'alimentation, qui sont généralement des ressources ligneuses reposant à la surface du sol [11]. Les réseaux souterrains de leurs colonies peuvent s'étendre sur des dizaines de mètres, contenir plus de cent mille individus et atteindre des densités de plus d'une centaine de colonies par hectare [12]. Ils ont évolué à partir d'un ancêtre dont les colonies étaient limitées à un seul morceau de bois [13,14]. Cette transition aurait entraîné une augmentation des rencontres avec des prédateurs, des agents pathogènes et des concurrents et aurait coïncidé avec l'évolution d'une véritable caste d'ouvriers dévoués qui renonce généralement à la reproduction directe. L’amélioration de l’hygiène a probablement été essentielle à cette transition, aux radiations qui en ont résulté et au succès écologique actuel des termites, dont la contribution à la pourriture du bois peut dépasser la décomposition microbienne [15,16] et qui semblent sur le point de se développer rapidement à l’échelle mondiale à mesure que les températures augmentent [17]. . Lors de la transition vers la recherche de nourriture, un relâchement de la pression sélective sur les gènes de l'immunité innée a coïncidé avec son intensification sur deux gènes producteurs de protéines antifongiques sécrétées [6]. Ces protéines semblent essentielles à l’élimination des conidies fongiques lors de l’allorooming. La pression sélective contrastée sur les composants des mécanismes de défense individuels innés et sociaux dans le passé suggère qu'il continue d'y avoir un compromis adaptatif dans la dépendance des termites à l'égard de l'immunité individuelle innée et sociale pour se protéger contre les maladies fongiques. Ceci est étayé par l'observation selon laquelle l'expression des gènes de l'immunité innée est plus faible dans les groupes que dans les individus de travailleurs de Reticulitermes qui ont été exposés aux conidies de Metarhizium (18). L'allorooming réduit le besoin d'activer le système immunitaire interne. Dans cette étude, nous avons étudié les différences d’immunité sociale et innée entre deux espèces de termites souterrains et deux espèces locales de Metarhizium qui se rencontrent naturellement. Les espèces de Metarhizium ont été isolées du sol sous ou à côté de bûches dans lesquelles des termites ont été collectées. Les deux espèces de termites, Reticulitermes virginicus et Reticulitermes flavipes, ont été collectées au même endroit dans le Maryland. Bien qu’ils semblent agonistes, on les trouve souvent en train de se nourrir les uns à côté des autres ou même occasionnellement dans le même journal. Les agressions interspécifiques entre travailleurs entraînent fréquemment des blessures mortelles dans les tests d'agonisme sur boîte de Pétri [19]. L'activité antifongique des lavages cuticulaires des ouvrières de R. virginicus s'est déjà avérée plus efficace pour inactiver les conidies de Metarhizium que les lavages des ouvrières de R. flavipes (20). Cela suggère que, bien que ces deux termites soient étroitement liés et rencontrent les mêmes agents pathogènes, ils peuvent différer dans leur dépendance à l’égard de l’immunité individuelle innée ou sociale. Nous avons utilisé une approche comparative pour déterminer s'il existe une différence entre le recours à l'immunité sociale et innée et son intégration et s'il existe un compromis potentiel entre les deux. Une immunité sociale renforcée peut être associée à des mécanismes immunitaires innés moins efficaces, qui peuvent inclure la puissance des antifongiques sécrétés, et vice versa. Une immunité individuelle plus faible peut être compensée par une immunité sociale plus efficace. La survie des termites de dernier stade larvaire en groupes de douze, en paires ou en singletons a été étudiée après qu'ils aient été confrontés à des champignons de Metarhizium robertsii ou de Metarhizium brunneum. Des groupes de 12 travailleurs ont été brièvement exposés à une dose élevée du champignon. Cette concentration potentiellement mortelle provoque des réponses comportementales similaires à celles observées lorsque les termites rencontrent un cadavre sporulant, provoquant dans certains cas une augmentation substantielle de la réponse d'alarme qui se traduit par des mouvements oscillatoires longitudinaux rapides, LOM (21-23). La fréquence des LOM au cours des 12 premières minutes suivant l'exposition des termites à des conidies de différentes souches et espèces de Metarhizium est positivement corrélée à la fréquence des épisodes d'allorooming. Les LOM, qui sont plus faciles à mesurer que l’allorooming, peuvent donc être utilisés comme mesure indirecte des niveaux d’allorooming. La détection du champignon semble être retardée jusqu'à ce que les surfaces des termites soient contaminées par des conidies, ce qui suggère que les récepteurs de reconnaissance associés aux pièces buccales sont essentiels à l'apparition d'une alarme élevée et d'un allogrooming. Les couples et les célibataires ont été exposés à une faible dose du champignon, ce qui reflète probablement les niveaux d'exposition auxquels les termites sont confrontés lorsqu'ils construisent des galeries dans le sol, contrairement aux rencontres directes avec des cadavres en sporulation. Contrairement aux termites isolés, les paires de termites sont presque totalement résistantes aux infections mortelles à cette dose pendant 10 jours. Pour distinguer l'immunité sociale et innée à cette faible dose, des paires de termites ont été séparées à différents moments peu de temps après des défis avec des conidies fongiques, et la survie de ces paires a été comparée à celle de célibataires qui n'avaient aucune possibilité d'interactions sociales après des défis fongiques. L'allorooming et les LOM ont été observés avant les moments de séparation des paires de termites. De plus, l’activité antifongique d’extraits bruts de termites entiers a été testée afin d’évaluer plus en détail les différences d’immunité innée entre les deux espèces de termites en réponse aux deux espèces de champignons.

