Parasites, infections et inoculation dans des cellules minimales synthétiques
Oct 27, 2023
ABSTRAIT: Les cellules minimales synthétiques fournissent un modèle contrôlable et concevable pour les processus biologiques. Bien que beaucoup plus simples que n’importe quelle cellule naturelle vivante, les cellules synthétiques offrent un cadre pour étudier les fondements chimiques des processus biologiques clés. Nous montrons ici un système cellulaire synthétique avec des cellules hôtes, interagissant avec des parasites et subissant des infections de gravité variable. Nous démontrons comment l'hôte peut être modifié pour résister à l'infection, nous étudions le coût métabolique de la résistance et nous montrons une inoculation qui immunise l'hôte contre les agents pathogènes. Nos travaux élargissent la boîte à outils de l’ingénierie cellulaire synthétique en démontrant les interactions hôte-pathogène et les mécanismes d’acquisition de l’immunité. Cela rapproche les systèmes cellulaires synthétiques de la fourniture d’un modèle complet de vie complexe et naturelle.
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INTRODUCTION
Au cours des dernières décennies, le domaine de la biologie synthétique a explosé, permettant la construction de cellules synthétiques qui ressemblent et modélisent certains aspects de la vie biologique naturelle. La modélisation des voies et comportements cellulaires dans les cellules synthétiques offre de nombreux avantages par rapport aux cellules vivantes, tels qu'un environnement de réaction plus simplifié et défini, un contrôle complet sur la composition protéomique et chimique de la cellule, la capacité de compartimenter les voies et processus biologiques interférents, ainsi que de maintenir systèmes biologiques importants qui sont absents dans les systèmes de réaction in vitro.1,2 Ces atouts uniques des technologies de cellules synthétiques ont déjà permis de simuler des conditions et des voies biologiques au sein d'un bioréacteur in vitro (cellule synthétique) réaliste et ont permis de mieux comprendre de nombreux domaines d’étude, y compris l’encombrement moléculaire3, la dynamique lipidique-protéique4, le métabolisme minimal5 et de nombreux autres aspects critiques de la vie biologique.2 Ces cellules synthétiques réalistes, dotées de leurs atouts uniques, deviennent rapidement de meilleurs modèles et apportent davantage de lumière sur la vie biologique. le mystérieux fonctionnement interne de la vie cellulaire.6,7 Ces avancées ne se limitent pas aux processus unicellulaires ; les interactions techniques entre les populations de liposomes se sont également révélées une technologie puissante. Par exemple, la conception d'un système cellulaire synthétique qui imite une relation prédateur-proie a été développée en utilisant la lumière comme signal entre ces populations de cellules synthétiques.8 Un autre travail complexe a été développé qui permet la propagation du signal à travers une matrice de gouttelettes de cellules synthétiques, permettant à la fluorescence de se propager de manière spatiale au sein de la population.9 En plus des interactions cellules synthétiques-cellules synthétiques, des progrès récents ont également été réalisés dans les interfaces cellules synthétiques-cellules vivantes. Par exemple, il a été démontré qu’une cellule synthétique conçue pour s’interfacer avec une cellule souche neurale est capable d’induire une différenciation neuronale et d’agir comme un châssis généralisé capable d’interagir avec d’autres types de cellules.10 Il y a eu d’innombrables progrès dans le développement de propagation du signal et de cellules synthétiques agissant comme interfaces, dont une grande partie est explorée dans les revues suivantes.11−13 En bref, il existe des domaines entiers de recherche concernés par l'imitation des interactions des populations cellulaires dans le système modèle de cellules synthétiques. Malgré cela, aucune étude n’a utilisé des cellules synthétiques pour modéliser l’infection, le parasitisme ou l’inoculation. Tout comme les cellules synthétiques sont couramment utilisées pour modéliser des processus biologiques complexes de manière simplifiée et contrôlée, il est possible de modéliser ces interactions complexes entre organismes. L'importance de ceci peut être vue dans l'étude révolutionnaire qui a réussi à produire des particules de phages actifs au sein d'une plate-forme d'expression de protéines acellulaires.14 Nous visons à amener ce concept au niveau macro en concevant des populations de cellules synthétiques qui peuvent s'infecter activement les unes les autres et détourner le génome d'une cellule hôte, tout comme le font les virus et les parasites vivants. Être capable d'appliquer et de concevoir des cellules synthétiques pour modéliser ces comportements pathologiques fournira un outil précieux à la communauté scientifique.
Dans ce travail, nous présentons notre système de modélisation des maladies cellulaires synthétiques. Nous avons conçu une cellule hôte qui pourrait subir une infection à partir de la deuxième population de cellules synthétiques parasitaires et étudié la compétition entre les ressources, le détournement du génome et la réutilisation métabolique qui se produisent lors d'une telle infection. Nous modélisons également une méthode permettant de sauver l'hôte après une infection ainsi qu'un moyen d'inoculation qui permettra à l'hôte de résister à l'infection des cellules synthétiques pathogènes. En bref, nous présentons un nouveau châssis de modèle de maladie et d’infection pour les cellules synthétiques. Grâce à cette technologie, les cellules synthétiques peuvent commencer à être utilisées comme modèles rudimentaires de maladies, d’infections et d’inoculation (Figure 1).
Figure 1. Parasite, infection et système d’inoculation dans des cellules synthétiques minimales. (a) L'« hôte » est une cellule synthétique exprimant la protéine fluorescente verte (GFP). À la surface de la membrane externe, l’hôte porte des étiquettes ADNsb. Les seules protéines traduites dans un hôte sain sont les propres protéines de l'hôte provenant des plasmides avec lesquels l'hôte a été créé. (b) Le "parasite" est un liposome rempli d'ADN plasmidique codant pour un gène de la protéine fluorescente mCherry, et la surface du liposome du parasite est décorée d'une étiquette ADNsb (complémentaire à l'étiquette située sur la surface de l'hôte). L'« infection » commence par une fusion des liposomes de l'hôte et du parasite, médiée par les étiquettes d'ADN complémentaires présentes à leur surface. Après l’infection, l’hôte exprime à la fois le gène de l’hôte original (GFP) et le gène du parasite (mCherry). (c) L'« infection » commence par des liposomes « pathogènes » portant un gène pour l'enzyme de restriction MunI fusionnant avec les liposomes de l'hôte. Le gène pathogène MunI est exprimé par l'hôte et l'enzyme de restriction MunI digère l'ADN de l'hôte. Cela entraîne la digestion du génome de l'hôte natif, transformant la majeure partie de l'expression de la protéine hôte de la GFP en la protéine codée par l'agent pathogène, MunI. (d) L'« infection mortelle » est une fusion du liposome de l'hôte (avec le génome de la GFP) avec le liposome de l'agent pathogène contenant le gène codant pour aHL, une protéine membranaire. Après l'infection, l'hôte exprime l'aHL, ce qui crée des pores membranaires, provoquant une fuite des nutriments de l'hôte et arrêtant efficacement le métabolisme de l'hôte. (e) « L'immunisation » est l'incubation de l'hôte avec un ADN simple brin contenant une séquence compatible avec les étiquettes de fusion à la surface des liposomes de l'hôte. L'ADN immunisant crée un duplex avec les étiquettes d'ADN de l'hôte, empêchant l'hybridation d'autres oligos d'ADN avec ces étiquettes. Cela empêche la fusion de tout liposome pathogène avec l’hôte. Il s’agit d’un chiffre de preuve de concept, et les graphiques sont à des fins d’illustration, représentant les quantités relatives de protéines exprimées par l’hôte et divers agents pathogènes. Les données réelles pour chaque système sont fournies dans les figures suivantes.
