PARTIE 1 L’échinacoside inhibe la libération de glutamate en supprimant l’entrée de Ca2+ voltage-dépendante et la protéine kinase C dans les terminaux du nerf cérébrocortical du rat

Cheng Wei Lu 1,2, Tzu Yu Lin 1,2, Shu Kuei Huang 1 et Su Jane Wang 3,*

1 Département d’anesthésiologie, Far-Eastern Memorial Hospital, District de Pan-Chiao, New Taipei City 22060, Taïwan; drluchengwei@gmail.com (C.W.L.); drlin1971@gmail.com (T.Y.L.);nskh9450n@yahoo.com.tw (S.K.H.)

2 Département de génie mécanique, Université Yuan Ze, Taoyuan 32003, Taïwan

3 École de médecine, Université catholique Fu Jen, n° 510, Zhongzheng Rd., Xinzhuang Dist., New Taipei 24205, Taïwan.

Abstrait:Le système glutamatergique peut être impliqué dans les effets des thérapies neuroprotectrices. Echinacoside, un glycoside phényléthanoïde extrait de l’herbe médicinale chinoiseHerba Cistanche,a des effets neuroprotecteurs. Cette étude a étudié les effets de l’échinacoside sur la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine dans les terminaisons du nerf cérébrocortical du rat (synaptosomes). L’échinacoside inhibait le Ca²⁺-dépendant, mais pas Ca²⁺-libération indépendante de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine en fonction de la concentration. L’échinacoside a également réduit l’augmentation évoquée par la 4-aminopyridine du Ca libre cytoplasmique²⁺mais n’a pas modifié le potentiel de la membrane synaptomomique. L’effet inhibiteur de l’échinacoside sur la libération de glutamate évoqué par la 4-aminopyridine a été empêché par la cu-conotoxine MVIIC, un bloqueur à large spectre des canaux Cav2.2 (type N) et Cav2.1 (type P/Q), mais était insensible au Ca intracellulaire²⁺inhibiteurs de libération dantrolène et 7-chloro-5-(2-chlorophényl)-1,5-dihydro-4,1-benzodiazépine-2(3H)-one (CGP37157). En outre, l’échinacoside a diminué la phosphorylation induite par la 4-aminopyridine de la protéine kinase C, et les inhibiteurs de la protéine kinase C ont aboli l’effet de l’échinacoside sur la libération de glutamate. Selon ces résultats, nous suggérons que l’effet inhibiteur de l’échinacoside sur la libération évoquée de glutamate est associé à une réduction du Ca dépendant de la tension²⁺l’entrée et la suppression subséquente de l’activité de la protéine kinase C.

Mots-clés:échinacoside; libération de glutamate; terminaisons nerveuses cérébrocorticales; Ca dépendant de la tension²+ canaux; protéine kinase C de la maladie de Parkinson, de la maladie d’Alzheimer et de l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne[9-12]. Cependant, le mécanisme par lequel l’échinacoside induit la neuroprotection n’est pas entièrement compris.

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Echinacosideen cistanche ont de nombreuses fonctions

1. Introduction

Echinacosideest un glycoside phényléthanoïde majeur présent dansHerba Cistanche, une médecine traditionnelle chinoise bien connue utilisée pour traiter l’oubli, l’impuissance et la constipation chronique [1].Echinacosidepossède diverses bioactivités telles que l’antioxydant, l’anti-inflammation, l’anticancéreux, l’hépatoprotection et la modulation immunitaire [2–4]. Notammentéchinacosidea des effets neuroprotecteurs; par exemple, il peut protéger contre le stress oxydatif ou la neurotoxicité induite par les neurotoxines dans les neurones corticaux primaires du rat, les cellules SH-SY5Y du neuroblastome humain et les cellules du phéochromocytome (PC12) [5-8]. En outreéchinacosideatténue les lésions cérébrales et améliore la fonction cognitive dans les modèles animaux de la maladie de Parkinson, de la maladie d’Alzheimer et de l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne [9-12]. Cependant, le mécanisme par lequeléchinacosideinduit une neuroprotection n’est pas entièrement comprise.

La neuroprotection est un processus complexe de préservation de la structure et de la fonction neuronales lors d’insultes toxiques. La réduction de l’excitotoxicité du glutamate est considérée comme un mécanisme potentiel impliqué dans la neuroprotection du cerveau. Le glutamate, un neurotransmetteur d’acides aminés excitateurs, joue un rôle crucial dans plusieurs fonctions cérébrales [13]. Cependant, la suractivation des récepteurs du glutamate sous des concentrations élevées de glutamate provoque une surcharge intracellulaire de Ca2+, un dysfonctionnement mitochondrial, la production de radicaux libres et la mort neuronale [14,15]. Ce processus pathologique est impliqué dans de nombreux troubles cérébraux, notamment l’ischémie cérébrale, les lésions cérébrales traumatiques, l’épilepsie et les maladies neurodégénératives [16,17]. Par conséquent, les inhibiteurs bloquant la transmission physiopathologique glutamatergique sont considérés comme des médicaments neuroprotecteurs potentiels. Des exemples notables de ceux-ci sont les antagonistes des récepteurs du glutamate [18,19]; cependant, les essais cliniques pour ces médicaments ont échoué en raison d’une moins grande efficacité et d’effets secondaires indésirables, voire cytotoxiques [20,21]. En plus du blocage direct des récepteurs du glutamate, l’inhibition de la libération de glutamate peut être une stratégie efficace pour la neuroprotection. Plusieurs neuroprotecteurs (p. ex. la mémantine et le riluzole) peuvent réduire la libération de glutamate dans les tissus cérébraux des rats [22-24].

