La construction du vaccin recombinant Lactobacillus Casei contre le PEDV et ses réponses immunitaires chez la souris

Abstrait

Arrière-plan: La diarrhée épidémique porcine (DEP) est une maladie intestinale contagieuse causée par le virus de la diarrhée épidémique porcine (DEP) caractérisée par des vomissements, de la diarrhée, de l'anorexie et de la déshydratation, qui ont causé d'énormes pertes économiques dans le monde. À l’heure actuelle, l’immunité vaccinale reste la méthode la plus efficace pour contrôler la propagation des DEP. Dans cette étude, nous avons construit une nouvelle souche recombinante de L. casei-OMP16-PEDVS exprimant la protéine PEDVS du PEDV et la protéine OMP16 de la souche Brucella abortus. Pour connaître l'immunogénicité du vaccin candidat recombinant L. casei-OMP16-PEDVS, il a été comparé à BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS et protéine recombinante BL21-PEDVS.

Résultats: Les résultats ont montré que nous pouvions détecter des niveaux plus élevés d'IgG, d'anticorps neutralisants, d'IL-4, d'IL-10 et d'INF- dans le sérum et d'IgA dans les selles de L. casei-OMP16- Des souris immunisées contre le PEDVS, ce qui a indiqué que le vaccin candidat L. casei-OMP16-PEDVS pourrait induire des niveaux plus élevés d'immunité humorale, d'immunité cellulaire et d'immunité muqueuse.

Conclusion: Par conséquent, L. casei-OMP16-PEDVS est un candidat vaccin prometteur pour la prophylaxie de l'infection par le PEDV.

Mots clés : PEDV, vaccin Lactobacillus casei, protéine S du PEDV, OMP16, réponses immunitaires

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Introduction

La diarrhée épidémique porcine (DEP) est causée par le virus de la diarrhée épidémique porcine (DEP) avec des symptômes tels que diarrhée, vomissements, anorexie, déshydratation et perte de poids chez les porcelets [1, 2]. Les porcs de tous âges peuvent être infectés par différents symptômes et le taux de mortalité des porcelets peut atteindre 100 % [3], ce qui a entraîné d'énormes pertes économiques dans le monde entier. Pour contrôler la propagation du PEDV, la plupart des types de vaccins sont construits, tels que le vaccin inactivé avec adjuvant d'hydroxyde d'aluminium, le vaccin bivalent inactif voté contre le virus de la gastroentérite transmissible (TGEV), le vaccin PEDV et le vaccin atténué PEDV [4]. Bien que ces vaccins jouent un rôle important dans le contrôle des DEP, ils ont tous leurs défauts. Les vaccins inactivés ne peuvent pas activer les réponses immunitaires cellulaires, les vaccins atténués ne sont pas très sûrs et ils ne peuvent pas induire une production suffisante d'anticorps IgA spécifiques du virus issus des réponses immunitaires muqueuses. Il est donc nécessaire et urgent de développer un nouveau vaccin pour contrôler les DEP.

