Partie 1 Détection des médicaments Cistanches Herba (Rou Cong Rong) à l'aide de signatures nucléotidiques spécifiques à l'espèce

Pour plus d'information veuillez contacter:Joanna.jia@wecistanche.com

Xiao-Yue Wang 1, Rong Xu 1, Jun Chen 1, Jing-yuan Song 1, Steven-G Newmaster 2, Jian-ping Han 1*, Zheng Zhang 1* et Shi-lin Chen 3

1 Key Laboratory of Bioactive Substances and Resources Utilization of Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education, Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medicinal Science and Peking Union Medicinal College, Beijing, Chine, 2 NHP Research Alliance, Biodiversity Institute of Ontario (BIO ), Université de Guelph, Guelph, ON, Canada,

3 Laboratoire clé de Pékin pour l'identification et l'évaluation de la sécurité de la médecine chinoise, Institut des matières médicales chinoises, Académie chinoise des sciences médicales chinoises, Pékin, Chine

Cistanche deserticola a de nombreux effets, cliquez ici pour en savoir plus

Cistanches Herbaest une plante médicinale aux propriétés détoxifiantes et couramment utilisée en Asie. En raison du déséquilibre entre l'offre et la demande, les adultérants sont fréquemment ajoutés à des fins lucratives. Cependant, il n'y a pas de surveillance réglementaire car les outils de contrôle de la qualité ne sont pas suffisants pour identifier les produits fortement transformés. Ainsi, un nouvel outil moléculaire basé sur des signatures nucléotidiques et des amorces spécifiques à l'espèce a été développé. Les régions ITS2 de 251Cistanches Herbaet les échantillons adultérants ont été séquencés. Sur la base des sites SNP, quatre signatures nucléotidiques de 30 à 37 pb et six amorces spécifiques à l'espèce ont été développées, et elles ont été validées par des mélanges expérimentaux artificiels composés de six espèces différentes et de ratios différents. Cette méthode a également été appliquée pour détecter 66Cistanches Herbaproduits sur le marché, y compris des extraits et des médicaments brevetés chinois. Les résultats ont démontré l'utilité des signatures nucléotidiques pour identifier les adultérants dans les mélanges. L'étude de marché a révélé 36,4 pour cent d'adultération : 19,7 pour cent concernaient l'adultération avec Cynomorium songaricum ouCistancheSinensis, et 16,7 % impliquaient une substitution par Cy. songaricum, Ci. sinensis ou Boschniakia rossica. Les résultats ont également révélé que Cy. songaricum était l'adultérant le plus courant sur le marché. Ainsi, nous recommandons l'utilisation de signatures nucléotidiques spécifiques à l'espèce pour réguler l'adultération et vérifier l'assurance qualité des chaînes d'approvisionnement en médicaments, en particulier pour les produits transformés dont l'ADN est dégradé.

Mots clés: Cistanches Herba, médecine chinoise brevetée, signature nucléotidique, ADN dégradé, contrôle qualité des médicaments

INTRODUCTION

Cistanches Herba(Rou Cong Rong) est un médicament enregistré dans la Pharmacopée bien connu en Asie (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015 ; Japan Pharmacopeial Convention, 2016) ; ce médicament est dérivé des tiges succulentes séchées deCistanche désertiqueYC Ma ouCistanche tubulosatonique, car il n'est pas toxique et peut être pris pendant de longues périodes (Li et al., 2016). Par ailleurs,CistanchesHerba a reçu l'honneur d'être nommé "Desert Ginseng" en raison de sa grande valeur médicinale, en particulier dans le renforcement de la fonction sexuelle masculine (Zhang et Su, 2014 ; Gu et al., 2016). Il existe plus de 100 médicaments brevetés chinois enregistrés dans la Commission de la pharmacopée chinoise (2015) et dans d'autres normes officielles locales promulguées (Wang et al., 2012). À mesure que la population de personnes âgées augmente, la demande deCistanches Herbaet ses médicaments. Cependant, les ressources en matières premières se font de plus en plus rares. En fait, les deux espèces originelles deCistanches Herbaont été ajoutées au China Plant Red Data Book en tant que plantes sauvages protégées par l'État (catégorie II) (Fu, 1991). Les matières médicinales sur le marché sont principalement cultivées dans le nord-ouest de la Chine.