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2. Méthodes

2.1. Organismes d'étude

Les termites R. flavipes et R. virginicus, ainsi que les champignons M. brunneum et M. Roberts, ont été collectés dans une forêt de feuillus de croissance secondaire du comté de Baltimore (Pleasant Hills et Monkton), dans le Maryland. Les espèces de termites ont été identifiées à l'aide de tests d'agonisme intra- et interspécifiques [19] et de séquences d'ARNr mitochondriaux [4]. Les espèces de Metarhizium ont été isolées d'échantillons de sol à proximité de sites de collecte de termites (<30 cm) using a baiting technique with Tenebrio molitor larvae [24]. The conidia and mycelia of two clonal lines of the species were used for DNA purification with a QIAGEN DNeasy Blood and Tissue kit. The 50 regions of translation elongation factor 1-alpha were PCR-amplified using PCR primers EF1T and EF2T [25]. These regions were Sanger-sequenced (Psomagen, Rockville, MD) for species identification. Foraging groups of R. flavipes and R. virginicus (>1000) et le bois dans lequel ils se nourrissaient ont été collectés et stockés dans des conteneurs en plastique dans des conditions sombres et humides à 25 ◦C. Les termites appartenant à la même espèce ont été collectés sur des sites séparés d'au moins 60 m, ce qui est généralement suffisant pour garantir que les collectes proviennent de colonies différentes [12]. Ces collections séparées sont appelées ci-dessous colonies. Des termites ont été collectés au cours de l'été 2018 et 2019 pour les expériences avec des groupes de 12 ainsi que des expériences in vitro avec des extraits bruts de termites, et en 2021 et 2022 pour les expériences avec des paires et des singletons. Les termites ont été utilisés dans leurs expériences respectives dans les 4 mois suivant leur collecte. Les ouvriers ont été délicatement retirés des morceaux de bois et maintenus dans des groupes de boîtes de Pétri de 12 55 mm de diamètre recouvertes de papier filtre humide (Whatman 1) pendant 24 h à la lumière ambiante avant d'être utilisées pour nos expériences. Cela leur a permis de s’acclimater à la lumière et de nettoyer leurs surfaces cuticulaires des débris particulaires avant les expositions fongiques. Nous n'avons pas inclus les soldats car ils ne toilettent pas leurs camarades de nidification, représentent 1 à 2 % de la colonie et ne sont pas systématiquement trouvés dans les groupes en quête de nourriture.