Lactobacillus casei est souvent considéré comme une sorte de système vectoriel sûr pour la délivrance ciblée d'antigènes lors de l'immunisation orale, ayant des effets bénéfiques sur la santé des humains et des animaux [5]. Parallèlement, il peut être utilisé comme système d’administration pour réguler la réponse des cellules T auxiliaires et stimuler la sécrétion d’IgA spécifiques pour l’immunité muqueuse [6]. D’un autre côté, le vaccin recombinant Lactobacillus casei est plus facile à administrer, présente moins de risques de réaction d’hypersensibilité et est plus rentable que les vaccins traditionnels. D'après ces rapports, les vaccins recombinants Lactobacillus casei ont été utilisés avec succès dans la prévention et le contrôle du virus du papillome humain, de la pneumonie à Streptococcus et d'Escherichia coli [7-9]. Il existe également des tentatives similaires pour concevoir des vaccins contre la DEP. Les chercheurs ont découvert qu’une souche recombinante de Lactococcus lactis exprimant un gène S1 du virus de la diarrhée épidémique porcine pourrait induire des taux élevés d’IL-4 et d’IFN- chez les souris immunisées [10]. Le vaccin anti-PEDV à base de Lactobacillus casei exprimant le peptide Co1 ciblant les cellules microfoldes fusionné avec l'antigène COE du PEDV pourrait également induire une réponse immunitaire efficace (11). Améliorer l'efficacité du vaccin PEDV. Dans cette étude, nous construisons un nouveau vaccin recombinant Lactobacillus casei contre la DEP, qui peut stimuler des réponses immunitaires muqueuses, humorales et cellulaires plus fortes contre l'infection par le PEDV via une administration orale. Le PEDV, membre de la famille des coronaviridae, se compose de quatre protéines structurelles qui contiennent la protéine de pointe glycosylée (S) de 150 à 220 kDa, la protéine membranaire (M) de 20 à 30 kDa, la protéine d'enveloppe (E) de 7 kDa et 58 kDa. protéine de la nucléocapside (N) [12]. Là, la protéine S peut être divisée en domaines S1 (1 à 735 acides aminés) et S2 (736-dernier acide aminé) [13], et la protéine S1 comprend la région de liaison au récepteur et les principaux épitopes neutralisants [ 14]. L'adjuvant du vaccin agit comme un immunomodulateur et peut induire et renforcer des réponses immunitaires contre des antigènes co-administrés. Il a été vérifié que la protéine OMP16 de la souche Brucella abortus activait les cellules dendritiques in vivo, induisait une réponse immunitaire th1 et constituait un vaccin auto-adjuvant prometteur (15-17). Par conséquent, la protéine OMP16 a été insérée dans le vaccin recombinant Lacto bacillus case dans notre étude. Jusqu'à présent, peu d'études sur le vaccin recombinant Lactobacillus casei contre le PEDV ont été rapportées. Par conséquent, cette étude vise à construire un nouveau vaccin oral candidat Lactobacillus casei, qui peut fournir une meilleure immunité humorale, immunité cellulaire et immunité muqueuse pour empêcher la propagation de la DEP.

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Matériels et méthodes

Souches bactériennes, virus, conditions de culture, plasmides et amorces

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Les souches bactériennes, les plasmides et les amorces utilisés dans cette étude sont répertoriés dans le tableau 1. La souche de référence standard de Lactobacillus casei ATCC 393 a été cultivée dans un bouillon de Man Rogosa et Sharpe (MRS) à 37 degrés [18]. Les BL21 (DE3) et DH5 ont été cultivées dans du milieu Luria-Bertani (LB) à 37 degrés [19]. Les souches recombinantes de Lactobacil lus casei, BL21 (DE3) et DH5 ont été cultivées respectivement dans le milieu correspondant avec des antibiotiques appropriés. Brucella abortus a été cultivée dans un milieu Tryptic Soy Broth (TSB) ou Tryptic Soy Agar (TSA) (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) à 37 degrés. Les cellules Vero infectées par les souches PEDV ont été cultivées dans du DMEM (Gibco, Langley, VA, USA) additionné de 10 ug/mL de trypsine (Gibco, Langley, VA, USA) (20). Les plasmides pVE5523 et pET28a (+) étaient des vecteurs d'expression de Lactobacillus casei et Escherichia coli, respectivement.

Tableau 1 Caractéristiques des souches bactériennes, des plasmides et des amorces utilisés dans cette étude

La construction de souches recombinantes de Lactobacillus casei et BL21

Les plasmides d'expression recombinants ont été construits sur la base des plasmides et des amorces du tableau 1. Dans un premier temps, la séquence partielle du gène PEDV S (493 à 708 acides aminés), la séquence partielle du gène PEDV S (493 à 708 acides aminés), et la séquence partielle du gène OMP16 de Brucella abortus (26 à 168 acides aminés) ont été amplifiées à l'aide de paires d'amorces PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 et OMP16-F/R, respectivement. Par la suite, la méthode d'extension par chevauchement a été utilisée dans les fragments OMP16 et PEDVS pour construire un nouveau fragment OMP16-PEDVS avec le polypeptide de liaison (GGGGSGGGGGGGGGS) coincé au milieu. Ensuite, les fragments PEDVS ont été insérés dans le plasmide pET28a avec les enzymes de restriction EcoRI/XbaI pour générer le plasmide recombinant pET28a-PEDVS, et les nouveaux fragments OMP16-PEDVS ont été insérés dans les plasmides pET28a et pVE5523 avec EcoRI/XbaI et SalI/EcoRV. enzymes de restriction pour générer le plasmide recombinant pET28a-OMP16-PEDVS et pVE5523-OMP16-PEDVS, respectivement. Les plasmides recombinants (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS et pVE5523-OMP16-PEDVS) ont été transformés en BL21 (DE3) ou Lactobacillus casei ATCC393 par transformation ou électroporation basée sur l'article rapporté [21].