RÉSULTATS ET DISCUSSION
Dans ce travail, nous utilisons les mots : hôte, parasite, infection, mortel, vaccin et inoculation, le tout dans le contexte de systèmes cellulaires synthétiques non vivants. Par infection « mortelle », on entend une diminution marquée de la traduction dans la population de cellules synthétiques. Toutes les expériences de ce travail ont été réalisées sur des cellules synthétiques qui ne sont pas vivantes, ne se reproduisent pas et n’évoluent pas. Il s’agit d’un système modèle pour les propriétés et processus biologiques naturels.
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L'infection d'une cellule synthétique par une cellule synthétique parasite détourne les ressources de l'hôte.
Pour tester le concept d’un système cellulaire synthétique imitant une infection, nous avons commencé par construire un système modèle pour un parasite. Nous avons utilisé le concept de parasite le plus simple possible pour se reconstituer dans ce système biochimique non vivant : un parasite qui détourne une partie des ressources de l'hôte. Dans ce cas, le métabolisme de l’hôte est représenté par l’expression de la protéine GFP et le parasite est représenté par l’expression de la protéine mCherry. Pour ce système, nous avons utilisé le phénomène précédemment démontré de rendement d'expression linéaire des protéines en fonction de la concentration de la matrice d'ADN dans TxTl.15,16. Tout d'abord, nous avons cherché à trouver la concentration totale optimale de plasmide à laquelle le rapport entre la GFP et l'ADN de mCherry correspond à le rapport de fluorescence observée de ces protéines. Nous avons arbitrairement attribué le gène GFP comme « hôte » et le gène mCherry comme « parasite ». Ces noms ne signifient rien de spécial dans cette expérience particulière mais indiqueront l'hôte et le parasite dans les expériences ultérieures sur les cellules synthétiques. Ici, nous utilisons ces noms pour faciliter la mise en relation de ces expériences de preuve de concept avec des expériences ultérieures d'infection de cellules synthétiques utilisant les mêmes plasmides. Nous avons mélangé les plasmides GFP et mCherry, les deux gènes étant sous le contrôle du promoteur T7 à différents ratios de plasmides et une concentration totale de plasmides dans les échantillons de 1, 5, 10 ou 15 nM (Figure 2b). Les résultats ont suivi la relation presque linéaire attendue entre la concentration de plasmide et l'intensité de fluorescence enregistrée, la meilleure correspondance entre les rapports de fluorescence et de concentration de plasmide étant observée avec un total de 10 nM de plasmide. La relation observée indique que les plasmides, les protéines étant similaires en taille et en composition en acides aminés (Figure S1), sont en compétition pour le même pool de ressources TxTl pour leur expression. La modification de la concentration relative des deux plasmides entraîne des modifications de l'efficacité d'expression à peu près proportionnelles au rapport des plasmides. Cela indique que ce serait un bon modèle pour imiter l’infection parasitaire : le génome du parasite (plasmide mCherry) entrera en compétition avec le génome de l’hôte (plasmide GFP). Ensuite, nous avons décidé de tester un cas dans lequel l'un ou l'autre des plasmides était sous le contrôle d'un promoteur plus fort, imitant ainsi un scénario d'allocation de ressources biaisé. Pour conserver l’aspect compétition des ressources des futures expériences d’infection « parasitaire », nous avons conservé les deux gènes sous le même promoteur de l’ARN polymérase (l’ARN polymérase T7, T7 RNAP), mais nous avons fait varier sa force. Nous avons utilisé un puissant promoteur T7 RNAP, T7Max, qui démontre un rendement de transcription significativement plus élevé, entraînant des rendements de traduction proportionnellement plus élevés, dans TxTl.17 Nous avons testé le montage réactionnel identique à celui décrit précédemment : deux plasmides à des ratios différents, testés à un total final variable. concentrations de plasmides. L’un des plasmides était sous le contrôle du promoteur fort T7Max, tandis que l’autre était sous le promoteur canonique T7. Dans les deux cas de test, l'expression du plasmide T7Max était suffisamment forte pour que la fluorescence de la protéine d'un gène sous T7Max n'augmente pas de manière significative avec l'augmentation de la concentration totale du plasmide (Figure 2c, 2d). Cela ne semblait pas avoir d'importance si T7Max pilotait la GFP ou mCherry, les deux protéines répondaient au promoteur le plus fort avec une augmentation relative similaire. Cela a fourni un modèle prometteur pour l'infection par un parasite "plus fort" (un parasite portant le gène sous T7Max dans un hôte sous T7) et un hôte inverse, plus fort résistant à un parasite plus faible (un hôte avec un génome sous T7Max et un parasite portant le gène T7). Encouragés par ces expériences de démonstration de principe, nous sommes passés à des expériences sur des cellules synthétiques.
