Partie 1 : Effets anti-inflammatoires, antioxydants, hydratants et antimélanogénèse de la quercétine 3-O- -D-glucuronide dans les kératinocytes humains et les cellules de mélanome via l'activation des voies NF-κB et AP-1

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Résumé: QuercétineLe 3-O- -D-glucuronide(Q-3-G), le conjugué glucuronide de la quercétine, a été signalé comme ayantanti-inflammatoirepropriétés dans les macrophages stimulés par les lipopolysaccharides, ainsi que des propriétés anticancéreuses et antioxydantes. Contrairement à la quercétine, qui a été largement décrite comme possédant un large éventail d'activités pharmacologiques, y compris des effets protecteurs de la peau, les avantages pharmacologiques et les mécanismes de Q-3-G dans la peau restaient à élucider. Cette étude s'est concentrée sur la caractérisation des propriétés protectrices de la peau, y compris les propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes, de Q-3-contre le stress oxydatif induit par les UVB ou H2O2-, les effets d'hydratation etantimélanogénèseactivités utilisant des kératinocytes humains (HaCaT) et des cellules de mélanome (B16F10). Q-3-G a régulé à la baisse l'expression du gène pro-inflammatoire et des cytokines telles que la cyclooxygénase-2 (COX-2) et le facteur de nécrose tumorale (TNF)- dans HO ou UVB- cellules HaCaT irradiées. Nous avons également montré que les O-3-Gexhibits ont un effet antioxydant en utilisant des tests de piégeage des radicaux libres, la cytométrie en flux et une expression accrue du facteur 2 lié au facteur nucléaire érythroïde 2- (Nrf2). Q-3-G a réduit la production de mélanine dans les cellules B16F10 induites par l'hormone de stimulation des mélanocytes (-MSH). Les effets et les mécanismes d'hydratation de Q-3-G ont été examinés en évaluant les gènes liés au facteur hydratant, tels que la transglutaminase-1(TGM-1), la filaggrine(FLG) et l'acide hyaluronique synthase (A)-1. De plus, Q-3-G a augmenté la phosphorylation de c-Jun, Jun N-terminal kinase (JNK), Mitogen-activated protein kinase (MAPK) kinase 4(MKK4) et TAK1, impliqué dans les MAPK/AP -1 et la phosphorylation de IkB , IkB kinase(IKK)- , Akt et Src, impliquées dans la voie NF-kB. Pris ensemble, nous avons démontré que Q-3-G exerce des propriétés anti-inflammatoires, antioxydantes, hydratantes et antimélanogénèse dans les kératinocytes humains et les cellules de mélanome par les voies NF-kB et AP-1.

Mots clés: quercétine 3-O- -D-glucuronide ; protection UV ; hydratant; antimélanogénèse; PA-1 ; NF-kB

1. Introduction

La peau, le plus grand organe du corps, offre une barrière qui joue un rôle majeur dans la protection du corps contre l'environnement extérieur et les facteurs nocifs tels que les rayons ultraviolets, les microbes infectieux et les produits chimiques nocifs. Cette barrière régule également l'équilibre électrolytique et la température du corps et prévient la perte d'humidité [1,2]. La peau humaine est composée de trois couches : l'épiderme, le derme avec ses phanères et le tissu sous-cutané [3]. La couche épidermique joue un rôle important dans le maintien de la température corporelle.