Analyse de l'expression des protéines par Western blot

L'expression protéique des souches BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS et L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS était détecté sur la base de la méthode rapportée avec quelques modifications [21-23]. Les souches recombinantes BL21-pET28a-PEDVS et BL21-pET28a OMP16-PEDVS ont été cultivées dans un bouillon LB et l'IPTG a été utilisé pour récolter pET28a-PEDVS et pET28a-OMP{{22} } Protéines PEDVS. Le vecteur blanc a été utilisé comme contrôle négatif. Après lyse cellulaire et centrifugation, le surnageant et le sédiment ont été collectés. Ensuite, les protéines cibles ont été purifiées à l’aide de la colonne de chromatographie d’affinité Nickel basée sur l’étude précédente (24). Pendant ce temps, le surnageant culturel de la souche recombinante L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS a également été récolté par centrifugation à 9 000 × g pendant 10 min à 4 degrés. Ensuite, les échantillons contenant le tampon de chargement de dodécylsulfate de sodium (SDS) ont été bouillis pendant 10 minutes. Les protéines ont été séparées par électrophorèse sur gel de polyacrylamide-dodécylsulfate de sodium à 12% (SDS-PAGE), puis transférées dans des membranes PVDF (Millipore, Mississauga, ON, Canada). Les membranes ont été bloquées avec du lait écrémé à 5 % pendant 2 h à 37 degrés, puis incubées avec un anticorps monoclonal murin de protéine S pendant la nuit à 4 degrés et des IgG anti-souris de chèvre conjuguées à la HRP (ABclonal, Wuhan, Chine) pendant 2 h à 37 degrés. Les bandes de protéines ont été visualisées à l'aide du substrat de transfert Clarity ™ Western ECL (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Immunisation et prélèvement d’échantillons

L'immunogénicité du vaccin recombinant Lactobacillus casei a été évaluée à l'aide de souris BALB/c femelles de six semaines exemptes d'agents pathogènes spécifiques (SPF) [10, 18], achetées au centre animalier de l'Université agricole de Shandong. Un total de 50 souris ont été réparties au hasard en 5 groupes de 10 souris dans chaque groupe. Les souris ont été immunisées avec le vaccin recombinant Lactobacillus casei et la protéine purifiée (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+adjuvant complet de Freund), respectivement. Le protocole de vaccination a été réalisé sur la base du tableau 2 et une vaccination de rappel a été administrée après 13 jours. Pour l'étude sérologique, le sérum a été collecté 0, 14 et 28 jours après la vaccination (dpi) par poinçonnage dans la veine caudale et conservé à -20 degrés jusqu'à utilisation. Les matières fécales ont été collectées un jour avant la vaccination et à chaque fois de rappel. Pour la détection des IgA, les matières fécales ont été diluées (p/v) avec de l'EDTA de sodium 0,05 M dans des rapports de 1:4 juste après la collecte et incubées pendant 14 h à 4 degrés après un mélange approprié. Le surnageant a été collecté par centrifugation de 12,000×g et conservé à - 20 degrés jusqu'à utilisation. Au 28ème dpi ; trois souris de chaque groupe ont été sacrifiées et l'intestin a été traité pour la détection des IgA selon l'auteur décrit précédemment [10, 18, 23].

Analyse de détermination des niveaux d'anticorps

Les niveaux d'IgG dans les sérums et d'IgA dans les selles ont été mesurés par les méthodes ELISA avec quelques modifications [18, 23]. Les méthodes étaient les suivantes : des plaques de microtitration en polystyrène ont été recouvertes pendant une nuit à 4 degrés avec 100 μL de protéine PEDVS à 10 ug/mL, de protéine OMP16-PEDVS ou 100 μL de souche recombinante de L. casei-OMP16-PEDVS. . Après blocage avec 5 % de lait écrémé, les échantillons collectés ont été dilués en série dans du PBS, ajoutés en triple et incubés à 37 degrés pendant 1 h. Ensuite, un anticorps IgG ou IgA anti-souris de chèvre conjugué à la HRP (Invitrogen, USA) a été ajouté à chaque puits (1: 5 000) et incubé pendant 1 heure à 37 degrés. Les plaques de microtitration en polystyrène ont été lavées 5 fois à chaque étape. Enfin, 100 µL de substrat TMB (tétraméthylbenzidine et H2O2) ont été ajoutés à chaque puits et 50 µL de solution d'arrêt ont été ajoutés après 10 minutes. Les valeurs de DO à 630 nm ont été mesurées à l'aide d'un lecteur de plaques multimode (EnVision).