En raison du déséquilibre considérable entre l'offre et la demande deCistanchesHerba, de nombreux adultérants sont entrés sur le marché ; ces adultérants sont incompatibles avec les normes et peuvent menacer la sécurité des médicaments. Les adultérants connus comprennent les tiges succulentes séchées de Cynomorium songaricum Rupr. (Cynomorii Herba, Suo Yang en chinois),Cistanchesinensis Beck, Orobanche coerulescens Stephan et Boschniakia rossica (Cham. et Schlecht.) Fedtsch. et Flerov (Sun et al., 2012). Ces adultérants ont des caractéristiques morphologiques similaires à celles desCistanchesHerba, ce qui rend difficile l'identification taxonomique traditionnelle, en particulier après la transformation du matériel en médicaments. L'identification microscopique n'est pas disponible carCistanchesHerben'a pas de caractéristiques microscopiques définitives ou uniques. Les outils de chimie analytique actuels ne sont pas suffisants pour détecter l'adultération de Cistanches Herba car des composés similaires existent également dans les adultérants connus Ci. salsa (Lei et al., 2001; Chen et al., 2007) et Ci. sinensis (Liu et al., 2013). Par conséquent, le développement d'une méthode moléculaire rapide pour l'authentification de Cistanches Herba et de ses produits est nécessaire de toute urgence pour des systèmes de contrôle de qualité appropriés dans la médecine chinoise des brevets et d'autres industries de médicaments.

Chen et al. a d'abord suggéré l'espaceur transcrit interne 2 (ITS2) comme code-barres universel pour les plantes médicinales (Chen et al., 2010). Soleil et al. a vérifié la région ITS2 comme code-barres ADN préférable pour identifierCistanchesHerba et ses adultérants (Sun et al., 2012). Cependant, ITS2 ne peut pas être utilisé pour distinguer la médecine brevetée chinoise de l'ADN dégradé. Récemment, un nombre croissant d'études ont montré que le « mini code barre » est une méthode utile pour amplifier l'ADN dégradé (Hajibabaei et al., 2006 ; Meusnier et al., 2008 ; Dubey et al., 2011 ; Lo et al., 2015). Cependant, les signatures nucléotidiques sont plus appropriées que les mini-codes-barres, car les premières font référence à un ou plusieurs nucléotides uniques à une espèce et peuvent être utilisées efficacement par de nombreuses techniques moléculaires, telles que les sondes ADN, la microfluidique et l'amplification isotherme médiée par boucle ( de Boer et al., 2015). Han et al. développé des signatures nucléotidiques pour Panax ginseng, Angelica Sinensis et Lonicera japonica et identifié avec succès les médicaments brevetés chinois associés (Liu et al., 2016 ; Wang et al., 2016a ; Gao et al., 2017).

produits fonctionnels contenantCistanchesHerbe. Plus précisément, nous (1) avons développé quatre signatures nucléotidiques et six paires d'amorces spécifiques pour différencierCistanchesHerba et des adultérants connus, (2) ont validé les quatre signatures nucléotidiques dans des expériences comprenant des mélanges de bons taxonomiques connus utilisés pour préparer les produits Cistanches Herba qui contiennent à la fois des ingrédients authentiques et frelatés, et (3) ont réalisé une étude de marché auprès de 66Cistanchesproduits Herba via leurs signatures nucléotidiques.

Cistanchea de nombreux effets et peut améliorer la fonction rénale

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Prélèvement et préparation des échantillons

Au total, 251 échantillons ont été prélevés en Mongolie intérieure, au Xinjiang et au Ningxia, entre autres régions ; ces échantillons comprenaient 214Cistanches Herbaet 37 adultérants et sont détaillés dans le tableau supplémentaire S1. Les échantillons correspondants ont été validés par des taxonomistes et déposés à l'herbier de l'Institut de développement des plantes médicinales, Académie chinoise des sciences médicales, Pékin, Chine. Un total de 35 lots de poudres, épices et extraits deCistanchesHerba a été acheté dans des magasins en ligne et des pharmacies physiques à Pékin et Chengdu (tableau 1). Au total, 31 lots de médicaments brevetés chinois contenantCistanchesHerba a été acheté dans différentes pharmacies (tableau 2) et les compositions déclarées de différents médicaments brevetés chinois sont présentées dans le tableau supplémentaire S3. Les différentes caractéristiques morphologiques des différentes formes posologiques sont présentées à la figure 1.