L'« infection », dans tous les cas, est la fusion d'une cellule synthétique de l'hôte et du parasite. La fusion est facilitée par des étiquettes d'ADN à la surface des liposomes, en utilisant le système de fusion inductible par l'ADN décrit précédemment.18 En bref, les cellules synthétiques ont été créées avec Escherichia coli TxTl à l'intérieur d'une membrane de POPC et de cholestérol, et le feuillet extérieur a été décoré. avec un ADN simple brin ancré à la membrane par modification du cholestérol. Si une paire de liposomes avec des étiquettes complémentaires se rencontrent, les étiquettes d'ADN s'hybrident, rapprochant les membranes et déclenchant la fusion membranaire, suivie d'un mélange de lumières. Dans nos expériences, la cellule synthétique hôte est le liposome contenant TxTl avec T7 RNAP en plus du génome d'une GFP codée par un plasmide. La surveillance de la fluorescence de la GFP sert d'indicateur de la « santé » du métabolisme de l'hôte. Le parasite entrant contient un génome sous la forme d’un plasmide codant pour mCherry, le système de traduction complet, mais pas d’ARN polymérase T7. Cela garantit que tout changement observé dans le métabolisme de l'hôte résulte des gènes introduits par le parasite et non de la fusion des liposomes du parasite et de l'hôte, diluant le cytoplasme de l'hôte. Les expériences d'infection parasitaire ont été réalisées avec la membrane hôte marquée avec Marina Blue DHPE, un colorant lipidique membranaire bleu. Cela nous a permis de normaliser la fluorescence observée des gènes de l’hôte et du parasite par rapport à la fluorescence bleue, normalisant ainsi les résultats par rapport à la quantité totale de fluorescence de la membrane hôte présente dans l’échantillon. Ceci explique les dilutions du volume total de l'échantillon après ajout de liposomes parasites. Les membranes du parasite n’étaient pas marquées par fluorescence. Toutes les expériences étaient accompagnées d'un échantillon témoin, où une seule population était présente, l'hôte, mais avec le plasmide mCherry, pour montrer les niveaux d'expression théoriques maximaux possibles de mCherry s'il s'agissait du seul gène de la population. Dans la première série d'expériences, nous avons mélangé l'hôte et le parasite avec des gènes tous deux sous le contrôle du promoteur T7 régulier.les gènes de l'hôte et du parasite étaient donc tout aussi « forts ». Nous avons mélangé l'hôte avec le parasite de sorte que le parasite représentait 25, 50 ou 75 % de la population totale de liposomes. Dans tous les cas, la fluorescence de la GFP de l'hôte a diminué en présence du parasite, avec l'augmentation correspondante de la fluorescence du parasite mCherry (Figure 2e). Les échantillons contenant uniquement le parasite et aucun hôte ne produisaient aucune fluorescence des deux couleurs, comme prévu. Dans tous les cas, la fusion des liposomes médiée par l’ADN n’est pas efficace à 100 % ; 18,19. Par conséquent, la diminution relative de la fluorescence de l’hôte et l’augmentation de la fluorescence du parasite n’étaient pas aussi importantes que la valeur théorique attendue basée sur le rapport hôte/parasite. En d’autres termes, l’infection n’a pas été efficace à 100 %. Cette qualité fortuite du système de fusion induit par l’ADN était, dans ce cas, une caractéristique bénéfique du système. Comme dans le cas d’une infection naturelle, l’infection médiée par la fusion de cellules synthétiques n’a pas affecté tous les hôtes et tous les parasites n’ont pas trouvé d’hôte. Ensuite, nous avons étudié deux cas dans lesquels l’hôte et le parasite n’étaient pas de la même force en termes de force génomique. Dans un cas, le génome de l'hôte était sous le contrôle du promoteur T7 tandis que le génome du parasite était sous le promoteur T7Max (Figure 2f), et dans le scénario inverse, le génome de l'hôte était sous T7Max et le génome du parasite était sous le promoteur T7. (Figure 2g). Dans le cas de l'hôte le plus faible attaqué par un parasite plus fort, l'augmentation relative de la fluorescence parasitaire de mCherry et la diminution correspondante de la fluorescence de la GFP de l'hôte étaient beaucoup plus fortes que dans le cas précédent d'un hôte et d'un parasite uniformément appariés. Comme prévu, lorsque l'hôte était plus fort que le parasite, l'inverse était vrai : les niveaux de fluorescence de mCherry étaient plus faibles et la diminution relative de la fluorescence de la GFP était inférieure à celle du cas uniformément apparié. Ceci est mieux illustré en comparant un seul point de données dans les mêmes conditions d’infection : avec un taux de parasites de 75 %. Des populations d'hôtes et de parasites uniformément appariées se traduisent par une fluorescence parasitaire légèrement plus grande que celle de l'hôte. Lorsque le parasite est plus fort, la fluorescence du parasite est nettement supérieure à celle de l'hôte. Et lorsque l’hôte est plus fort, la fluorescence du parasite est légèrement inférieure à celle de l’hôte. Ces points de données mis en évidence sont marqués d’une étoile jaune sur la figure 2e−g. Nous avons réalisé l'expérience de contrôle d'un hôte infecté par un parasite "asymptomatique", un parasite portant un plasmide avec le promoteur T7 mais aucune séquence codante pour la protéine (nous avons retiré la cassette mCherry du plasmide) (Figure 2h). La fluorescence de la GFP de l'hôte diminue de manière minime à des niveaux de parasite plus élevés, ce qui indique qu'une petite quantité de ressources de l'hôte est consacrée à la transcription du court ARN non codant du plasmide du parasite. Ces données confirment également que la principale charge métabolique de l’infection parasitaire sur l’hôte réside dans l’utilisation de ressources traductionnelles et non transcriptionnelles. Cette observation concorde avec les observations précédentes selon lesquelles la traduction est la ressource la plus variable et la plus limitante dans les systèmes acellulaires.20 Dans l'ensemble, ces expériences fournissent un modèle d'infection par un parasite qui détourne les ressources métaboliques de l'hôte, avec des comportements cellulaires synthétiques imitant aspects d’une relation naturelle hôte-parasite.
Figure 2. L'infection parasitaire détourne les ressources de l'hôte. ( a ) Le liposome de la cellule synthétique hôte contient un système de traduction acellulaire et un plasmide codant pour la GFP. La surface de l’hôte est décorée de balises ADNsb. Le liposome du parasite contient un plasmide codant pour mCherry, avec un système de traduction mais pas d'ARN polymérase (le parasite ne peut donc pas exprimer mCherry). La surface du parasite est décorée de balises ADNsb complémentaires aux balises présentes à la surface de l’hôte. Les étiquettes d'ADN facilitent la fusion des liposomes de l'hôte et du parasite et l'hôte exprime à la fois sa propre GFP génomique et le génome parasitaire contenant mCherry. ( b - d ) Preuve de principe pour les génomes de l'hôte (GFP) et du parasite (mCherry) en compétition pour les mêmes ressources cellulaires synthétiques. Ces expériences sont réalisées dans une solution TxTl et non dans des liposomes. Deux plasmides, codant pour GFP et mCherry, ont été mélangés selon le rapport indiqué par les icônes de plasmide à gauche de la carte thermique, la concentration totale d'ADN de l'échantillon étant indiquée dans la ligne située au-dessus de la carte thermique. La fluorescence a été mesurée dans les canaux vert (GFP) et rouge (mCherry). Chaque plasmide a été testé dans deux variantes avec des promoteurs de forces différentes : avec T7 et avec le promoteur T7Max plus fort. Les données individuelles pour toutes les cartes thermiques sont fournies dans les figures S2 à S4. Des évolutions temporelles individuelles représentatives pour l'expression des protéines de l'hôte et du parasite T7 sont présentées dans les figures S5 à S7 et pour le parasite T7Max dans les figures S8 à S10. (par exemple) Infection de l'hôte par le parasite. Dans chaque expérience, les liposomes de l’hôte sont mélangés à des liposomes du parasite. La fusion du parasite avec l'hôte fournit l'ADN parasitaire de mCherry, qui est exprimé aux côtés de l'ADN de la GFP de l'hôte. Différents rapports hôte/parasite ont été testés, comme l'indiquent les icônes situées sous les graphiques à barres. Le génome de l'hôte sous le promoteur T7 a été infecté par un parasite avec son génome sous le panel promoteur T7 (e) et par un parasite avec son génome sous le panel promoteur T7Max (f), l'hôte a également été créé avec un génome T7Max et infecté avec le parasite avec un panel génomique T7 (g). Des évolutions temporelles individuelles représentatives pour l’expression des protéines sont fournies à la figure S11. Des expériences similaires à des concentrations de lipides totaux plus élevées et plus faibles sont présentées à la figure S12. Des traces de purification par exclusion de taille montrant la stabilité des vésicules après la fusion sont fournies à la figure S13. (h) Infection par un parasite incompatible : le parasite porte le promoteur T7 mais un ADN non codant. Les barres d'erreur indiquent SEM, n=3. Les valeurs de fluorescence dans les panneaux (e-h) sont normalisées à la fluorescence bleue d'un colorant membranaire pour normaliser les résultats à la concentration de cellules hôtes. Toutes les séries d'échantillons étiquetées « hôte infecté par GFP » sont des expériences dans lesquelles l'hôte et le parasite présentaient des étiquettes d'ADN complémentaires à la surface, permettant la fusion des liposomes, appelée infection. Les séries étiquetées « hôte GFP sain » montrent des échantillons dans lesquels l'hôte et le parasite ont été mélangés selon les ratios indiqués, mais ne contenaient pas d'étiquettes de fusion complémentaires, rendant l'infection impossible. Le losange dans les panneaux (e-h) indique une condition d'infection particulière qui illustre le mieux les différences entre les forces d'expression de l'hôte et du parasite dans les panneaux (e-g) et les avantages de l'immunité de l'hôte dans le panneau (h). Une comparaison directe des valeurs d'hôte et de parasite signifiées par l'étoile est donnée à la figure S14. Les données sur l'infection par un parasite sans aucun plasmide sont présentées à la figure S15.