2.2. Survie et réponse aux alarmes pour les groupes de douze

Des groupes de 12 travailleurs de R. flavipes ou de R. virginicus ont été exposés à une dose élevée de 10 6 conidies mL−1 de 0.05 % Tween 80 (MilliporeSigma , Burlington, MA, USA) ou 0,05% Tween 80 pour les contrôles. Du Tween 80 a été inclus pour aider à briser les amas de conidies lors de la préparation des suspensions. La veille de ces traitements, les 12 termites ont été marqués d'un petit point de peinture émail colorée sur la face dorsale de leur abdomen afin de pouvoir être identifiés individuellement. L'allogrooming a effectivement enlevé la peinture de quelques individus, mais ces individus pouvaient toujours être identifiés individuellement au moment de leur décès en examinant les survivants et par la variation individuelle naturelle des travailleurs, comme le degré de coloration sombre de l'abdomen. Les termites utilisés pour chaque répétition de 12 termites testés et témoins provenaient de colonies différentes. Cinq colonies ont été utilisées pour R. flavipes et R. virginicus (n=480 ouvrières). Les expériences avec les colonies de M. Roberts ont été répétées après trois mois pour tester la cohérence de la survie. Au total, il y avait 60 répétitions de 12 ou 11 termites (n=709). Dans 11 répétitions, un termite est mort avant l'exposition fongique, ce qui semble être dû à la manipulation lors du marquage par la peinture. Les termites ont été exposés à des conidies préparées à partir d'une culture clonale de M. Roberts ou de M. brunneum. Les travailleurs ont été ajoutés à des tubes de 1,5 mL contenant 500 µL de dilutions de conidies, ou 0,05 % de Tween 80 pour les contrôles, avec un petit entonnoir en plastique et doucement agités pendant 10 s pour assurer une immersion complète. Les travailleurs ont ensuite été déposés sur du papier filtre pour absorber l'excès de liquide, transférés dans des boîtes de Pétri de 55 mm de diamètre recouvertes de papier filtre humidifié (Whatman 1) et enregistrés sur vidéo pendant 12 minutes. La mortalité a été surveillée quotidiennement pendant deux semaines. Les individus morts ont été retirés, stérilisés en surface avec de l'éthanol à 70 % et placés sur du papier filtre humide dans des boîtes de Pétri (55 mm) maintenues à 24 °C et à 100 % d'humidité pour confirmer l'infection par Metarhizium (croissance de muscardine verte après 3 à 4 jours). Le nombre total de LOM observés dans les vidéos sur 12 minutes a été noté pour chaque termite. Les LOM duraient entre 2 et 7 s et devaient s'arrêter puis reprendre pour être notés en tant qu'événements distincts (23).

2.3. Survie et allogrooming pour les couples et les célibataires

La survie des paires de termites a été comparée à celle des individus uniques après exposition à une faible dose (104 conidies mL−1 ) de conidies qui n'a pas provoqué de mortalité excessive et reflète probablement les concentrations rencontrées par les termites lorsqu'ils se déplacent dans le sol [10] . Les couples et les célibataires ont été comparés pour mesurer la survie offerte par les mécanismes sociaux de défense. Des groupes de 12 travailleurs ont été initialement testés avec ou sans champignons comme décrit ci-dessus, sauf que des suspensions de conidies d'environ 107 conidies mL−1 ont été préparées dans 0,1 % de Tween 80 et vigoureusement vortexées avant d'être diluées avec de l'eau stérile à 104 conidies mL−1. Le Tween 80 n'a pas été inclus dans les dilutions car les suspensions de conidies individuelles pouvaient être maintenues à de faibles concentrations et parce que le tensioactif peut interférer avec l'adhésion des conidies à la cuticule. Ces individus n’étaient pas marqués à la peinture. Immédiatement après les traitements et avant que les termites n'aient eu l'occasion d'interagir, ils ont été divisés en paires ou en singletons dans les puits de plaques de culture cellulaire en plastique 24- (CELLTREAT Scientific, Pepperell, MA). Chaque puits était recouvert de papier filtre humidifié (Whatman 1). Pour chaque combinaison termite/fongique (n=4), quatre paires de termites ont été séparées en singletons après 15 min, 2 h, 5,5 h, 8 h et 27 h (n=160), et pour chaque combinaison termite/fongique 12 termites qui n'ont jamais eu l'occasion d'interagir ont été séparés en singletons traités contre les champignons ou témoins (n = 96). Ces termites individuels ont également été divisés en 24- plaques à puits recouvertes de papier filtre. La mortalité des termites a ensuite été surveillée pendant dix jours et les individus morts ont été retirés pour confirmation de l'infection par Metarhizium. Une seule colonie a été utilisée pour R. flavipes traité avec M. robertsii ou M. brunneum et R. virginicus traité avec M. robertsii ou M. brunneum (n=256). Six paires non traitées ont également été maintenues dans des plaques à puits 24- pendant 10 jours pour chaque espèce. Une expérience distincte avec les mêmes colonies s'est concentrée sur l'enregistrement de l'allorooming avant les temps de séparation des paires à 15 min, 2 h, 5,5 h, 8 h et 27 h. Six paires différentes de chaque espèce de termite ont été traitées avec chaque champignon ou eau à titre de contrôle et notées pour l'allorooming pendant 15 minutes avant les moments de séparation (n=180). Les événements d'allorooming ont été notés lorsque le contact bouche-à-corps entre deux termites impliquait le mouvement des pièces buccales (palpes), et la durée de chaque événement d'allorooming ininterrompu a été enregistrée. L'allorooming a été noté par un seul observateur qui ne savait pas quel traitement les termites avaient reçu. Les LOM ont également été notés mais étaient négligeables et n'ont pas été utilisés dans l'analyse. L'auto-toilettage n'a pas été observé.