Tests de neutralisation des virus

Les titres d'anticorps neutralisants du PEDV dans les sérums ont été examinés selon les méthodes avec quelques modifications (25, 26). En bref, le sérum murin a été inactivé par la chaleur (56 degrés pendant 30 min), puis dilué en série deux fois dans des plaques à 96 puits (Corning, USA) avec des triples de chaque échantillon. Ensuite, un volume égal de 200 souches TCID50/50 μL PEDV ont été ajoutés à des plaques à 96 puits et incubés pendant 1 h à 37 degrés. Le mélange a été ajouté à de nouvelles plaques à 96 puits recouvertes de monocouches de cellules Vero et incubé pendant 1 heure à 37 degrés. Les cellules ont ensuite été lavées et incubées dans le milieu d’entretien à 37 degrés dans 5 % de CO2. Après 2 jours, l'effet cytopathique (CPE) a été observé à l'aide d'un microscope inversé et la concentration d'encollage neutre a été définie comme la concentration la plus faible d'anticorps dans le sérum.

Tableau 2 Le protocole immunitaire des souris BALB/c

Détection des cytokines

Pour détecter la sécrétion de cytokines, des surnageants ont été obtenus auprès des souris de laboratoire (0, 14 et 28 jours). Les niveaux d'IL-4, d'IL-10 et d'IFN- sécrétés ont été déterminés à l'aide de kits ELISA commerciaux (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) conformément aux recommandations du fabricant, respectivement. La cytokine a été quantifiée à partir des différentes courbes étalons préparées à partir des réactifs standards fournis respectivement par les kits et la valeur de la densité optique (DO) a été détectée à 450 nm de chaque plaque à l'aide d'un lecteur de plaques multimode (EnVision) (23, 27).

analyses statistiques

Toutes les données ont été obtenues à partir d'au moins trois expériences indépendantes et les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± écart type (SD). L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de tests t bilatéraux et d'une analyse unidirectionnelle dans Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., États-Unis). La différence significative a été définie comme ∗ p < 0.05, et les différents degrés de différence significative ont été désignés comme ∗∗ p < 0.01, ∗∗∗ et p < 0,001, respectivement.

Résultats

La vérification des souches recombinantes de Lactobacillus casei et BL21

Pour vérifier les plasmides recombinants construits, les plasmides d'expression recombinants pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS et pVE5523-OMP16-PEDVS ont été digérés à l'aide d'enzymes de restriction NcoI/XhoI, et les les résultats de la digestion enzymatique ont été présentés sur la figure 1. Les tailles des bandes cibles dans les électrophorétogrammes étaient les mêmes que les résultats attendus et les résultats du séquençage ont indiqué que les plasmides d'expression recombinants ne présentaient aucune mutation. Ces résultats ont indiqué la construction réussie des plasmides recombinants pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS et pVE5523-OMP16-PEDVS. Les résultats du Western blot ont montré que les protéines recombinantes pET28a-OMP16-PEDVS et pET28a-PEDVS étaient exprimées dans le surnageant de BL21-pET28a OMP16-PEDVS et BL21- Souches pET28a-PEDVS, respectivement. La protéine pVE5523-OMP16-PEDVS a également été vérifiée dans le surnageant culturel de la souche L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS. Les bandes spécifiques de la figure 2 ont montré que les protéines recombinantes pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS et pET28a-PEDVS ont toutes été récoltées avec succès (Fig. 2).