L'infection d'une cellule synthétique peut détruire le génome hôte.
Le parasite décrit ci-dessus exprimait un mCherry codant pour le génome en utilisant les ressources de l'hôte, mais l'hôte maintenait une partie de son métabolisme et continuait à exprimer la GFP malgré l'infection. Ensuite, nous avons décidé d'étudier un système dans lequel l'infection entraîne une prise de contrôle complète du métabolisme de l'hôte par le parasite via la destruction du génome de l'hôte (Figure 3a). Pour concevoir un tel scénario, nous avons étudié une digestion par une enzyme de restriction d'un plasmide dans TxTl. Dans les expériences de preuve de principe, une enzyme de restriction MunI a été exprimée dans TxTl sans liposomes. Le plasmide MunI a été mélangé avec le plasmide GFP selon différents rapports. Si le plasmide GFP ne contient aucun site de restriction MunI, la diminution relativement faible de la fluorescence GFP observée peut être expliquée par la compétition décrite précédemment entre les deux plasmides pour les ressources TxTl. Si le plasmide GFP possède un site de restriction MunI, la fluorescence de la GFP diminue de manière significative et la diminution est proportionnelle à une quantité croissante du plasmide codant pour MunI (Figure 3b). L'expression de MunI a été surveillée via Western Blot et mise à l'échelle proportionnellement à la concentration en plasmide (Figure 3c).
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Encouragés par ces résultats, nous avons mis en place une expérience d’infection avec des cellules synthétiques. L'hôte portait le plasmide GFP et l'agent pathogène portait le plasmide MunI. La concentration des plasmides GFP et MunI a été fixée à 2 mM, bien en dessous de la concentration de saturation plasmidique pour TxTl.21 Nous avions l'intention de rester en dessous de la concentration totale de plasmides à laquelle l'expression de l'hôte et du parasite serait suffisamment élevée pour rivaliser directement pour des ressources limitées ( comme dans le cas décrit ci-dessus d'un simple parasite), dans l'intention plutôt de mesurer principalement l'effet de l'enzyme du parasite détruisant activement le génome de l'hôte. Comme dans les expériences parasitaires décrites précédemment, l'hôte contenait de l'ARN polymérase bactérienne TxTl et T7, l'agent pathogène ne transportait qu'un extrait cellulaire sans ARN polymérase T7, et l'hôte et l'agent pathogène étaient marqués avec des étiquettes de fusion d'ADN complémentaires. La membrane hôte a été marquée avec Marina Blue DHPE pour normaliser les résultats de fluorescence en fonction de la concentration de liposomes hôtes. L'hôte et l'agent pathogène étaient mélangés dans des proportions variables, l'agent pathogène représentant 25, 5 0 ou 75 % de la population totale. La fluorescence de l'hôte « infecté », où l'hôte et l'agent pathogène contenaient des étiquettes de fusion complémentaires, diminuait avec l'augmentation de la quantité d'agent pathogène. La fluorescence GFP de l'hôte « sain », où l'agent pathogène ne contenait pas d'étiquettes de fusion complémentaires, n'a pas diminué en présence d'une quelconque quantité d'agent pathogène. Les échantillons contenant uniquement l'agent pathogène n'ont entraîné aucune fluorescence mesurable (Figure 3d). L'expression pathogène de la protéine MunI a été quantifiée à l'aide d'une analyse Western Blot, les données étant présentées pour la série d'échantillons de l'hôte infecté (Figure 3e). Nous avons ensuite étudié l'infection dans le cas d'un hôte immunisé contre l'agent pathogène : le plasmide GFP hôte ne possédait pas de site de restriction MunI (Figure 3f). La fluorescence de l'hôte après l'infection a diminué mais était loin d'être aussi significative que dans le cas précédent d'un hôte présentant un site MunI dans le génome. La protéine pathogène MunI était exprimée à des niveaux comparables aux expériences d'infection antérieures (Figure 3g), de sorte que la charge métabolique sur l'hôte était similaire. La diminution de la fluorescence de l'hôte infecté dans ces expériences est causée par le détournement de certaines ressources de l'hôte par l'agent pathogène exprimant MunI, mais comme la concentration totale en plasmide est bien inférieure à celle des expériences précédentes sur l'agent pathogène simple, la diminution de la fluorescence de l'hôte est moins significative. Cette expérience confirme également que la diminution de la fluorescence de l'hôte avec un site MunI (Figure 3d) a été provoquée par les évolutions temporelles d'expression des protéines fournies dans la Figure S22. (g) L'expression de MunI a été suivie via une analyse par transfert Western tout au long de l'expérience pour les échantillons présentés dans la série "GFP infecté" dans le panneau (f). Les barres d'erreur sur tous les panneaux indiquent SEM, n=3. Les valeurs de fluorescence dans les panneaux (d, f) sont normalisées à la fluorescence bleue du colorant membranaire utilisé pour normaliser les résultats à la concentration des cellules hôtes. La fluorescence dans le panneau (b) est normalisée au plasmide MunI 0 mM pour chaque série d'échantillons. Les symboles en forme de losange dans les panneaux (d, f) mettent en évidence une condition particulière illustrant le mieux les différences de réponses à l'infection d'un hôte sensible au panneau pathogène (d) et immunisé contre le panneau pathogène (f). Toutes les séries d'échantillons étiquetées « GFP infectées » sont des expériences dans lesquelles l'hôte et l'agent pathogène présentaient des étiquettes d'ADN complémentaires à la surface, permettant la fusion des liposomes, appelée infection. La série intitulée « GFP saine » montre des échantillons dans lesquels l'hôte et l'agent pathogène ont été mélangés selon les ratios indiqués, mais ne contenaient pas d'étiquettes de fusion complémentaires, rendant l'infection impossible.