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2.4. Activité antifongique in vitro

Douze travailleurs de 5 colonies de R. flavipes ou R. virginicus ont été immobilisés à froid dans des tubes Eppendorf de 1,5 mL et 120 µL d'eau froide et stérile ont été ajoutés à chaque tube. Les ouvrières des deux espèces utilisées dans cette étude avaient à peu près la même taille (longueur 4 à 5 mm). Les termites ont été homogénéisés avec un pilon en plastique et l'extrait a été centrifugé à 16,000 g pendant 2 min. Le surnageant a été stérilisé sur filtre avec des filtres Ultrafree de 0,22 µm (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA). Dix µL du filtrat ont été incubés pendant 24 h avec dix µL contenant 100 conidies de M. robertsii ou M. brunneum et 20 µL de 100 µg mL−1 d'ampicilline pour éviter davantage la contamination bactérienne. Les contrôles comprenaient 10 µL d’eau stérile à la place de l’extrait brut. Deux répétitions de chaque mélange incubé ont été étalées sur de la gélose dextrose de pomme de terre (PDA) additionnée de 50 µg mL−1 d'ampicilline (boîtes de Pétri de 60 mm) et incubées à température ambiante dans l'obscurité pendant 4 à 5 jours. L'activité antifongique a été mesurée en comparant les unités formant colonies (UFC) dans les traitements à l'extrait brut aux témoins.

2.5. Statistiques

Les estimations de Kaplan – Meier des durées de survie moyennes ont été utilisées pour des comparaisons par paires de la survie. Les rapports de risque de décès (HR) ont été calculés à l'aide d'une analyse de régression de Cox. Nous avons utilisé la régression de Cox pour étudier les différences de mortalité entre les individus présentant ou non des LOM tout en contrôlant d'autres variables catégorielles (traitement ou contrôle fongique, espèces de champignons, espèces de termites, colonie d'origine). Les LOM ont été classés comme absents ou présents chez les individus en raison de la fréquence des valeurs aberrantes et du manque de normalité. Dans l'analyse de survie avec des paires de termites et des singletons, le HR était basé sur une comparaison entre des paires traitées avec des conidies (séparées à différents moments) et des singletons traités avec des conidies. Ces HR fournissent donc une mesure de survie offerte par les mécanismes sociaux de défense tout en contrôlant les mécanismes de défense individuels. L'association entre le temps passé en binôme et l'évolution de la FC a été mesurée à l'aide des corrélations de Pearson. La répartition des LOM entre différents traitements a été comparée à un test de Kruskal – Wallis avec corrections de Bonferroni pour des tests multiples permettant des comparaisons par paires. L'UFC moyenne ou la durée des événements d'allorooming ont été comparées à un test ANOVA avec corrections de Bonferroni pour des comparaisons par paires. Nous avons utilisé IBM SPSS Statistics (version 28) pour les tests statistiques.