Fig. 1 Les résultats de la digestion enzymatique de plasmides recombinants. R : Les résultats de la digestion enzymatique du plasmide pVE5523-OMP16-PEDVS. M : marqueur d’échelle d’ADN D8000 ; 1 : plasmide pVE5523-OMP16-PEDVS. B : Les résultats de la digestion enzymatique du plasmide pet28a-OMP16-PEDVS et pET28a-PEDVS. M : marqueur d’échelle d’ADN D8000 ; 1 : plasmide pet28a-OMP16-PEDVS ; 2 : plasmide pET28a-PEDVS

Les taux d'anticorps IgG dans le sérum de souris immunisées avec les vaccins candidats

Pour évaluer l’immunogénicité spécifique des candidats vaccins générés, des souris BALB/c ont été sélectionnées et divisées en 5 groupes. Ensuite, les niveaux d’IgG dans le sérum et d’IgA dans les selles ont été mesurés avec des kits ELISA commerciaux. Les résultats ont révélé qu’il n’y avait pas de différences substantielles dans les niveaux d’IgG parmi les groupes vaccinés et que presque aucun anticorps IgG n’était trouvé chez toutes les souris avant la vaccination. Cependant, des différences substantielles ont ensuite été constatées après la première vaccination et les taux d’anticorps IgG dans le sérum à 28 jours étaient plus élevés qu’à 14 jours. Parmi les souris du groupe 5, les souris immunisées avec L. casei-OMP16- PEDVS et BL21-OMP16-PEDVS-F ont présenté une immunogénicité similaire et la plus élevée. Par conséquent, L. casei-OMP16- PEDVS et BL21-OMP16-PEDVS-F pourraient produire l'immunogénicité la plus élevée, suivis par BL21-OMP16- PEDVS. et BL21-PEDVS (Fig. 3).

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Les niveaux d'anticorps IgA dans les selles de souris immunisées avec des vaccins candidats

Pour évaluer l'immunogénicité spécifique des candidats vaccins générés, les niveaux d'anticorps IgA dans les selles des souris ont également été évalués. Les résultats ont montré qu’il n’existait aucun anticorps IgA anti-PEDVS spécial avant la vaccination. Cependant, de grandes quantités d'anticorps IgA dans les selles de souris immunisées contre L. casei-OMP16-PEDVS BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS et BL21-Souris des groupes PEDVS 14 jours après l'immunisation. 28 jours après la vaccination, les niveaux d'anticorps IgA des souris immunisées contre L. casei-OMP16-PEDVS ont atteint leur maximum le plus élevé. Pendant ce temps, les niveaux d’anticorps IgA dans les trois autres groupes n’ont pas présenté d’augmentation évidente. Par conséquent, le vaccin candidat L. casei OMP16-PEDVS pourrait stimuler des taux d'anticorps plus élevés chez les souris immunisées par rapport à BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ Souris immunisées {18}}PEDVS et BL21- PEDVS (Fig. 4).

Fig. 2 Vérification des protéines d'expression recombinantes. M : marqueur protéique ; 1 : la protéine sécrétoire de la souche recombinante L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS ; 2 : la protéine purifiée de la souche BL21- pET28a-OMP16-PEDVS ; 3 : la protéine purifiée de la souche BL21-pET28a-PEDVS

Les taux d'anticorps neutralisants dans le sérum chez les souris immunisées

Évaluer l'effet protecteur des vaccins candidats contre L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS , et BL21-PEDVS chez la souris, les niveaux d'anticorps neutralisants ont été mesurés. Les résultats ont montré qu’aucun anticorps neutralisant n’a été détecté avant la vaccination. Des anticorps neutralisants ont été détectés 14 jours après la vaccination et ils ont augmenté 14 jours après la vaccination de rappel. La réponse en anticorps chez les souris ayant reçu L. casei-OMP16-PEDVS possédait une activité neutralisante anti-PEDV plus forte que celle chez les souris ayant reçu par voie orale du BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS et BL21-PEDVS. Par conséquent, le vaccin candidat L. casei OMP16-PEDVS pourrait stimuler le niveau d'anticorps neutralisants le plus élevé, suivi de BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS et BL21-PEDVS (Fig. 5).

Niveaux de cytokines

Pour comparer le niveau de réponse immunitaire cellulaire de L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, et les souris immunisées BL21-PEDVS, IL- 4, IL-10 et IFN- ont été déterminées, respectivement. Les résultats ont montré que les niveaux de cytokines IL-4, IL-10 et IFN- dans les sérums de souris étaient tous très faibles et ne présentaient aucune différence significative avant la vaccination. Alors que des changements similaires ont été observés dans les résultats de IL-4, IL-10 et IFN- . 14 jours après la vaccination, les niveaux d'IL-4, d'IL-10 et d'IFN- chez les souris L. casei-OMP16-PEDVS im immunisées étaient supérieurs à BL21- Souris immunisées OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS et BL21-PEDVS. 14 jours après la vaccination de rappel, un taux plus élevé d'IL-4, d'IL-10 et d'IFN chez les souris immunisées contre L. casei-OMP16- PEDVS a été détecté par rapport à celui d'autres trois groupes. Par conséquent, le vaccin candidat L. casei-OMP16-PEDVS pourrait stimuler les niveaux d'IL-4, d'IL-10 et d'IFN les plus élevés, suivis de BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS et BL21-PEDVS (Fig. 6).