Echantillons mixtes : Poudres de Ci.désertique, Ci.tubuleux, Cy. songaricum, Ci. sinensis, B. rossica et O. coerulescens ont été mélangés artificiellement dans différentes combinaisons (à un rapport de 1:1) avant l'extraction. Les détails de ces échantillons mélangés sont présentés dans la légende de la figure 3. De plus, les poudres de quatre adultérants ont été mélangées avec le Ci authentique. deserticola à différents rapports de poids : 10:1, 50:1, 100:1, 200:1, 500:1, 1000:1,

2000:1, 5000:1, 10000:1, 15000:1, 20000:1, 25000:1, 30000:1,

40000:1, 50000:1 et 60000:1 (tableau 3). Et les deux produits authentiques sont mélangés dans les mêmes proportions.

Décoction : Tranches de Ci. deserticola et Cy. songaricum a été utilisé pour préparer la décoction. Les tranches (10 g) ont été bouillies dans 300 ml d'eau bidistillée pendant 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 et 240 min, puis utilisées pour l'extraction de l'ADN.

Extraction d'ADN, amplification par réaction en chaîne par polymérase (PCR) et séquençage

Spécimens, décoction et échantillons mélangés : Les échantillons (40 à 50 mg) ont été broyés en poudres fines via un broyeur mélangeur de laboratoire Retsch MM400 (Retsch Co., Allemagne) à une fréquence de 30 Hz. L'ADN génomique a ensuite été extrait avec un kit d'ADN génomique universel pour plantes (Tiangen Biotech Beijing Co., Chine) conformément aux instructions du fabricant. ITS2 a été amplifié par les amorces universelles 2F/3R (Chen et al., 2010).

en parallèle par lot. La poudre de médicament breveté chinois a été lavée avec 700 µL de tampon de prélavage [Tris-HCl 100 mM, pH 8,0 ; Acide éthylènediaminetétracétique (EDTA) 20 mM, pH 8,0;

70NaCl 0 mM ; 2 % de polyvinylpyrrolidone (PVP)-40 ; et 0,4 pour cent de -mercaptoéthanol] plusieurs fois jusqu'à ce que le surnageant soit clair et incolore, après quoi le mélange a été centrifugé à 7500 × g pendant 5 min à température ambiante. Le précipité a ensuite été utilisé pour extraire l'ADN génomique via le Plant Universal Genomic DNA Kit (Tiangen Biotech Beijing Co.) selon les instructions du fabricant. Au final, l'ADN de chaque lot a été concentré dans un tube. Six paires d'amorces spécifiques à l'espèce—SYF1/SYR1, HMRCF/HMRCR, GHRCF/GHRCR, CCRF/CCRR,

SCRF/SCRR et LDF/LDR—ont été conçus via Primer Premier

6. 0 logiciel (Premier Co., Canada) pour amplifier Cistanches Herba et ses adultérants (les détails sont présentés dans le tableau 4). La PCR a été réalisée dans un volume de réaction de 50 µL contenant 1 µL de

KOD FX (Toyobo Co., Japon), 25 µL de tampon PCR 2 ×, 10 µL de dNTP (2 mM), 1,5 µL de chaque amorce (10 µM) et 4 µL (∼50 ng) de matrice d'ADN ; le volume restant était constitué d'eau bidistillée. Les réactions ont été réalisées par

un thermocycleur (VeritiTM 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems Co., États-Unis) ; les programmes thermiques sont répertoriés dans le tableau 4. Les produits de PCR ont été examinés par électrophorèse sur gel d'agarose à 3 % et purifiés pour un séquençage bidirectionnel avec un séquenceur ABI 3730XL (Applied Biosystems Co.) conformément à la méthode de séquençage Sanger. Ensuite, la sensibilité des six amorces a été testée via le test de PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) avec un système en temps réel CFX96 (Bio-rad Lab., USA). Les seuils de cycle ont été calculés automatiquement par le système via le modèle « PCR Baseline Subtracted Curve Fit ». La qRT-PCR a été réalisée dans une réaction de 15 µL contenant 7,5 µL de SYBRⓍR Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)

(Takara Bio Co., Japon), 1.0 µL de chaque amorce (10 µM) et 1,0 µL de matrice d'ADN avec le volume restant constitué d'eau bidistillée. La qRT-PCR a été réalisée avec trois répétitions techniques sur la base desquelles l'erreur standard a été calculée.