Figure 3. L'infection détruit le génome de l'hôte et détourne les ressources de l'hôte. ( a ) Les cellules hôtes contiennent un plasmide codant pour la GFP, avec deux sites de restriction MunI ; l'agent pathogène contient un plasmide codant pour l'enzyme de restriction MunI. Après la fusion de l'hôte et de l'agent pathogène, l'hôte TxTl exprime l'enzyme de restriction MunI, qui digère ensuite le génome de l'hôte. (b) Expériences de preuve de principe pour l'infection : le plasmide GFP a été préparé avec et sans sites de restriction MunI. Le plasmide GFP a été mélangé avec le plasmide MunI et l'expression de la GFP a été enregistrée. Ces expériences ont été réalisées dans une solution TxTl sans liposomes. La preuve de principe de l'expérience d'infection, avec l'enzyme MunI ajoutée en externe au lieu d'être exprimée en TxTl, est présentée sur les figures S16 et S17. Des évolutions temporelles représentatives de l'expression des protéines sont fournies à la figure S18. ( c ) L'expression de MunI a été surveillée par analyse par transfert Western; l'intensité de la bande MunI a été quantifiée dans les mêmes échantillons que les résultats de fluorescence présentés dans le panneau (b) pour la série « Site MunI absent ». Un transfert Western représentatif de l'enzyme de restriction MunI est présenté à la figure S19. (d) Fluorescence GFP de l'hôte mélangée à des liposomes pathogènes selon le rapport indiqué sous le graphique de données. Le plasmide hôte GFP possède deux sites de restriction MunI. Des cours représentatifs du temps d'expression des protéines sont fournis dans la figure S2 0. Les données sur les expériences d'infection avec des étiquettes de fusion incompatibles sont fournies à la figure S21. (e) L'expression de MunI a été suivie via une analyse par transfert Western au cours de l'expérience pour les échantillons présentés dans la série "GFP infecté" dans le panneau (d). (f) Fluorescence GFP de l'hôte mélangée à des liposomes pathogènes selon le rapport indiqué sous le graphique de données. La GFP hôte ne possède pas de sites de restriction MunI, ce qui lui confère une immunité contre la protéine pathogène. Des évolutions représentatives du temps d’expression des protéines sont fournies à la figure S22. (g) L'expression de MunI a été suivie via une analyse par transfert Western tout au long de l'expérience pour les échantillons présentés dans la série "GFP infecté" dans le panneau (f). Les barres d'erreur sur tous les panneaux indiquent SEM, n=3. Les valeurs de fluorescence dans les panneaux (d, f) sont normalisées à la fluorescence bleue du colorant membranaire utilisé pour normaliser les résultats à la concentration des cellules hôtes. La fluorescence dans le panneau (b) est normalisée au plasmide MunI 0 mM pour chaque série d'échantillons. Les symboles en forme de losange dans les panneaux (d, f) mettent en évidence une condition particulière illustrant le mieux les différences de réponses à l'infection d'un hôte sensible au panneau pathogène (d) et immunisé contre le panneau pathogène (f). Toutes les séries d'échantillons étiquetées « GFP infectées » sont des expériences dans lesquelles l'hôte et l'agent pathogène présentaient des étiquettes d'ADN complémentaires à la surface, permettant la fusion des liposomes, appelée infection. La série intitulée « GFP saine » montre des échantillons dans lesquels l'hôte et l'agent pathogène ont été mélangés selon les ratios indiqués, mais ne contenaient pas d'étiquettes de fusion complémentaires, rendant l'infection impossible.
L'infection d'une cellule synthétique peut être « mortelle », épuisant les ressources de la cellule hôte, et de telles infections peuvent être « traitées » pour sauver la fonction.
Les expériences ci-dessus sur les parasites et les agents pathogènes ont démontré que les cellules synthétiques peuvent être utilisées comme modèle d'infection, lorsqu'un agent pathogène détourne les ressources de l'hôte. Ensuite, nous avons décidé d’étudier un scénario dans lequel l’infection entraîne l’arrêt du métabolisme de l’hôte après l’expression de la protéine pathogène. Dans ce cas, l’agent pathogène est comparable à une infection par une bactérie exprimant une toxine mortelle moins l’aspect réplication de l’hôte ou du parasite puisque ces cellules synthétiques ne se répliquent pas (Figure 4a). Pour concevoir ce système, nous avons choisi l'hémolysine (aHL), une toxine naturelle et une protéine membranaire largement utilisée dans l'ingénierie cellulaire synthétique pour créer des pores membranaires non spécifiques.22,23 Nous apprécions l'ironie de ce choix car l'aHL est naturellement exprimée par Staphylococcus aureus comme un toxine, et la protéine a ensuite été appropriée pour gérer le transport membranaire et prolonger le métabolisme cellulaire synthétique.24 Ici, nous revenons à l'utilisation de l'aHL pour son rôle naturel de toxine nocive produite par une infection. Un autre exemple notable lié à l'ingénierie des cellules synthétiques d'utilisation de la toxicité de l'aHL pour provoquer la mort cellulaire naturelle provient de l'application de cellules synthétiques comme technologie de traitement du cancer.25 Comme preuve de principe, nous avons établi que l'expression d'une concentration élevée d'aHL dans des vésicules de cellules synthétiques entraîne une fuite du contenu cellulaire et une diminution significative de l’expression de la GFP à l’intérieur de la cellule. Cet effet peut être inversé si l'extérieur des liposomes contient toutes les petites molécules nécessaires au TxTl (Figure 4b). Dans notre système modèle hôte-pathogène, l'hôte contient un plasmide codant pour la GFP et l'agent pathogène contient un plasmide codant pour aHL. La conception de toutes les expériences d'infection est similaire aux scénarios de parasites et d'agents pathogènes décrits ci-dessus, l'agent pathogène ne portant aucun RNAP T7 et l'hôte et l'agent pathogène étant décorés d'étiquettes de fusion d'ADN. Fait intéressant, nous avons observé qu’à des concentrations d’agents pathogènes plus faibles (l’agent pathogène représentant 25 ou 50 % de la population totale), la fluorescence de l’hôte ne diminue que légèrement. Cependant, augmenter la concentration d’agents pathogènes à 75 % entraîne une diminution significative de la fluorescence de la GFP de l’hôte (Figure 4c). Nous pensons que ce résultat pourrait être dû à la fuite relativement lente de nutriments des cellules synthétiques à une concentration d'aHL plus faible. La fluorescence de la GFP n'a été mesurée qu'après 12 h d'incubation et la GFP est une protéine très stable. Par conséquent, il est possible que dans le cas de concentrations plus faibles d’aHL (quantité d’agent pathogène plus faible), la fuite de nutriments provoquée par l’aHL ait été suffisamment lente pour que les cellules hôtes accumulent des quantités significatives de GFP avant que les effets de la fuite induite par l’aHL ne deviennent paralysants. le métabolisme. Pour découpler les résultats d'une simple compétition pour les ressources entre les génomes de l'hôte et du parasite, nous avons réalisé des expériences « d'infection avec sauvetage » dans lesquelles le tampon extérieur contenait toutes les petites molécules qui composent les mélanges d'énergie TxTl, d'acides aminés et de sels. Ceci a été mis en place de la même manière que la condition « nutriments à l’extérieur » testée sur la figure 4b. La diminution de la fluorescence de l'hôte dans ces expériences était similaire aux échantillons antérieurs « d'infection sans sauvetage » avec des niveaux de 25 et 50 % de l'agent pathogène. La diminution de la fluorescence de l'hôte à 75 % de l'agent pathogène était significativement inférieure à la diminution observée dans les échantillons sans sauvetage (Figure 4d). La grande différence dans les résultats de l'expérience avec 75 % du parasite, avec des points de données dans les panneaux de la figure 4 (c, d) mis en évidence par une étoile, semble confirmer notre hypothèse selon laquelle des concentrations plus élevées d'aHL causent des dommages au début de la réaction. À une concentration d'agent pathogène plus faible, la fuite est suffisamment lente pour que la GFP de l'hôte s'accumule (comme on le voit avec et sans nutriments de secours), de sorte que la fluorescence de la GFP observée diminue après l'infection, principalement en raison de la compétition pour les ressources. À des concentrations d’agents pathogènes plus élevées, la fluorescence de la GFP dans les échantillons contenant des nutriments externes diminue principalement en raison de la compétition entre les ressources. Ces expériences démontrent que nous pouvons concevoir des cellules synthétiques pour modéliser l'infection, ce qui entraîne deux résultats différents : la pénalité métabolique de l'infection elle-même (diminution de la GFP due à la compétition entre les ressources) et une infection plus « mortelle » résultant de l'abolition de l'expression des protéines de l'hôte. Encouragés par cette observation, nous avons décidé d'étudier un système dans lequel des cellules synthétiques pourraient résister activement à une infection pathogène et d'étudier la pénalité métabolique d'une telle réponse.
