PARTIE 1 : Les extraits de Cistanche améliorent la neurotoxicité induite par le peroxyde d'hydrogène dans de nouveaux modèles cellulaires de neuroblastome transfectés par DJ‐1‐mutant

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1. INTRODUCTION

Les principales maladies neurodégénératives comprennentAlzheimermaladie, la maladie de Parkinson (MP), la maladie de Huntington et autres. Parmi ces troubles, le taux d'incidence de la MP(la maladie de Parkinson) est deuxième au monde et atteint 1 à 2 % chez les personnes de plus de 60 ans (Burke & O'Malley, 2013 ; Mullard, 2017 ; Shen & Ji, 2013). En tant que caractéristique neurologique majeure de la MP, les neurones dopaminergiques de la substantia nigra pars compacta sont dégénératifs progressifs (Glizer & MacDonald, 2016), ce qui s'accompagne de l'apparition d'inclusions de ‐synucléine appelées corps de Lewy (Zhang, An, Zhang, & Pu , 2010). Dans la pathogenèse de la MP, les tremblements de repos, la rigidité, la bradykinésie et les anomalies posturales sont diagnostiqués comme les principaux symptômes de la MP en clinique. Bien que les mécanismes exacts de dégénérescence progressive des neurones dopaminergiques ne soient pas compréhensibles, soit les causes environnementales, y compris l'exposition aux insecticides, aux agents neurotoxiques et aux métaux lourds, soit les causes génétiques telles que les mutations de Parkin (Kitada et al., 1998), ‐synucléine (Polymeropoulos et al., 1997) et DJ‐1 (Biosa et al., 2017 ; Bonifati et al., 2003), seraient à l'origine de la survenue de la MP. À ce jour, le nombre de mutations faux-sens, de mutations de décalage de cadre et de délétions de grands fragments causées par des mutations du gène DJ-1 dépasse 10 (Andres-Mateos et al., 2007 ; Bonifati et al., 2003 ; Hague et al., 2003). Au sein de la protéine DJ‐1, la substitution de Leucine166Proline (L166P) ressort comme importante. De plus, il a également été démontré que le stress oxydatif se produit dans la MP (Dexter et al., 1989, 1994 ; Nikam, Nikam, Ahaley et Sontakke, 2009) et est impliqué dans sa pathogenèse (Hague et al., 2003).

Le gène DJ-1 contenant huit exons répartis sur 24 kb, se localise sur le chromosome 1p36 chez l'homme (Bonifati et al., 2003) et code pour une protéine hautement conservée contenant 189 acides aminés. La protéine appartenant à la famille ThiJ/PfpI, existe sous une forme homodimère. Les cellules gliales du cortex et de la substantia nigra et du striatum sont les principales trouvées dans les zones de la protéine DJ‐1 (Olzmann et al., 2007). Dans ces cellules, DJ‐1 joue les rôles suivants, tels que l'oncogène (Nagakubo et al., 1997), la régulation transcriptionnelle (Kim et al., 2005 ; Niki, Takahashi‐Niki, Taira, Iguchi‐Ariga, & Agria, 2003 ), stress antioxydant (Taira et al., 2004; Zhou & Freed, 2005), chaperon (Shendelman, Jonason, Marlinat, Leete, & Abeliovich, 2004; Zhou, Zhu, Wioson, Petsko, & Fink, 2006), et protéase (Abou-Sleiman, Healy, Quinn, Lees et Wood, 2003).

Traitement des maladies neurodégénératives : extrait de cistanche

Cistancheest la médecine traditionnelle chinoise et a été principalement utilisée pour traiter les maladies andrologiques à travers les âges. Les principaux ingrédients actifs deCistanchesont des phényl glycosides comprenant 34 composés, tels que l'actéoside, l'échinacoside, etc. Les effets pharmacologiques deExtraits de Cistanchecomprennent l'amélioration de la fonction sexuelle, l'antivieillissement, l'augmentation de la capacité d'apprentissage et de mémoire, la neuroprotection, l'immunomodulation, l'antifatigue, l'anti-ischémique et la protection du foie (Tu et al., 2011). L'acide caféique est l'un des principaux métabolites de Cistanche (Yan, 2018).