Analyse de séquence : Les séquences ont été éditées et assemblées manuellement via CodonCode Aligner 5.1.4 (CodonCode Co., USA).

Les séquences ITS de GenBank ont ​​été annotées via le modèle de Markov caché (HMM) pour obtenir les séquences ITS2 (Keller et al., 2009). Les séquences ont ensuite été alignées par le logiciel MEGA 5.0 via la méthode d'alignement « Muscle » (Edgar, 2004 ; Tamura et al., 2011).

Cistanchea de nombreux effets et peut améliorerun reinfonction

RÉSULTATS

Développement de signatures nucléotidiques et de paires d'amorces spécifiques à l'espèce pour Cistanches Herba et les adultérants

Les taux de réussite de l'amplification PCR et du séquençage des 251 échantillons étaient de 100 % lorsque la paire d'amorces 2F/3R était utilisée. La longueur alignée du Cy. Les séquences songaricum ITS2 étaient de 229 pb (Figure supplémentaire S1). L'analyse des séquences des espèces d'herbier et de celles d'espèces étroitement apparentées extraites de GenBank (tableau supplémentaire S2) a révélé deux sites de polymorphisme nucléotidique unique (SNP) pour Cy. songaricum. Sur la base des SNP, un Cy. la signature de nucléotides de pb spécifique à songaricum 30- (5′-caattatttg aggtgcattg taagaagcgt-3') a été développée (figure 2A). Les résultats de l'outil de recherche d'alignement local de base (BLAST) dans le NCBI ont démontré que cette signature nucléotidique était unique à Cy. songaricum (tableau 5). Avec une analyse similaire des séquences d'espèces étroitement apparentées, un à deux SNP ont été découverts à partir de Ci. sinensis, B. rossica et O. coerulescens. Sur la base des SNP, les signatures nucléotidiques des trois autres adultérants ont également été développées de manière similaire, y compris une signature de 34 pb (5′-cgatggtctc ccgtgcgcga,ggatgcacgg ccgg-3′) pour Ci. Sinensis, une signature de 37 pb (5′- acactggcct cccgtgcgca acgacgtgcg gccggtc-3') pour B. rossica et une signature de 31 pb (5′-gtctgtcgtg tcggatggtg ttgcttgttg g-3′) pour O. coerulescens (Figures 2BD). L'analyse BLAST dans le NCBI a également révélé que ces signatures nucléotidiques étaient spécifiques et n'étaient présentes chez aucune autre espèce (tableau 5).

Cistanches Herbaet ses adultérants pourraient être amplifiés simultanément à partir de mélanges via la paire d'amorces universelles 2F/3R. Ainsi, nous avons conçu des amorces spécifiques à l'espèce pour l'amplification de la signature nucléotidique en alignant les séquences ITS2. Quatre paires d'amorces spécifiques - SYF1/SYR1, CCRF/CCRR, SCRF/SCRR et LDF/LDR - ont été conçues pour amplifier les signatures nucléotidiques de Cy. songaricum, B. rossica, Ci. sinensis et O. coerulescens, respectivement (tableau 4). Les longueurs des amplicons étaient respectivement de 123, 72, 131 et 71 pb.

De plus, un total de 214 séquences ITS2 provenant de matériaux expérimentaux Cistanches Herba ont été analysés. Deux courtes amorces spécifiques - HMRCF/HMRCR et GHRCF/GHRCR pour Ci. deserticola et Ci. tubulosa, respectivement - ont été conçus pour amplifier les régions courtes des échantillons dégradés (tableau 4). Les longueurs des amplicons étaient respectivement de 132 et 134 pb.