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Les cellules synthétiques peuvent se défendre contre les infections grâce à une stratégie inspirée des bactéries.
Inspirés par la fonction bien connue des endonucléases de restriction pour protéger les bactéries contre l'ADN étranger, nous avons cherché à utiliser cette stratégie dans des cellules synthétiques. Nous avons développé le système parasitaire présenté à la figure 2 : en plus de la GFP, nous avons ajouté à l'hôte un plasmide contenant MunI. Le parasite contenait mCherry, comme lors des expériences précédentes. Le plasmide mCherry contient un site de restriction MunI (Figure 5a). Tout d’abord, nous avons effectué des expériences de démonstration de principe pour évaluer la charge métabolique d’expression de MunI sur l’hôte. Dans ces expériences TxTl non encapsulées, nous avons surveillé l'expression de GFP et l'expression de mCherry, chacune mélangée à une quantité croissante de plasmide MunI ou EcorI. Tous les gènes étaient sous le contrôle du même promoteur T7. Le gène GFP avait un site de restriction EcorI mais pas MunI et le gène mCherry avait un site de restriction MunI mais pas EcorI. Lorsque le plasmide de l'enzyme de restriction a été mélangé avec un plasmide protéique fluorescent sans site de reconnaissance pour cette enzyme de restriction, l'expression de la protéine fluorescente a diminué proportionnellement à l'augmentation du plasmide de l'enzyme de restriction, indiquant une compétition entre les deux plasmides pour les ressources TxTl, comme démontré précédemment pour la GFP. et mCherry sur la figure 2. Ces paires non coupantes étaient GFP avec MunI (Figure 5b) et mCherry avec EcorI (Figure 5e). Lorsqu'une protéine fluorescente était associée à une enzyme de restriction capable de couper le gène de cette protéine fluorescente, la fluorescence diminuait de manière significative jusqu'à presque les niveaux de fond à des concentrations plus élevées de plasmide d'enzyme de restriction. Ces paires de coupes étaient GFP avec EcorI (Figure 5c) et mCherry avec MunI (Figure 5d). Cela indique une diminution de la fluorescence bien au-delà de la simple compétition pour les ressources et similaire au scénario d'infection illustré à la figure 3. L'expression de MunI en présence de GFP diminue l'expression de la GFP. Si nous utilisons la GFP comme proxy du métabolisme « de base » de l’hôte, alors MunI peut être considérée comme une charge métabolique sur l’hôte.
Figure 4. L'hôte est sensible à une infection « mortelle », mais il peut être sauvé. (a) L'hôte contient le plasmide GFP et l'agent pathogène contient un plasmide codant pour le canal membranaire de l'hémolysine (aHL). Après l’infection, l’hôte exprime l’aHL, ce qui crée des pores dans la membrane, provoquant une fuite de nutriments et entraînant une diminution de l’activité métabolique de l’hôte. (b) Preuve de principe pour un aHL exprimant l'hôte (pas d'infection, l'hôte a été créé avec à la fois 5 nM de GFP et la quantité indiquée de plasmide aHL). L'hôte a été incubé dans un tampon avec ou sans nutriments (tous les composants du mélange d'énergie, de sel et d'acides aminés utilisés pour préparer le système de traduction sans cellules hôtes). La concentration optimale de nutriments de secours a été établie expérimentalement, comme le montrent les données de la figure S23. (c) Infection de l'hôte par l'agent pathogène, avec des quantités variables d'agent pathogène par cellule hôte. La fuite de petites molécules des cellules « saines » et « infectées » a été directement mesurée à l'aide d'un colorant à petites molécules. Les données sont présentées sur les figures S24 et S25. (d) Des expériences similaires à celles-ci sont présentées dans le panneau (c), mais le tampon extérieur contient des nutriments à petites molécules similaires aux conditions expérimentales « nutriments extérieurs » présentées dans le panneau (b). Les barres d'erreur sur tous les panneaux indiquent SEM, n=3. Les valeurs de fluorescence dans les panneaux (b-d) sont normalisées à la fluorescence bleue du colorant membranaire utilisé pour normaliser le signal à la concentration des cellules hôtes. Les symboles en forme de diamant dans les panneaux (c, d) mettent en évidence une condition particulière illustrant le mieux les différences de réponse à l'infection d'un hôte sans panneau de nutriments extérieurs (c) et immunisé contre l'agent pathogène en raison de la présence d'un panneau de nutriments extérieurs (d). Pour les panels (c, d), la série « GFP infecté » est l'hôte fusionné avec l'agent pathogène portant la protéine aHL, et « GFP saine » est l'hôte fusionné avec l'agent pathogène ne portant aucun plasmide.