Les kératinocytes, composant abondant de l'épiderme cutané, interagissent étroitement entre eux par l'intermédiaire de desmosomes et de jonctions serrées qui permettent une barrière physicochimique efficace[4]. Bien que la peau fonctionne comme une barrière protectrice, le rayonnement ultraviolet (UV) a un effet significatif sur la plupart des cellules, y compris les kératinocytes, la couche externe de la peau. Le rayonnement UV peut provoquer le vieillissement cutané, des lésions cutanées, des rides et une hyperpigmentation, qui est considérée comme l'un des facteurs de risque les plus critiques [5]. La lumière UV se compose de trois gammes de longueurs d'onde : UVA (320-400 nm), UVB (280-320 nm) et UVC (200-280 nm). Outre le peroxyde d'hydrogène (H2O2), qui est connu pour contribuer au stress oxydatif, les UVB peuvent conduire à la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) par l'activation d'enzymes génératrices de ROS [6]. L'accumulation incontrôlée de ROS dans les cellules, y compris les kératinocytes, a été décrite comme provoquant des modifications oxydatives des lipides, des protéines, des acides nucléiques et d'autres molécules intracellulaires qui conduisent par la suite à divers types de lésions cutanées et de processus liés au vieillissement tels que la mort cellulaire, le stress oxydatif, et inflammation [7,8]. De plus, la réponse au stress oxydatif est connue pour influencer les dommages de divers composants cellulaires [9]. Les cellules cutanées endommagées peuvent également entraîner des réponses inflammatoires, entraînant des lésions cutanées chroniques [10]. L'expression de gènes inflammatoires tels que la cyclooxygénase-2 (COX-2) et les cytokines pro-inflammatoires est un type de dommages cutanés provoqués par les UVB ou H2O2-par des processus biologiques. Par conséquent, le développement d'effets protecteurs de la peau plus sûrs, plus robustes et plus efficaces est essentiel pour prévenir et bloquer les maladies associées aux dommages cutanés induits par les UVB ou le H2O2.

L'hydratation de la peau joue également un rôle important dans le maintien de sa fonction normale. En particulier, la couche cornée (SC) a un effet protecteur contre la perte d'eau [12]. La teneur en eau du stratum corneum participe à la desquamation et à la bonne maturation de la peau, alors qu'une eau insuffisante dans le SC favorise l'accumulation et le dysfonctionnement des cornéocytes [12,13]. Aux stades finaux de la différenciation des kératinocytes, sa membrane plasmique et ses organites cellulaires disparaissent, puis l'influx de calcium induit la transglutaminase (TGM) pour la réticulation avec d'autres protéines. Une déficience ou une perte de TGM-1 conduit à une réticulation défectueuse de l'enveloppement cellulaire. L'ichtyose lamellaire est un exemple de maladie causée par une perte de TGM-1. De plus, la filaggrine (FLG), la matrice de kératine formée, joue un rôle dans la formation de SC car elle agit comme un échafaudage pour lier les protéines et les lipides de l'enveloppe cornée [14] en catalysant les réactions de réticulation de la g-glutamyl lysine, les ATGM et la membrane -enzymes associées, conférant une intégrité aux CS [15]. De plus, l'acide hyaluronique (HA) est un type de facteur d'humidité naturel (NMF) impliqué dans la rétention d'humidité dans la peau et présente un profil distinct dans le vieillissement intrinsèque de la peau, est un agent d'administration de médicaments et est un composant important de la matrice extracellulaire. [16,17]. L'HA joue un rôle dans l'augmentation de l'hydratation de la peau en régulant les gènes de l'acide hyaluronique synthase (HAS) ; de plus, l'acide rétinoïque (vitamine A) peut réguler efficacement l'AH dans l'épiderme [17]. TGM-1, FLG et HAS-12,3 sont des gènes associés à la production de NMF [18]. De plus, l'activation de facteurs de transcription tels que la protéine activatrice-1(AP-1) et le facteur nucléaire (NF)-kB sont impliqués dans la production de substances pro-inflammatoires qui optimisent la barrière cutanée et l'hydratation cutanée par les voies AP-1 et NF-kB[19]. Les enzymes de signalisation en amont dans la voie AP -1 comprennent les protéines kinases activées par les mitogènes (MAPK) telles que la kinase N-terminale c-Jun (JNK), la kinase régulée par le signal extracellulaire (ERK) et p38, tandis que Src, Akt, IkB -kinase (IKKo/ ) et KBO(IkBa) appartiennent à la voie NF-KB [20. La peau produit également de la mélanine dans la couche épidermique, en particulier dans les mélanocytes, principale source de mélanine, qui contribuent à la détermination de la couleur de la peau et à la mélanogénèse [21]. L'irradiation UVB et l'hormone stimulant les mélanocytes (o-MSH) peuvent stimuler la sécrétion de mélanine, déclenchant ainsi la mélanogénèse [22. Au cours de la mélanogenèse, -MSH active la protéine kinase A (PKA), le facteur de transcription associé à la microphtalmie protéique (MITF) et la liaison à l'élément de réponse à l'AMPc (CREB) [23]. L'une des fonctions de la mélanine est considérée comme la prévention des dommages cutanés par les UV, y compris au soleil. Cependant, la production excessive de mélanine ou l'absence de teneur en mélanine causée par le vieillissement, l'hormone stimulant les mélanocytes et l'exposition aux UV favorise les taches de rousseur, le mélasma, les lentigos séniles et d'autres troubles d'hyper/hypopigmentation qui pourraient avoir un impact négatif sur l'apparence et la peau. santé [24]. Ainsi, le contrôle de la mélanogénèse est également souhaité pour maintenir à la fois la santé et l'apparence esthétique du corps humain.