3. Résultats

3.1. Survie et alarme des groupes de douze en difficulté

The Cox regression model of survivorship that included categorical variables for fungal treatment, LOMs, termite species, fungi species, and a colony of origin was significant (Chi-square = 246.29, df = 12, p < 0.001). Challenged termites were 9.28 times more likely to die than untreated termites (Wald = 143.05, p < 0.001) while controlling for the other variables. Termites that displayed LOMs (n = 422) were 1.52 times more likely to survive (Wald = 8.30, p = 0.004) than individuals that did not display LOMs (n = 286). R. virginicus workers were 2.08 times more likely to die than R. flavipes workers (Wald = 6.31, p = 0.012). Fungal species did not contribute significantly to the model (Wald = 0.841, p = 0.359). The colony of origin contributed significantly to the model (Wald = 50.16, p < 0.001), which is consistent with previously reported colony variation in Reticulitermes resistance to Metarhizium infections [24]. Survivorship did not differ between the same colony when the experiment was repeated 3 months later with workers that were exposed to M. Roberts (Breslow pairwise comparison, Chi-square = 0.342, p = 0.559). Most deaths in the challenged termites were attributable to Metarhizium infection (>90 % de confirmation). Pour les termites infectés par M. Roberts, 129 décès ont été observés parmi 237 individus, et la durée de survie moyenne de R. virginicus (9,10 jours) était significativement inférieure à celle de R. flavipes (10. 98 jours)(Breslow=10.05, df=1, p=0.002) (Figure 1). Pour les termites infectés par M. brunneum, 79 décès ont été observés parmi 120 individus, et la durée de survie moyenne de R. flavipes (9,70 jours) était inférieure à celle de R. virginicus (10,68 jours), mais de manière non significative (Breslow=2 .74, df=1, p=0.098). La distribution des LOM (Figure 2) entre les traitements fongiques et témoins était significativement différente (Kruskal – Wallis=176,897, df=5, p <0,001). La fréquence des LOM n'était pas significativement différente entre les traitements de M. brunneum et leurs témoins respectifs pour R. flavipes (p ajusté=0,097) et R. virginicus (p ajusté=1.000 ). Cependant, la fréquence des LOM était significativement plus élevée pour les traitements par M. Roberts que pour leurs témoins respectifs pour R. flavipes (p ajusté <0,001) et R. virginicus (p ajusté <0,001) (Figure 2). Pour le traitement par M. Roberts, la fréquence des LOM de R. flavipes était significativement supérieure à celle des LOM de R. virginicus (p ajusté <0,001). Cependant, pour le traitement par M. brunneum, la fréquence des LOM de R. flavipes n'était pas significativement différente de celle des LOM de R. virginicus (p ajusté=1.000). Contrairement à M. brunneum, des groupes de 12 termites confrontés à des conidies de M. Roberts ont entraîné une réponse comportementale significative.

3.2. Survie des couples et des célibataires mis au défi

La survie de paires de termites séparées à différents moments peu de temps après la provocation par un agent pathogène a été comparée à la survie de célibataires soumis à une provocation avec des rapports de risque de décès (HR). Un HR de 1 correspond à une survie égale dans les paires séparées et les singletons sur dix jours. Les valeurs inférieures à un indiquent qu'il y a une mortalité réduite dans les couples séparés par rapport aux célibataires. La corrélation entre le temps passé en binôme et la réduction de la FC n'était significative que pour R. flavipes traités soit avec M. Roberts (r=−0.978, p=0.{ {7}}04) ou M. brunneum (r=−0.983, p=0.003), et non pour R. virginicus traité avec l'un ou l'autre M. Roberts (r=−0,643, p=0.242) ou M. brunneum (r=−0,812, p=0.095). Cela se reflète également dans les valeurs R2 des régressions linéaires présentées dans la figure 3 (le temps a été transformé en log pour le calcul des corrélations de Pearson et des valeurs R2). Aucun décès n’a été observé chez les couples non traités (6 couples pour chaque espèce de termite) et un décès chez 16 couples traités (4 couples pour chaque combinaison termite/champignon) qui n’ont jamais été séparés sur 10 jours.

Figure 1. Survie pour des groupes de 12. Rf correspond à R. flavipes, Rv à R. virginicus, Mr à M. robertsii et Mb à M. brunneum. Les différences significatives de survie pour les comparaisons par paires étaient basées sur les tests de Breslow (tests de Wilcoxon généralisés). * Différence significative entre les traitements, NS pas de différence significative entre les traitements (p< 0.025 Bonferroni adjusted α). For the survivorship of pathogen-challenged single termites (Figure 4), 47 deaths were observed among 48 individuals, and the mean survival time for R. flavipes (4.21 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.17 days)(Breslow, chi-square = 33.927, df = 1, p < 0.001). This relationship held for both species of fungi: For M. robertsii exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.25 days) was significantly lower than for R. virginicus (5.83 days) (chi-square = 16.133, df = 1, p < 0.001); For M. brunneum exposure, the mean survival time for R. flavipes (4.17 days) was significantly lower than for R. virginicus (6.50 days) (chi-square = 20.994, df = 1, p < 0.001). 3.3. Antifungal Activity of Crude Extracts The two species of fungi were analyzed separately (the viability of conidia on PDA differs between the two species). For M. robertsii, mean colony-forming units (CFUs) among fungal and control treatments were significantly different (F = 18.08, df = 2, p < 0.001) (Figure 5a). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes workers showed significant antifungal activity against M. robertsii compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 1.000, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. robertsii was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes extracts against M. robertsii (adjusted p < 0.001). For M. brunneum, mean CFUs (Figure 5b) among fungal and control treatments were significantly different (F = 27.26, df = 2, p < 0.001). Crude extracts of R. virginicus but not R. flavipes showed significant antifungal activity against M. brunneum compared to the control (adjusted p < 0.001 and p = 0.072, respectively). The antifungal activity of R. virginicus extracts against M. brunneum was significantly greater than the antifungal activity of R. flavipes against M. brunneum (adjusted p < 0.001).