Nous procédons aux expériences d'infection en mélangeant l'hôte (avec les plasmides GFP et MunI) avec un parasite (avec le plasmide mCherry). Comme précédemment, nous avons étudié des scénarios avec une quantité croissante de parasites dans la population (Figure 5f). Le contrôle positif d'un mCherry exprimant uniquement l'hôte (avec EcorI au lieu de MunI pour équilibrer la charge métabolique) a créé une référence pour la quantité maximale théorique de protéine pathogène pouvant être exprimée chez l'hôte (Figure 5f). À mesure que la quantité de parasite augmentait, la fluorescence de la GFP de l'hôte diminuait, mais la diminution de la fluorescence de l'hôte infecté était significativement inférieure à la diminution de l'expression de la GFP observée lors d'expériences antérieures avec le même parasite. La fluorescence de la GFP et du parasite mCherry de cet hôte infecté exprimant MunI (point de données marqué d'une étoile sur la figure 5f) peut être directement comparée à des hôtes d'infection similaires sans MunI (point de données marqué d'une étoile sur la figure 2e). Chez l'hôte exprimant MunI, la GFP de l'hôte a commencé avec un niveau absolument inférieur lorsqu'il était en bonne santé (car certaines ressources sont détournées vers l'expression de MunI), mais après l'infection, la diminution de la fluorescence de l'hôte est beaucoup moins significative et l'hôte produit beaucoup moins de protéine mCherry du parasite. que dans le cas où l'hôte n'exprime pas MunI. Cette expérience démontre l’avantage pour l’hôte de consacrer certaines ressources à sa défense contre les parasites. Ce système pourrait être considéré comme un modèle biochimique très simple permettant aux organismes exprimant des protéines de se défendre contre de futures infections ou même contre des facteurs environnementaux nocifs. L'hôte est à l'origine moins robuste (si l'on prend l'expression de la GFP comme référence pour la santé de l'hôte), mais en cas d'infection, les ressources supplémentaires que l'hôte a dépensées pour exprimer des protéines défensives sont payantes, offrant une protection contre le parasite infectant. Ainsi, dans cette simple cellule synthétique non vivante, nous avons reconstitué un exemple de course aux armements biologiques fondamentale.
Figure 5. Les cellules hôtes se défendent contre l'infection. (a) Les cellules hôtes contiennent deux plasmides : l'un codant pour la GFP (sans site de restriction MunI) et l'autre codant pour l'enzyme de restriction MunI (le gène de « résistance parasitaire »). Le parasite contient le plasmide mCherry, dans un système similaire aux expériences illustrées à la figure 2. L'infection est médiée par fusion via des étiquettes d'ADN à la surface de l'hôte et du parasite. Après l'infection, le plasmide mCherry introduit par le parasite est digéré par l'enzyme de restriction MunI de l'hôte. (b−e) Mesure du coût métabolique de l’expression de la résistance du parasite. Les expériences se déroulent dans un système TxTl en vrac, non encapsulé dans des vésicules. Dans chaque expérience, le plasmide protéique fluorescent (GFP ou mCherry) a été mélangé avec le plasmide d'enzyme de restriction (MunI ou EcorI) au rapport indiqué sur l'axe des x pour la concentration totale du plasmide de 10 mM. GFP a un site de restriction EcorI mais pas de site MunI, et mCherry a un site de restriction MunI mais pas EcorI. La courbe de tendance est un guide visuel mais pas un ajustement de données. Les barres d'erreur indiquent SEM, n=3. Des expériences de contrôle avec des enzymes de restriction purifiées, au lieu de les exprimer à partir d'un plasmide, sont présentées à la figure S26. La stabilité des liposomes avec une quantité accrue de plasmide parasite a également été mesurée, données présentées sur la figure S27. f) Infection de l'hôte par une quantité croissante de parasites. «Hôte GFP sain» est l'expression de la GFP à partir de cellules hôtes fusionnées avec le parasite sans aucun plasmide. « Hôte infecté par GFP » est l'hôte fusionné avec le parasite porteur de mCherry. La fluorescence rouge est la fluorescence mCherry du parasite fusionné avec l'hôte (seules les données de l'hôte infecté sont disponibles. Les échantillons d'hôtes sains ne portaient pas le plasmide mCherry). Les barres d'erreur sur tous les panneaux indiquent SEM, n=3. Les valeurs de fluorescence sont normalisées à la fluorescence bleue du colorant membranaire utilisé pour normaliser les résultats à la concentration des cellules hôtes. Le symbole du losange indique l'expression de la protéine parasitaire dans des conditions d'infection particulières, directement comparables au point de données mis en évidence par une étoile sur la figure 2e, une expérience dans les mêmes conditions, mais avec l'hôte dépourvu du gène de résistance MunI.
Figure 6. L'inoculation assure la défense contre les infections. (a) L'hôte contient le plasmide GFP. L'agent pathogène dans ces expériences est l'un des trois schémas d'infection démontrés dans cet article : un parasite (comme le montre la figure 2), un agent pathogène avec l'enzyme de restriction MunI digérant le génome GFP de l'hôte (comme le montre la figure 3) ou un agent pathogène. transportant le canal membranaire aHL, provoquant une fuite de nutriments de l'hôte (comme le montre la figure 4). Dans chaque cas, l’hôte et l’agent pathogène contiennent des étiquettes de fusion d’ADN complémentaires. Avant d'introduire l'agent pathogène, l'hôte est « inoculé » : incubé avec un excès d'oligos d'ADNsb complémentaire aux étiquettes d'ADN de fusion à la surface de l'hôte (étiquettes identiques à celles de l'agent pathogène moins le fragment cholestérol utilisé pour ancrer l'étiquette à la membrane de l'hôte). le pathogène). L'inoculation provoque le double brin des étiquettes de fusion à la surface de l'hôte, rendant ainsi impossible la fusion avec l'agent pathogène. (b) La preuve de principe du schéma d'inoculation. La population de liposomes portant la GFP sous le contrôle du promoteur de l'ARN T7, mais dépourvue d'ARN polymérase T7, est fusionnée avec des liposomes contenant l'ARN polymérase T7. La protéine GFP ne peut être exprimée que si les deux populations fusionnent. L'un ou les deux partenaires de mélange ont été « inoculés » par incubation avec une étiquette d'ADN compatible avec les étiquettes de fusion à la surface du liposome, rendant les étiquettes de fusion double brin et donc incompatibles avec la fusion. Une évolution temporelle représentative de l’expression des protéines est présentée à la figure S28. Les expériences de contrôle sans aucune balise de fusion sont présentées dans la figure S29, et les contrôles avec des balises de fusion incompatibles sont fournis dans la figure S30. La concentration en oligo-inoculation a été établie expérimentalement, données présentées sur la figure S31. (c) Expériences d'infection parasitaire. Un hôte porteur de GFP a été fusionné avec un parasite porteur de mCherry, comme décrit sur la figure 2. L'hôte et le parasite ont été mélangés avec un rapport hôte/parasite variable ; les cellules hôtes ont été soit inoculées (avec des étiquettes de fusion d'ADN double brin non compatibles avec la fusion), soit non inoculées (donc susceptibles de fusion avec le parasite). La fluorescence de mCherry est signalée uniquement pour les échantillons dont l'hôte n'a pas été inoculé, car il n'y avait aucune fluorescence de mCherry mesurable dans les échantillons d'hôtes inoculés. Une inoculation inversée a été testée en inoculant le parasite au lieu de l'hôte, données présentées à la figure S32. (d) Expériences d'infection avec le génome de l'hôte sensible à l'agent pathogène portant l'enzyme de restriction MunI, comme décrit dans la figure 3. La série de données infectées représente un hôte sans inoculation, et la série de données inoculées représente des échantillons avec l'hôte incubé avec des oligos d'inoculation, donc non susceptible de fusionner avec l’agent pathogène. (e) Les expériences d'infection avec l'agent pathogène porteur du gène aHL entraînent une fuite de nutriments hors des cellules hôtes après l'infection, comme décrit dans la figure 4. La série de données infectées représente l'hôte sans inoculation et la série de données inoculées représente des échantillons avec le gène aHL. hôte incubé avec des oligos d'inoculation, donc non susceptible de fusionner avec l'agent pathogène. Les barres d'erreur sur tous les panneaux indiquent SEM, n=3. Les valeurs de fluorescence dans les panneaux (c-e) sont normalisées à la fluorescence bleue du colorant membranaire utilisé pour normaliser les résultats à la concentration des cellules hôtes. Certaines données présentées dans cette figure sont des expériences avec une configuration identique aux expériences présentées dans les figures précédentes (comme indiqué dans chaque légende). Ces expériences ont été répétées pour cette figure afin de produire des données en utilisant le même lot de TxTl pour comparer directement les résultats, éliminant ainsi la variabilité d'un lot à l'autre des préparations de TxTl.