Fig. 3 Niveaux d'anticorps IgG des vaccins candidats dans le sérum de souris immunisées. Le sérum a été collecté les jours 0, 14 et 28 jours avant ou après la vaccination, examiné via des kits ELISA commerciaux et mesuré à une absorbance de 450 nm. Les barres représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. * p < 0.05, ** p < 0,01 et **** p < 0,0001 représentent respectivement des degrés croissants de différences significatives, et ns signifie aucune différence significative

Discussion

Une épidémie à grande échelle de DEP causée par des variantes du PEDV s'est produite en octobre 2010, entraînant d'énormes pertes économiques en Chine et dans le monde entier [1]. Cependant, les vaccins traditionnels sont tous conçus sur la base de la souche classique CV777 qui ne peut pas fournir une protection suffisante contre la variante PEDV [4]. Pour contrôler la propagation du PEDV et réduire les pertes économiques, de nouveaux vaccins contre les souches variantes du PEDV sont également conçus. À l’heure actuelle, le vaccin inactivé contre le PEDV et le vaccin atténué contre les souches variantes du PEDV sont tous approuvés par le gouvernement chinois et présentent tous des perspectives prometteuses dans le contrôle de la DEP. Mais des défauts existent également dans les deux types de nouveaux vaccins. Le PEDV infecte les porcs par le tube digestif et présente un tropisme du tissu intestinal. Par conséquent, l’immunité muqueuse est plus efficace que l’immunité systémique pour empêcher l’entrée du PEDV dans les cellules épithéliales intestinales, et les vaccins doivent assurer une protection efficace des muqueuses dans le tractus intestinal. Ainsi, dans cette étude, nous construisons un nouveau type de vaccin capable de stimuler des anticorps IgG et IgA anti-PEDV spécifiques plus puissants. Lactobacillus casei possède des propriétés immunomodulatrices potentielles en tant que véhicule d'administration de vaccins et l'expression de composés bioactifs sur la paroi cellulaire de cette bactérie peut stimuler des réponses immunitaires appropriées (28, 29). Il est largement utilisé pour exprimer plusieurs antigènes hétérologues du virus du papillome humain, de Streptococcus pneumonia et d'Escherichia coli en tant que vaccins dans des modèles animaux, qui ont tous montré une excellente immunogénicité [7-9]. Comparé au vaccin inactivé et au vaccin atténué, le vaccin vectoriel Lactobacillus casei peut également stimuler des taux d'IgA plus élevés et une réponse immunitaire cellulaire. Des études ont montré que la première ligne de défense des IgA dans l'intestin serait meilleure que les IgG pour protéger les porcelets contre l'infection par le PEDV [10, 30]. Par conséquent, il est prometteur de développer une sorte de vaccin vecteur Lactobacillus casei contre la DEP. Sur la base des rapports, la protéine S du PEDV peut être divisée en domaines S1 (1 à 735 acides aminés) et S2 (736-dernier acide aminé) [13], et la protéine S1 comprend la région de liaison au récepteur et le principaux épitopes neutralisants [14]. L'épitope neutralisant central (COE) peut induire de puissants anticorps neutralisants contre le PEDV (31, 32). En combinaison avec l'analyse d'antigénicité, une séquence partielle du gène S1 (1 477 à 2 124 pb) a été sélectionnée pour construire le plasmide recombinant. Il a été prouvé que le petit fragment sélectionné possède non seulement une bonne immunogénicité, mais contribue également à l'expression sécrétée de Lactobacillus casei. D’autre part, Pasquevitch a découvert que la protéine 16 de la membrane externe de Brucella abortus pouvait activer les cellules dendritiques in vivo, induisait une réponse immunitaire th1 et constituait un vaccin auto-adjuvant prometteur contre la brucellose acquise systémique et orale [15]. Des recherches similaires ont porté sur la protéine omp16 non lipidée de la membrane externe de Brucella spp. car un adjuvant nasal pouvait induire une réponse immunitaire th1 et moduler la réponse allergique th2 aux protéines du lait de vache a également été prouvé [16]. Par conséquent, une séquence partielle du gène omp16 a été choisie pour construire un plasmide recombinant afin de renforcer la fonction immunitaire dans notre étude. Pour savoir si le nouveau vaccin recommandé par Lactobacillus casei pouvait induire des réponses immunitaires humorales, les niveaux d'IgG, d'IgA et d'anticorps neutralisants ont été mesurés. Le niveau d'anticorps IgG des souris immunisées avec le vaccin recombinant L. casei-OMP16- PEDVS n'avait pas de différence significative avec celui des souris immunisées avec le vaccin recombinant BL21-OMP16-PEDVS-F. Cependant, les niveaux d'IgA et d'anticorps neutralisants étaient supérieurs à ceux de BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S et BL{{47 }}Souris imisées par le vaccin recombinant PEDVS. Les résultats ont montré que L. casei-OMP16-PEDVS pouvait induire des réponses immunitaires humorales plus fortes, en particulier des niveaux d'anticorps IgA. Des études ont montré que les IgA constituent la première ligne de défense de l’intestin et seraient meilleures que les IgG pour protéger les porcelets contre l’infection par le PEDV [30]. La recherche a également vérifié le résultat selon lequel le vaccin recombinant L. casei-OMP 16-PEDVS pourrait fournir une meilleure protection immunologique au PEDV. Pour explorer le type de réponse immunitaire induite par L. casei-OMP16-PEDVS recombinant, les niveaux d'IL-4, d'IL-10 et d'IFN- ont été détectés pour évaluer l'activité de T lymphocytes. D'après le rapport, l'IFN- joue un rôle important dans la réponse immunitaire cellulaire provoquée lorsque des agents pathogènes envahissent le corps, l'IL-4 joue un rôle important dans la réponse immunitaire humorale et favorise la tolérance immunitaire et l'immunité des muqueuses [33], IL. -10 joue un rôle essentiel dans la lutte contre l'infection microbienne de la muqueuse et dans le maintien de l'intégrité de la barrière muqueuse dans l'intestin (34). Parallèlement, les résultats de la détection des cytokines ont montré que les souris immunisées avec le vaccin recombinant L. casei-OMP16-PEDVS pourraient induire une expression plus forte de l'IL-4, de l'IL-10 et de l'IFN-, ce qui ont corroboré les résultats selon lesquels le vaccin recombinant L. casei-OMP16-PEDVS pourrait induire une réponse immunitaire humorale, un niveau d'anticorps IgA et une réponse immunitaire cellulaire plus forts, respectivement.