Quercétineest un flavonoïde de type flavonol alloué prédominant présent dans les légumes, les fruits, les boissons et les plantes médicinales [25]. Par conséquent, la quercétine a été largement étudiée pour posséder des avantages pharmacologiques, notamment anti-inflammatoires, anti-athérosclérotiques,antioxydant, anticancéreuses et protectrices de la peau, et est liée à la mélanogénèse [24,26-29]. Cependant, plusieurs travaux utilisant des méthodes sensibles et fiables ont démontré que la quercétine n'a pas été détectée dans le plasma [30-33] et est peu présente dans le cerveau [34,35]. La quercétine, qui se présente généralement sous forme de glycoside, est bien absorbée et principalement hydrolysée et métabolisée dans l'intestin grêle, le côlon, le foie et les reins en métabolites conjugués [30,36-38]. Seuls les métabolites conjugués tels que le glucuronide ou le sulfate (méthylé ou non méthylé, respectivement), plutôt que la quercétine aglycone ou ses glycosides, sont détectés dans le sang circulant. Le 3/-méthyl-quercétine-3-glucuronide, la quercétine-3-glucuronide et le quercétine-3'-sulfate ont été identifiés comme les principaux métabolites plasmatiques après 1,5 heure de consommation d'oignons frits[30, 32]. Ces métabolites de la quercétine sont formés dans l'intestin grêle et le foie par des enzymes de biotransformation, notamment les UDP-glucuronyltransférases, à la suite d'un métabolisme de phase II [29,39,40]. Il a également été signalé que les métabolites conjugués de la quercétine s'accumulent dans le plasma humain dans la plage de concentration de 10- 'à 10- degré M après l'ingestion périodique d'oignons avec les repas pendant 1 semaine [41]. La demi-vie des métabolites de la quercétine est assez élevée, de l'ordre de 11 à 28 h [29]. Ces composés ayant été observés comme les principales formes de métabolites conjugués de la quercétine, des études portant sur l'activité biologique des flavonols utilisant ces métabolites conjugués seraient indispensables, ce qui nous a incités à étudier l'activité biologique d'un des métabolites conjugués de la quercétine. La quercétine 3-O- -D-glucuronide(Q-3-G)(Figure 1) [31,35,40,42,43], qui peuvent générer des activités similaires, plus fortes ou plus faibles par rapport aux composés parents dans différents modèles. Le Q-3-G est transporté vers les tissus cibles via le plasma pour exercer son activité biologique [39]. O-3-G s'est également avéré être un métabolite efficace dans le plasma de rat après administration orale de quercétine [43]. Dans d'autres études, le métabolite contenant du Q-3-G s'est accumulé dans l'aorte après l'administration d'aliments riches en quercétine et a été identifié comme un principe actif détecté dans le sang humain allant de 0.{{48} } μM【44】. De plus, Q-3-G peut être trouvé dans le vin [45] et dans les plantes médicinales telles que Hypericum hirsutum, Nelumbo nucifera, Oenothera biennis et les haricots verts [46-49].Q-3-G a été décrit comme un composant anti-inflammatoire dans des conditions stimulées par le LPS et a montré des propriétés antioxydantes dans le plasma sanguin [50-52]. Cependant, par rapport à la longue histoire d'application et à la vaste étude de la quercétine, l'étude de Q-3-G reste à explorer. Par conséquent, Q-3-G a été choisi comme représentant des métabolites de la quercétine en tant que joueur actif in vivo de la quercétine. De plus, le rôle de Q-3-G sur les effets protecteurs de la peau n'a pas encore été complètement élucidé. Dans cette étude, à l'aide de diverses évaluations in vitro, nous avons étudié les effets protecteurs de la peau de Q-3-G contre le stress oxydatif et l'inflammation induits par UVBor H2O2-, l'hydratation de la peau dans HaCaT (une lignée cellulaire de kératinocytes humains) cellules et activité antimélanogenèse dans les cellules B16F10 (une lignée cellulaire de mélanome murin).