L'inoculation de cellules synthétiques prévient l'infection.
Dans l'exemple décrit ci-dessus, nous avons démontré que l'hôte se défendait contre l'influence du génome d'un agent pathogène en exprimant une protéine supplémentaire. Ensuite, nous avons demandé s’il était possible de modéliser un scénario dans lequel une intervention rendrait en premier lieu un hôte auparavant sensible à l’immunité contre l’infection. Nous l’avons appelé un modèle d’inoculation. Même si cette analogie est loin d’être parfaite, l’aspect sur lequel nous nous sommes concentrés est que la cellule synthétique hôte ne dépense aucune ressource pour générer l’immunité. Dans notre modèle d’immunisation, nous avons conçu un traitement qui transforme la cellule synthétique hôte sensible à l’infection en cellules incapables de fusionner avec un agent pathogène. Le système de fusion cellulaire synthétique utilisé tout au long de cet article repose sur des étiquettes d’ADN simple brin pour induire la fusion des membranes des liposomes. Pour inoculer contre la fusion avec un agent pathogène, nous avons incubé les cellules avec un oligonucléotide d'ADN complémentaire à l'oligo de fusion à la surface des cellules (Figure 6a). Tout d’abord, nous devions confirmer que l’inoculation par incubation avec des oligo complémentaires permet d’abolir la fusion. Dans les expériences de preuve de principe, deux populations de liposomes ont été préparées : une population avait TxTl avec un plasmide codant pour la GFP sous le contrôle du promoteur T7 et l'autre population avait TxTl et l'ARN polymérase T7 mais pas de plasmide. Après la fusion de ces deux populations, le plasmide GFP s'est mélangé à l'ARN polymérase T7 et a induit l'expression de la GFP. Si les deux populations avaient des étiquettes de fusion simple brin et complémentaires, la fusion se produisait et la fluorescence GFP était détectée. Si l'une ou les deux populations étaient incubées avec un oligonucléotide complémentaire à l'étiquette de fusion, la fusion des liposomes ne se produisait pas et la GFP n'était pas exprimée (Figure 6b). Après avoir établi le système d'inoculation, nous avons procédé à l'introduction de l'inoculation pour protéger les cellules synthétiques de l'hôte dans trois des scénarios d'infection décrits précédemment dans ce travail. Tout d’abord, nous avons utilisé le scénario parasitaire décrit dans la figure 2. Les cellules hôtes, contenant un génome GFP, ont été inoculées avec un oligo complémentaire de l’étiquette de fusion à la surface de l’hôte, et l’hôte a été mélangé avec le parasite mCherry. Nous avons mélangé l'hôte avec le parasite dans des proportions différentes. Dans toutes les conditions d'infection, la fluorescence du parasite mCherry était indétectable si l'hôte était inoculé et la fluorescence GFP de l'hôte inoculé ne diminuait pas. Les expériences de contrôle avec l'hôte non inoculé ont montré une diminution de l'expression de la GFP de l'hôte et une augmentation du signal du parasite mCherry, comme prévu (Figure 6c). Ensuite, nous avons appliqué le système d'inoculation au cas d'un hôte infecté par un agent pathogène porteur d'une enzyme de restriction MunI codant pour le génome, capable de digérer le génome GFP de l'hôte, comme dans les expériences présentées à la figure 3. L'hôte inoculé n'a pas montré de diminution. en fluorescence de la GFP après mélange avec des quantités croissantes de l'agent pathogène, tandis que l'hôte non inoculé était infecté et que la fluorescence de la GFP de l'hôte diminuait proportionnellement à la quantité croissante de l'agent pathogène (Figure 6d). L'inoculation s'est également révélée efficace contre l'agent pathogène aHL. Les hôtes inoculés n'ont montré aucune diminution de la fluorescence lors du mélange avec l'agent pathogène, tandis que la fluorescence GFP de l'hôte non inoculé a diminué de manière significative avec l'infection (Figure 6e). Dans tous les cas, cette simple procédure d'inoculation, consistant à incuber l'hôte avec un oligo ADN complémentaire à l'oligo de fusion présent à la surface de l'hôte, était suffisante pour abolir la capacité des cellules synthétiques pathogènes à infecter les cellules hôtes. Par conséquent, nous avons démontré un modèle physico-chimique simple d’intervention qui protège les cellules hôtes de l’infection.
Avantages du cistanche pour les hommes : renforcer le système immunitaire
CONCLUSIONS
Dans cet article, nous démontrons des méthodes d’utilisation de cellules synthétiques minimales pour modéliser les infections parasitaires et pathogènes. La motivation derrière notre travail était double. Nous voulions créer un comportement complexe et réaliste dans des cellules synthétiques, facilitant ainsi l’objectif de concevoir des cellules synthétiques qui ressemblent davantage à des cellules vivantes naturelles. Nous voulions également tirer parti du système cellulaire synthétique simple et contrôlable pour modéliser les propriétés de base des processus d’infection, d’inoculation et de résistance. Bien que les cellules synthétiques n’évoluent pas et ne s’auto-répliquent pas, ce système permet d’étudier la dynamique de l’infection dans un modèle simple et facile à analyser. Nous espérons que les principes d’infection décrits ici aideront à créer des modèles pratiques et applicables pour différents agents pathogènes et l’atténuation des infections. L’étude de ce système cellulaire synthétique simplifié a mis en évidence les interactions fondamentales entre le parasite et l’agent pathogène. Bien que les cellules synthétiques ne soient pas (encore) vivantes et n’aient pas la capacité de subir une évolution darwinienne, ce système nous permet d’observer les interactions entre l’agent pathogène et l’hôte sans la possibilité de développer une immunité naturelle ou de modifier la virulence de l’agent pathogène. Bien que la dynamique de l’infection de l’hôte présentée ici utilise des cellules synthétiques à base de bactéries, ce système n’est pas intrinsèquement limité au TxTl bactérien. Il serait même possible d’imaginer utiliser le système présenté ici pour modéliser la dynamique de l’infection dans des populations ressemblant à des écosystèmes naturels, en profitant de la simplicité inhérente aux cellules synthétiques pour contrôler et étudier pleinement les interactions entre différents membres de grandes populations.
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