3.3. Activité antifongique des extraits bruts

Les deux espèces de champignons ont été analysées séparément (la viabilité des conidies sur PDA diffère entre les deux espèces). Pour M. robertsii, les unités formant colonies (UFC) moyennes entre les traitements fongiques et témoins étaient significativement différentes (F=18.08, df=2, p < 0 .001) (Figure 5a). Les extraits bruts de R. virginicus, mais pas ceux de R. flavipes, ont montré une activité antifongique significative contre M. robertsii par rapport au témoin (p ajusté < 0.001 et p=1.{{ 10}}, respectivement). L'activité antifongique des extraits de R. virginicus contre M. robertsii était significativement supérieure à l'activité antifongique des extraits de R. flavipes contre M. robertsii (p ajusté <0,001). Pour M. brunneum, les UFC moyennes (Figure 5b) entre les traitements fongiques et témoins étaient significativement différentes (F=27,26, df=2, p < 0,001). Les extraits bruts de R. virginicus mais pas de R. flavipes ont montré une activité antifongique significative contre M. brunneum par rapport au témoin (p ajusté <0,001 et p=0,072, respectivement). L'activité antifongique des extraits de R. virginicus contre M. brunneum était significativement supérieure à l'activité antifongique de R. flavipes contre M. brunneum (p ajusté <0,001).

Figure 2. Réponse d’alarme à un défi fongique. Les boxplots représentent la distribution des LOM (LOM notés chez 709 individus marqués à la peinture). Les cases correspondent à la distance entre les quartiles supérieur et inférieur par rapport à la médiane (IQR). Les moustaches correspondent à 1,5 × IQR. Les cercles et les astérisques représentent les valeurs aberrantes au-delà de 1,5 × IQR ou 3 × IQR, respectivement. Différentes lettres indiquent des différences significatives entre les distributions pour les traitements fongiques et de contrôle (ajusté par Bonferroni). Rf correspond à R. flavipes, Rv à R. virginicus, Mr à M. robertsii et Mb à M. brunneum.

3.4. Allogrooming parmi les couples en difficulté

La fréquence des épisodes d'allorooming a diminué de manière significative avec les défis fongiques (moyenne du défi {{0}},55, moyenne du contrôle=8,80, t=−4,461, p < {{20}}.001). Cependant, la durée moyenne de l'allorooming a augmenté de manière significative avec les défis fongiques (moyenne du défi=19,01 s, moyenne du contrôle=5,62 s, t=4,876, p < 0,001). La durée des périodes de toilettage pour chaque interaction entre les paires de termites différait significativement selon les traitements et les contrôles (F=7,166, df=5, p < 0,001) (Figure 6). La durée du toilettage par événement était significativement élevée dans les paires de R. flavipes traitées avec M. robertsii (p ajusté <0,001) ou M. brunneum (p ajusté=0,037) par rapport aux témoins, mais pas dans les paires de R. virginicus traitées. avec M. robertsii (p ajusté=1.000) ou M. brunneum (p ajusté=1.000) par rapport aux contrôles.

Figure 3. La survie de deux termites contre un a été comparée aux rapports de risque de décès (n=80 paires, 96 singletons). Rf correspond à R. flavipes, Rv à R. virginicus, Mr à M. robertsii et Mb à M. brunneum. Le temps a été transformé en journal pour le calcul des valeurs R2.

Figure 4. Survie de termites uniques après une provocation fongique (n=96). Rf correspond à R. flavipes, Rv à R. virginicus, Mr à M. robertsii et Mb à M. brunneum. Voir le texte pour plus de détails sur les différences statistiques entre les traitements. Les différences significatives de survie pour les comparaisons par paires étaient basées sur les tests de Breslow (tests de Wilcoxon généralisés). * Différence significative entre les traitements (p < 0,025 Bonferroni ajusté).