2. Résultat

2.1.Effets anti-inflammatoires et antioxydants du Q-3-G contre les UVB ou H2O2-Cellules HaCaT stimulées

Les tissus cutanés peuvent être endommagés par les rayons UV. Le rayonnement UV active plusieurs facteurs nocifs, notamment le stress oxydatif, la mort cellulaire apoptotique, l'inflammation et le vieillissement cutané. Afin de déterminer les activités UVprotectrices de Q-3-G, nous avons d'abord évalué si Q-3-G avait des effets sur la viabilité cellulaire des kératinocytes humains. À l'aide d'un dosage de 3-(4-5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl-243 bromure de tétrazolium (MTT), nous avons étudié les effets cytotoxiques de O-3-G dans les cellules HaCa. Comme le montre la figure 2a, il n'y avait aucune interférence significative sur la viabilité cellulaire à une concentration de 2.5-20 uM par Q-3-G, ce qui indiquait que O-3-G ne présentait aucune cytotoxicité jusqu'à 20 μM et n'endommageait pas les kératinocytes, la couche superficielle des cellules de la peau. Ensuite, nous avons évalué les effets protecteurs de la peau du Q-3-G dans les cellules HaCaT exposées aux UVB. Après irradiation UVB à 30 mJ/cm², Q-3-G a protégé de manière significative les cellules HaCaT de la mort cellulaire induite par les UVB d'une manière dépendante de la concentration (Figure 2b). En accord avec le test MTT, en utilisant une caméra connectée à un microscope pour capturer la morphologie des cellules HaCaT, Q -3- G protégé contre la mort cellulaire due aux cellules HaCaT irradiées aux UVB jusqu'à une concentration de 10 μM (Figure 2c) . Le nombre de cellules HaCaT dans chaque condition était de 482 pour le groupe non traité, 91 pour le groupe UVB 30 mJ/cm, 276 pour le groupe UVB 30 mJ/cm²plus 5μM O-3-G et 320 pour le groupe UVB 30 mJ/cm² plus 10 μM Q-3-G Group (Figure 2d). Ces résultats ont confirmé que Q-3-G inhibe les dommages HaCaT induits par les UVB et sauve l'effet protecteur de la peau de l'irradiation UVB.

L'apparition et l'exacerbation de l'inflammation dans le corps activent parfois les macrophages et libèrent certaines cytokines. L'inflammation est une caractéristique du stress oxydatif. Nous avons étudié l'effet anti-inflammatoire du Q-3-G contre l'inflammation induite par les UVB ou le HO2-. Il est bien connu que les UVB peuvent favoriser les dommages à l'ADN et l'inflammation des cellules de la peau 【10】. Nous avons irradié les cellules HaCaT avec UVB 30 mJ/cm² et incubé les cellules HaCaT avec H2O2 (500 uM). Nous avons utilisé un test PCR en temps réel pour vérifier l'expression de l'ARNm de l'enzyme inflammatoire COX-2 et de la cytokine pro-inflammatoire TNF-. Comme le montrent les résultats de la figure 2e, f, une concentration de 10 μM de O-3-G inhibe de manière significative l'expression de l'ARNm de COX-2 et de TNF-. Par conséquent, Q-3-G a supprimé les réponses inflammatoires induites dans les cellules HaCaT après exposition à une irradiation UVB ou H2O2.