Les modèles cellulaires de MP couramment utilisés comprennent les cellules PC12 induites par les ions 1-méthyl-4-phénylpyridinium (Abou-Sleiman et al., 2003) et les cellules de neuroblastome induites par le peroxyde d'hydrogène (H2O2) (SH-SY5Y) (Zhang et al ., 2009). Cependant, les caractéristiques pathologiques typiques de la MP ne sont pas présentes dans ces modèles. Pour développer un modèle cellulaire plus pertinent sur le plan physiologique de la MP, dans cette étude, nous avons établi des cellules SH-SY5Y L166P et C106S induites par H2O2 DJ‐1‐transfectées, et étudié les effets deExtraits de Cistancheet des composés bioactifs clés, y compris l'actéoside, l'échinacoside, l'acide caféique etGlycosides totaux de Cistanchesur ces deux modèles, pour la première fois.

Extrait de Cistanche anti-maladies neurodégénératives

2. MATÉRIELS ET MÉTHODES

2.1|Plasmides, médicaments, produits chimiques et cellules

Les plasmides FLAG‐L166P DJ‐1, FLAG‐C106S DJ‐1 et les anticorps polyclonaux anti‐DJ‐1 ont été gracieusement fournis par le Dr Hiroyoshi Ariga, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University. Le milieu essentiel minimal déshydraté (MEM) et le milieu F-12 ont été achetés chez Gibco. La lipofectine provenait d'Invitrogen. FastDigest Xho I et FastDigest EcoR I provenaient de Fermentas. Le kit de préparation de plasmide sans endotoxine provenait de la biotechnologie. La lignée cellulaire SH-SY5Y provenait de la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences médicales. Le kit de réactifs pour le dosage de la protéine BCA provenait de Pierce. Les membranes PVDF provenaient de Millipore. L'anticorps polyclonal anti-FLAG provenait de GeneTex.Extraits de Cistanche, y compris l'actéoside, l'échinacoside, l'acide caféique et les glycosides totaux de Cistanche, ont été fournis par le Département des médecines naturelles de l'École des sciences pharmaceutiques de l'Université de Pékin.

2.2|Amplification, extraction et purification de plasmides

Après avoir cultivé des cellules Escherichia coli JM109 dans un milieu liquide LB jusqu'à DO600=0.5, des cellules compétentes ont été préparées en utilisant la méthode au chlorure de calcium. Les E. coli compétents ont ensuite été transformés avec de l'ADN plasmidique en utilisant la méthode du choc thermique, après quoi les transformants ont été cultivés sur des plaques LB contenant de l'ampicilline pendant 16 à 24 heures à 37 degrés. Une colonie monoclonale transformée avec succès a ensuite été sélectionnée et cultivée dans un milieu liquide LB contenant 50 ug/mL d'ampicilline pendant 12 heures supplémentaires à 37 degrés. Les plasmides ont été extraits et purifiés à l'aide d'un kit de préparation de plasmide sans endotoxine conformément aux instructions du fabricant.

2.3|Identification plasmidique

Les plasmides extraits ont été soumis à une digestion enzymatique, après quoi les plasmides et les fragments digérés ont été examinés en utilisant une électrophorèse sur gel d'agarose à 1 %. Le gel résultant a été coloré dans une solution EB pendant 20 à 25 min à température ambiante et photographié.

2.4|Transfection plasmidique dans des cellules SH‐SY5Y

L'ADN plasmidique purifié a été transfecté dans des cellules SH-SY5Y cultivées dans un milieu MEM/F-12 contenant 10 % de sérum bovin fœtal. Les cellules transfectées ont ensuite été sélectionnées dans un milieu contenant 400 ug/mL de G418, après quoi 200 ug/mL de G418 ont été utilisés pour maintenir la lignée cellulaire transfectée de manière stable.

2.5|Identification des cellules transfectées par Western blot

Les cellules SH-SY5Y transfectées ont été lysées dans du tampon RIPA. Après centrifugation du lysat, la concentration en protéines totales dans le surnageant a été déterminée à l'aide d'un kit de réactifs de dosage des protéines BCA. Des quantités égales d'extrait protéique ont ensuite été soumises à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide-SDS à 12,5 % et transférées sur une membrane en PVDF. La membrane PVDF a été bloquée avec du lait écrémé en poudre à 5 % dans une solution TBST et traitée pour l'immunodétection. Les anticorps anti‐FLAG et anti‐DJ‐1 ont été utilisés comme anticorps primaires, et l'IgG conjuguée à la HRP était l'anticorps secondaire. Un système de détection de chimiluminescence amélioré a été appliqué pour détecter les protéines cibles.