Figure 5. Activité antifongique de l'extrait brut contre M. robertsii (a) et M. brunneum (b). Les valeurs au-dessus des barres représentent les UFC moyennes (± SD) et différentes lettres indiquent des différences significatives (ajustées par Bonferroni). Rf correspond à R. flavipes et Rv à R. virginicus. L'analyse a utilisé deux répétitions de 5 colonies de chaque espèce de termite, 6 répétitions pour le contrôle Rf et 2 répétitions pour le contrôle Rv.

Figure 6. Durée de l'allorooming par interaction (n=161 événements d'allorooming). Les valeurs au-dessus des barres représentent la durée moyenne des interactions d'allorooming (± SD), et des combinaisons de lettres distinctes indiquent des différences significatives (ajusté par Bonferroni). Rf correspond à R. flavipes, Rv à R. virginicus, Mr à M. robertsii et Mb à M. brunneum.

4. Discussion

R. flavipes s'appuie davantage sur les mécanismes sociaux de défense contre les agents pathogènes fongiques locaux que R. virginicus. Pour les travailleurs de R. flavipes confrontés à l'une ou l'autre des espèces de Metarhizium, il existait une forte corrélation négative entre le temps passé par deux termites ensemble et leur probabilité de décès par rapport aux termites uniques exposés. Le rapport de risque de décès par rapport aux termites uniques infectés a été réduit de moitié en environ deux heures (Figure 3). Les interactions sociales précoces semblent donc être essentielles à la survie lorsque les ouvriers de R. flavipes rencontrent de faibles concentrations de conidies Metarhizium. En revanche, les ouvriers de R. virginicus ont montré une faible corrélation entre le temps passé ensemble par deux termites et leur probabilité de décès. De plus, contrairement à R. virginicus, les paires d'ouvrières de R. flavipes ont considérablement augmenté la durée des périodes d'allotoilettage après une provocation fongique (Figure 6). La détection de conidies sur la cuticule d'un nid est probablement à l'origine de cette augmentation. Une élimination plus efficace des conidies des surfaces cuticulaires en augmentant la durée des périodes d'allorooming semble expliquer l'immunité sociale supérieure de R. flavipes. Nos résultats indiquent également que R. virginicus s'appuie davantage sur des mécanismes de défense innés individuels contre les agents pathogènes fongiques locaux que R. flavipes. La mortalité des ouvriers isolés de R. flavipes confrontés à l'une ou l'autre des espèces de Metarhizium était significativement plus élevée que la mortalité des ouvriers de R. virginicus (Figure 4). L’activité antifongique des lavages cuticulaires des ouvrières de R. virginicus contre les conidies de Metarhizium s’est déjà révélée significativement plus forte que l’activité des ouvrières de R. flavipes [20]. L'activité antifongique des extraits bruts de termites entiers était également plus forte chez R. virginicus que chez R. flavipes (Figure 5). Ces extraits comprennent des composés provenant de symbiotes intestinaux qui, avec les composés antifongiques des termites, peuvent également contribuer à l'élimination des conidies ingérées (26). La variation des ratios de risque de décès et leur faible corrélation avec les temps de séparation chez les travailleurs de R. virginicus concordent avec une plus grande dépendance à l'égard des mécanismes de défense immunitaire innée qui varient selon les individus plutôt qu'aux mécanismes immunitaires sociaux. R. flavipes a également montré une plus grande dépendance à l'égard de l'immunité sociale lorsque des groupes de 12 travailleurs ont été brièvement exposés à de fortes concentrations de conidies de M. robertsii. Immédiatement après l'exposition aux conidies de M. robertsii, les deux espèces de termites présentaient des LOM élevées. Cette activité d'alarme était significativement plus élevée chez R. flavipes que chez R. virginicus (Figure 2), et la résistance aux infections mortelles était également significativement plus élevée chez R. flavipes que chez R. virginicus (Figure 1). En revanche, il y avait une réponse d’alarme élevée mais faible aux conidies de M. brunneum. Conformément à ce résultat, il a déjà été démontré qu'une alarme élevée chez R. flavipes en réponse aux conidies de différentes souches et espèces de Metarhizium est corrélée à un allogrooming et à une survie élevés (23). Les ouvrières de R. flavipes peuvent avoir un seuil plus bas que les ouvrières de R. virginicus pour reconnaître et réagir collectivement et efficacement à une contamination cuticulaire par les conidies de M. robertsii. M. robertsii, qui est l'espèce de Metarhizium la plus répandue dans notre site d'étude [24], peut représenter une menace pour R. flavipes qui nécessite une forte réponse immunitaire sociale car ce termite a des défenses immunitaires innées relativement faibles contre lui. L’efficacité des composés antifongiques associés aux sécrétions des glandes salivaires est probablement essentielle pour les défenses individuelles observées dans cette étude [20]. Ces composés sont présents à la surface des ouvrières préalablement aux agressions fongiques car ils s'expriment constitutivement et sont constamment disséminés par les niveaux basaux d'allorooming, qui intègre donc les défenses individuelles et sociales. Cette gestalt comprend probablement le petit peptide antifongique de type défensine, la termicine, qui est sécrété dans la glande salivaire et qui est d'une importance cruciale pour la défense contre les infections mortelles par Metarhizium (27). Une étude de R. flavipes et R. virginicus provenant du même site de collecte du Maryland utilisé dans cette étude a révélé que les termicines ont récemment fait face à un balayage sélectif qui a entraîné une réduction du polymorphisme nucléotidique, et cette réduction était plus importante chez R. flavipes que chez R. virginicus [28].