Nous avons utilisé des tests de piégeage des radicaux 2,2'-azinobis-(3-éthylbenzothiazoline-6-acide sulfonique)(ABTS) et 2,2-diphényl-lpicrylhydrazyl(DPPH) - des systèmes modèles largement utilisés pour étudier les activités de piégeage in vitro de composés naturels - pour évaluer la propriété antioxydante de Q-3-G à différentes concentrations. Les cellules HaCaT ont été traitées avec Q-3-G de manière dépendante de la concentration à partir de 2,5-40 μM en présence de DPPH, et le résultat a montré une activité de piégeage significative à plus de 2,5 μM (Figure 2g) . Le test ABTS a également démontré de manière significative les effets de Q-3-G sur le piégeage des radicaux libres de manière dépendante de la concentration avec une valeur IC50 de 1,75 μM (Figure 2h). L'acide ascorbique (AA), en tant que contrôle positif, a montré les effets antioxydants les plus importants dans les tests DPPH et ABTS. Il a été rapporté que le facteur 2 (Nrf2) lié au facteur nucléaire érythroïde 2-, l'un des gènes dépendant de l'élément de réponse antioxydant (ARE), régule les oxydoréductases protectrices et ses substrats nucléophiles, favorisant ainsi les enzymes antioxydantes pour éliminer les dommages et réparer systèmes [53]. Ensuite, nous avons examiné le niveau d'expression de Nrf2 dans les cellules HaCaT irradiées aux UVB. Renforçant les résultats ci-dessus, O-3-G a considérablement amélioré le niveau d'expression de Nrf2 lors de l'irradiation UVB par rapport au contrôle d'une manière dépendante de la concentration, jusqu'à 10 uM (Figure 2i), ce qui impliquait que Q-3- G présente un effet antioxydant à la fois chimiquement et biologiquement avec une propriété de piégeage des radicaux libres et augmente l'effet protecteur de la signalisation ARE dépendante de Nrf2-, respectivement. En outre, nous avons également effectué une cytométrie en flux ROS en utilisant du diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFDA) dans des conditions UV. L'antioxydant est largement connu pour supprimer les facteurs de stress cellulaires en inhibant la production de ROS [54]. Le résultat a montré que le traitement avec Q-3-G à des concentrations de 5 et 10 μM diminuait le niveau de ROS induit par les UVB (Figure 2j). Prises ensemble, ces données impliquent que Q-3-Gexert possède des propriétés protectrices de la peau telles que des effets anti-inflammatoires et antioxydants contre H2O, ou un stress oxydatif induit par les UVB et une inflammation dans les cellules HaCaT.

2.2.Effet antimélanogénèse dans B16F10 et effet hydratant dans les cellules HaCaT de Q-3-G

Pour examiner les effets de l'O-3-G sur la mélanogenèse, les cellules de mélanome ont été traitées avec -MSH pendant 48 h pour sécréter de la mélanine dans les cellules B16F10. En utilisant des tests MTT, nous avons d'abord confirmé que Q -3- G n'avait aucune cytotoxicité dans les cellules B16F10 à des concentrations allant jusqu'à 20 μM pendant 48 h (figure 3a). Ce résultat a montré, pour les évaluations suivantes, que les effets de O-3-G dans B16F10 n'étaient pas dus à la mort cellulaire. Ensuite, nous avons évalué B16F10 avec Q-3-Gand -MSH pendant 48 h pour déterminer les effets de Q-3-G sur la mélanogénèse. Comme le montre la figure 3b, Q-3-G a inhibé de manière significative la sécrétion de mélanine. L'arbutine témoin positif a également diminué de manière significative la sécrétion de mélanine.