Fig. 5 Niveaux d'anticorps neutralisants des vaccins candidats dans le sérum de souris immunisées. Le sérum a été collecté les jours 0, 14 et 28 jours avant ou après la vaccination et examiné via un test de neutralisation. Les barres représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. * p < 0.05, ** p < 0,01 et **** p < 0,0001 représentent respectivement des degrés croissants de différences significatives, et ns signifie aucune différence significative. différence

Fig. 6 Détection des niveaux de cytokines à partir du sérum de souris immunisées. Le sérum a été collecté les jours 0, 14 et 28 jours avant ou après la vaccination et examiné via des kits ELISA commerciaux. La valeur d'absorbance a été mesurée à une absorbance de 450 nm pour IL-4 (a), IL-10 (b) et IFN- (c), respectivement. Les barres représentent la moyenne ± écart type de trois expériences indépendantes. * p < {{10}},05, ** p < 0,01 et **** p < 0,0001 représentent respectivement des degrés croissants de différences significatives

Conclusion

En résumé, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS et BL{{7 }}Des vaccins candidats PEDVS ont été construits dans cette étude. Parallèlement, les niveaux de réponse immunitaire humorale et cellulaire de ces vaccins candidats chez la souris ont été évalués. Les résultats ont montré que les souris immunisées avec L. casei-OMP16-PEDVS pouvaient produire des niveaux plus élevés d'IgG, d'IgA, d'anticorps neutralisants, d'IL-4, d'IL- 10 et d'INF- par rapport à les souris immunisées avec BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS et BL21-PEDVS. Par conséquent, le vaccin candidat recombinant contre L. casei OMP16-PEDVS peut jeter les bases du développement d'un vaccin muqueux recombinant sûr, efficace et pratique pour la prophylaxie de l'infection par le PEDV.

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