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Le balayage a peut-être été et continue peut-être d'être plus grave pour R. flavipes parce que R. virginicus possède des mécanismes immunitaires innés plus efficaces qui ont réduit sa dépendance aux termicines pour se défendre contre une récente épidémie fongique. Alternativement, les contraintes adaptatives sur l’évolution des termites (manque de variation génétique) pourraient avoir laissé à R. flavipes des armes plus faibles face à une nouvelle épidémie fongique. La contrainte sur le changement adaptatif des termicines sous une forte pression sélective est également évidente chez les Nasutitermes australiens (29). Le processus stochastique de duplication génétique semble avoir libéré cette contrainte dans différentes lignées nasutes, ce qui a entraîné l'évolution répétée de deux termicines avec des charges moléculaires différentes. Cela a peut-être bénéficié à la défense antifongique, car deux terminaux avec des propriétés de charge différentes limitent les possibilités d'évolution d'une résistance fongique. Les termites présentant une alarme (LOM) après une exposition à une dose élevée de conidies étaient moins susceptibles de mourir en deux semaines que les individus ne montrant aucune alarme. Les LOM sont positivement corrélées à l'agrégation des ouvrières de R. flavipes et à l'allorooming (23), ce qui suggère que les individus manifestant une alarme dans cette étude ont sollicité davantage de toilettage de la part de leurs camarades de nidification. Les LOM sont rarement signalés dans les recherches portant sur les infections à Metarhizium chez les termites et ont été écartés comme jouant un rôle dans la signalisation de l'exposition à des agents pathogènes (30). Cependant, ils peuvent passer inaperçus car ils ne se produisent pas chez des individus isolés, ne sont pas substantiellement provoqués par certaines souches et espèces de Metarhizium, prennent environ 3 minutes après une provocation avant de s'intensifier et disparaissent après environ 30 minutes [22,23]. Nos résultats suggèrent que les LOM communiquent une alerte d'urgence après une exposition à une dose élevée de conidies, détectées lors de l'allorooming. Cependant, les LOM ne sont pas nécessaires pour une réponse comportementale proactive puisque la durée de l'allorooming a augmenté après une exposition à faible dose lorsque les LOM étaient négligeables.

5. Conclusions

Les LOM semblent faire partie d'une réponse d'urgence à une forte contamination cuticulaire qui utilise la communication en réseau pour accélérer rapidement l'élimination et la destruction de la plupart des conidies avant qu'elles n'aient une chance de s'attacher fermement et de germer, ce qui prend environ 12 heures (31). Cette intervention d’urgence risque d’être coûteuse en énergie. L'immunité sociale améliorée chez R. flavipes en réponse à M. robertsii peut constituer un compromis adaptatif que R. virginicus n'a pas à faire dans la même mesure car il possède des mécanismes immunitaires innés plus efficaces. Face aux faibles niveaux d’exposition aux agents pathogènes auxquels les travailleurs en quête de nourriture doivent régulièrement résister, l’allogrooming semble également compenser la faiblesse des mécanismes immunitaires innés.

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