La molécule liée à l'hydratation de la peau est l'acide hyaluronique (HA). Comme mentionné précédemment, HA, distribué dans tout l'épiderme et le derme, est un NMF qui améliore l'hydratation de la peau [55]. Nous avons utilisé un test PCR de transcription inverse (RT-PCR) pour examiner le niveau de transcription de HAS-1 après 12 h avec une concentration de Q-3-G allant jusqu'à 30 uM. L'HAS favorise l'accumulation d'AH de taille intermédiaire au sein des kératinocytes [12]. Comme le montre la figure 3c, l'expression de HAS-1 a été augmentée par un traitement avec Q-3-G jusqu'à 10 μM. En plus du facteur d'hydratation, nous avons également examiné l'expression de FLG et TGM{{ 13}}. Nous avons utilisé le rétinol comme groupe témoin positif. Les niveaux de transcription de FLG et de TGM-1 ont augmenté de manière notable après un traitement avec Q-3-G à des concentrations allant jusqu'à 10 μM (Figure 3d). Ces résultats suggèrent que Q-3-G a une activité hydratante de la peau dans les cellules HaCaT. De plus, en utilisant SB203580 (inhibiteur de p38), SP600125 (inhibiteur de JNK), UO126 (inhibiteur de ERK) et Bay 11-7082 (inhibiteur de NF-kB), nous avons examiné l'implication des voies de signalisation MAPK et NF-kB dans l'hydratation facteur de cellules HaCaT traitées Q-3-G. Sur la base de l'expression génique induite par O-3-G, les niveaux de TGM-1 et de FLG ont été réduits par le traitement avec SP600125, un inhibiteur de JNK (Figure 3e), ce qui suggère que JNK est nécessaire pour augmenter l'expression de TGM-1 et FLG en termes d'effet hydratant de la peau de O-3-G. De plus, l'expression de FLG a également été diminuée par Bay11-7082, un inhibiteur de IKK et IkB, suggérant que le mécanisme pharmaceutique de Q-3-G pourrait également appartenir à la voie de signalisation NF-kB.

2.3. Voies de signalisation liées à l'hydratation de Q-3-G via l'activation de AP-1 et NF-kB

Sur la base des résultats d'ARNm précédents, nous avons émis l'hypothèse que l'implication de la signalisation AP-1 et NF-kB sur l'effet d'hydratation de Q-3-G peut également se produire dans les niveaux de protéines. À l'aide d'un test Western blot, nous avons examiné la phosphorylation des molécules en amont de l'AP-1 et du NF-kB. Premièrement, dans la voie AP-1, la phosphorylation de c-Jun a été augmentée après incubation de cellules HaCaT avec Q-3-G pendant 24 h (Figure 4a). Le niveau de p-INK a également été augmenté après traitement avec Q-3-G à des concentrations de 2,5, 5 et 10 μM. La forme totale de JNK est restée inchangée (Figure 4b). Nous avons en outre examiné la phosphorylation de MKK4 et TAK-1, qui sont des régulateurs en amont de JNK. Comme le montre la figure 3c, après le traitement des cellules HaCaT avec O-3-G, les taux de protéines de p-MKK4 et de p-TAK1 ont également été régulés à la hausse.

En plus de la signalisation NF-kB, Q-3-G a augmenté la phosphorylation de p50 et p65, une sous-unité de NF-kB (Figure 4c). De plus, nous avons évalué l'activation d'IKK et d'IkBa, qui ont également été augmentées de Q-3-G jusqu'à 10 uM par rapport au groupe témoin (Figure 4d). Finalement, nous avons déterminé l'activation des molécules en amont impliquées dans la voie de signalisation NF-kB. La phosphorylation de Src et Akt (Ser473) a été améliorée par le traitement O-3-G (Figure 4e). Dans l'ensemble, ces données indiquent que les effets de protection de la peau de Q-3-G ciblent l'activation de TAK1 et Src en augmentant le niveau de protéines, régulant ainsi à la hausse l'activité de AP-1 et NF-kB, respectivement.

2.4.Effets de Q-3-G sur l'activation transcriptionnelle de AP-1 et NF-kB

Nous avons étudié la cytotoxicité cellulaire de Q -3- G dans les cellules HEK293T de la lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine par un test MTT (Figure 4f). La viabilité des cellules HEK293T n'a pas été significativement affectée après le traitement avec Q-3-G（2.5-20 μM） par rapport aux cellules non traitées.

Nous avons utilisé un test de luciférase pour déterminer si Q-3-G pouvait moduler les tests de promoteur NF-kB et AP-1. Nous avons confirmé que l'O-3-G augmentait l'activité de la luciférase médiée par l'AP-1- (Figure 4g) et l'activité de la luciférase médiée par le NF-kB (Figure 4h) d'une manière dépendante de la concentration. Ces résultats confirment que l'activation AP-1 et l'activation NF-KB sont des cibles pharmacologiques importantes de Q-3-G.

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