2.6|Identification immunocytochimique des cellules transfectées

Les cellules SH-SY5Y transfectées ont été fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 4 %, perméabilisées avec une solution de 0,3 % de Triton X-100 et bloquées avec du sérum de chèvre à 10 %. Les cellules bloquées ont ensuite été incubées d'abord avec des anticorps polyclonaux anti-FLAG et anti-DJ-1, puis avec des anticorps secondaires de chèvre anti-lapin conjugués au FITC. Les noyaux cellulaires ont été colorés avec du Hoechst 33342 et les cellules ont été visualisées au microscope inversé à fluorescence (IX‐71, Olympus).

2.7| Essai de viabilité cellulaire

Des cellules SH‐SY5Y non transfectées et transfectées ont été étalées dans 96 extraits, y compris l'actéoside, l'échinacoside, l'acide caféique et les glycosides totaux de Cistanche (tous les 10, 20 et 40 ug/mL, respectivement), ont été ajoutés et le les cellules ont été incubées pendant 6 heures avant le traitement avec 0,2 mM H2O2 pendant 1 heure supplémentaire. Le milieu a été jeté et la viabilité cellulaire a été testée en utilisant le MTT comme décrit ci-dessus.

2.8|Effets des extraits de Cistanche sur la viabilité cellulaire

des extraits, y compris l'actéoside, l'échinacoside, l'acide caféique et les glycosides totaux de Cistanche (tous les 10, 20 et 40 ug/mL, respectivement), ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant 6 heures avant le traitement avec 0,2 mM H2O2 pendant 1 h supplémentaire. Le milieu a été jeté et la viabilité cellulaire a été testée en utilisant le MTT comme décrit ci-dessus.

2.9|analyses statistiques

Les données sont exprimées sous forme de moyenne ± ET de trois expériences indépendantes. Les différences entre les groupes ont été analysées à l'aide de l'ANOVA unidirectionnelle et de la méthode LSD avec le logiciel SPSS 22.0. Les valeurs de p < 0.05="" ont="" été="" considérées="" comme="">

Cistancheherbe

3|RÉSULTATS

3.1|Les plasmides ont été transformés et purifiés avec succès. Après expression séparée dans E. coli JM109, les plasmides ont été extraits et examinés par électrophorèse sur gel d'agarose à 1 % après digestion avec une enzyme de restriction (Figure 1). Les plasmides de 6,2 kb ont été clivés en fragments d'ADN linéaires de 5,4 et 0,8 kb, ce qui a confirmé que les plasmides L166P et C106S DJ-1 étaient tous deux exprimés et purifiés avec succès.

3.2|Identification des cellules transfectées par Western blot. Comme le montre la figure 2, nous avons détecté les bandes FLAG‐L166P DJ‐1 et FLAG‐C106S DJ‐1 à environ 70 kDa. Les niveaux élevés de protéine marquée FLAG dans les cellules SH-SY5Y transfectées indiquent que les mutants L166P et C106S DJ-1 étaient fortement exprimés dans leurs transfectants respectifs.

3.3|Identification immunocytochimique des cellules transfectées. Il montre les forts signaux fluorescents des cellules SH‐SY5Y transfectées après incubation avec des anticorps anti‐DJ‐1 ou anti‐FLAG. Ceci confirme les niveaux élevés de L166P et C106S DJ-1 exprimés dans les transfectants.

3.4|Les cellules transfectées étaient plus sensibles au H2O2 que les cellules non transfectées. Après incubation pendant 1 h en présence de concentrations graduées de H2O2 (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, {{15} }.5 et 1 mM, respectivement), les viabilités des cellules SH‐SY5Y transfectées avec L166P ou C106S DJ‐1 ont été réduites en fonction de la dose par rapport aux cellules non transfectées

3.5|Les extraits de Cistanche ont inhibé les réductions induites par le H2O2 La viabilité des cellules SH‐SY5Y est inhibée de manière dose‐dépendante par le traitement avecExtraits de Cistanche, y compris l'actéoside, l'échinacoside, l'acide caféique et les glycosides totaux de Cistanche (tous à 10, 20 et 40 ug/mL, respectivement).

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