Validation de la méthode de signature nucléotidique et d'amorce spécifique à l'espèce basée sur des mélanges artificiels et décoction

Les efficacités d'amplification des nouvelles paires d'amorces ont été validées à partir du mélange. Les produits de PCR ont été obtenus via chaque paire d'amorces pour chaque espèce ciblée, comme indiqué

les valeurs cq de B. rossica ou O. coerulescens ont pu être obtenues même si la proportion d'échantillons était de 30 000:1 ou 40 000:1, et les résultats d'amplification de Ci. sinensis, Ci.tubuleux, et Ci deserticola pouvaient être détectés lorsque le rapport était de 20000:1. Mais aucun résultat détectable n'a pu être obtenu pour Cy. songaricum quand il constituait la proportion de 20000:1.

Pour vérifier si la méthode de signature nucléotidique fonctionne avec des matériaux traités, des décoctions de Ci. deserticola et Cy. songaricum ont été préparés. Les résultats ont montré que le code-barres court de Ci. deserticola a pu être amplifié, même après que les échantillons ont été bouillis pendant 210 min. De plus, la signature nucléotidique de Cy. songaricum a pu être amplifié après que les échantillons ont été bouillis pendant 150 min, alors qu'aucun produit de PCR n'a été détecté après que les échantillons ont été bouillis pendant 210 ou 240 min (Figure 4). Les résultats du séquençage ont démontré que la courte signature nucléotidique a été obtenue avec succès à partir de la décoction.

Étude de marché de l'adultération via la signature nucléotidique et des amorces spécifiques

La méthode ci-dessus a été appliquée pour la détection deCistanchesproduits Herba sur le marché. Trente-cinq lots deCistanchesLes tranches, les poudres et les extraits d'Herba ont été amplifiés et séquencés à l'aide de six amorces spécifiques conçues (les résultats de l'électrophorèse sur gel d'agarose sont présentés dans la figure supplémentaire S2 et les séquences sont répertoriées dans la fiche de données supplémentaire 1). L'analyse des séquences via leurs signatures nucléotidiques a révélé que cinq lots de tranches étaient authentiques. Un lot de tranches et un lot de poudre ont été remplacés par Cy. songaricum et un extrait ont été remplacés par Ci. sinensis. Les six autres lots de poudres étaient des mélanges : cinq étaient frelatés avec du Cy. songaricum et Ci. sinensis et un ont été falsifiés avec Cy. songaricum (tableau 1). De plus, un lot de tranches a été remplacé par de la Salvia miltiorrhiza.

Le Cistanches Herba dans les médicaments brevetés chinois est soumis à divers processus qui rendent l'authentification difficile. La capacité des six paires d'amorces à amplifier les régions de signature nucléotidique spécifiques à l'espèce des médicaments brevetés chinois a été testée (les résultats de l'électrophorèse sur gel d'agarose sont présentés dans la figure supplémentaire S2). La plupart des médicaments brevetés chinois contiennent des composants de différents types d'espèces. Par exemple, les pilules Shihu Yeguang (ZCY34) contiennent 25 ingrédients, dont Cistanches Herba (Rou Cong Rong), Dendrobii Caulis (Shi Hu) et Ginseng Radix et Rhizoma (Ren Shen). A partir de ces ingrédients, Cistanches Herba a pu être amplifié spécifiquement via le couple d'amorces GHRCF/GHRCR. Le séquençage direct des produits de PCR a révélé des traces très nettes. Cependant, une bande visible n'a pas pu être obtenue avec le couple d'amorces HMRCF/HMRCR.

Un autre exemple est celui des pilules Kangguzhi Zengsheng (ZCY44). Il y a huit ingrédients en plus deCistanchesHerba dans ce médicament breveté chinois, mais il n'y avait pas de bandes visibles obtenues par GHRCF/GHRCR ou HMRCF/HMRCR, ce qui signifiait qu'aucuneCistanches Herbaétait présent. Cependant, la région adultérante de Cy. songaricum a été amplifié avec succès par la paire d'amorces spécifique SYF1/SYR1. Les résultats du séquençage ont démontré la courte signature nucléotidique de Cy. songaricum a été obtenu avec succès.

Cistanchea de nombreuses fonctions et aanti-inflammatoireeffets