Considérant le rôle du glutamate dans l’excitotoxicité et le profil neuroprotecteur deéchinacoside, la présente étude a utilisé des terminaisons nerveuses isolées (synaptosomes) purifiées du cortex cérébral du rat pour étudier l’effet deéchinacosidesur la libération de glutamate et exploré plus avant les mécanismes potentiels. La préparation terminale nerveuse isolée est un modèle bien établi pour étudier la régulation présynaptique de la libération de neurotransmetteurs par les médicaments en l’absence d’effets postsynaptiques [25]. En utilisant ce modèle, nous avons évalué l’effet deéchinacosidesur la libération de glutamate, le potentiel membranaire, l’afflux présynaptique de Ca2+ et l’activité de la protéine kinase C. Selon notre revue de la littérature, il s’agit du premier rapport documentant le mécanisme par lequeléchinacosideinhibe la libération endogène de glutamate au niveau présynaptique.

L’échinacoside peut anti-oxyder

2. Résultats

2.1.EchinacosideInhibe la libération de glutamate évoqué par la 4-aminopyridine par les terminaux du nerf cérébrocortical du rat en réduisant l’exocytose vésiculeuse

La figure 1 illustre l’effet dépendant de la concentration deéchinacosidesur la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine par des synaptosomes cérébrocorticaux purififiés de rat. Dans les synaptosomes incubés avec 1 mM de CaCl2, 1 mM de 4-aminopyridine a évoqué une libération de glutamate de 7,4 ̆ 0,1 nmol/mg/5 min, qui a été réduite de 1, 5, 10, 30 et 50 μMéchinacosideà 6,5 ̆ 0,2, 5,8 ̆ 0,3, 4,8 ̆ 0,2, 4,1 ̆ 0,1 ou 2,3 ̆ 0,4 nmol/mg/5 min, respectivement (F(5,24) = 67,1, p = 0,000). La valeur IC50 pouréchinacoside-l’inhibition médiée de la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine, dérivée d’une courbe dose-réponse, était de 24 μM. De plus, la libération de glutamate évoquée par 1 mM de 4-aminopyridine dans une solution extracellulaire sans Ca2+ contenant 300 μM d’éthylène glycol bis(β-aminoéthyléther)-N,N1,N1-tétraacétique (EGTA) était de 2,1 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min (F(2,12) = 310,65, p = 0,000), et ce composant indépendant de Ca2+ de la libération de glutamate évoqué par la 4-aminopyridine n’a pas été affecté par 20 μMéchinacoside(1,8 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; p = 0,58; Figure 1). Dans les synaptosomes traités avec 0,1 μM de bafifilomycine A1, un inhibiteur du transporteur vésiculeux [26], la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine a été réduite de manière significative (2,2 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min ; F (2,12) = 249,518, p = 0,000). En présence de bafifilomycine A1, l’échinacoside de 20 μM n’a pas réussi à inhiber de manière significative la libération de glutamate (2,1 ̆ 0,2 nmol/mg/5 min; p = 0,94; Figure 1). En revanche, 10 μM de DL-thréo-bêta-benzyl-oxyaspartate (DL-TBOA, un inhibiteur de la recapture du glutamate) [27], augmentation de la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine à 11,8 ̆ 0,4 nmol/mg/5 min (t(8) = '11,31, p = 0,000). Même en présence de DL-TBOA, 20 μMéchinacosideinhibition significative de la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine (7,7 ̆ 0,2 nmol / mg / 5 min; F(2,12) = 87,23, p = 0,000; Graphique 1)

1.Q. EchinacosideRéduit le Ca cytosolique²+Concentration mais ne modifie pas le synaptomomique

Potentiel de Mem brane

Dépolarisation des synaptosomes causée par 1 mM de 4-aminopyridine augmentée Ca²+ concentration(p= 0,000; Tableau 1). L’application de 20 |vMéchinacosiden’a pas affecté de manière significative le baral Ca²+ concentration (t(8) = 0,06,p= 0,95) mais a significativement réduit l’augmentation induite par la 4-aminopyridine iia Ca²+ concentration (t(10)= 6,16,p =0,000). De plus, 1 mM de 4-aminopyridine a augmenté dans l’iodure de 3',3',3'-dipropylthiadicarbocyanine [DiSC₃(5)] fluorescence (p= 0,000). L’ajout o⁽20 fdM d’échinacoside n’ont pas modifié le potentiel de la membrane au repos (t(8) = 0,976,p= 0,36) ou modifier de manière significative l’augmentation de DiSC médiée par la 4-aminopyridine₃(5) fluorescence (t(8) = —0,014,p= 0,99; Tableau 1).

Cistancheéchinacosidepeut traiter les maladies rénales

2.3.Co réduit2+L’afflux par les canaux Cav2.2 (N-Type) et Cav2.1 (P/Q-Type) peut être associé à l’inhibition de la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine parEchinacoside

Figure2montre que 2 cu-conotoxine MVIIC, un N-et P / Q-type Ca²+ bloqueur de canaux,

réduction de la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine de 7,4 土 0,2 à 2,0 土 0,1 nmol/mg/5 min (t(9) = 25,35,p= 0,000). En présence de cu-conotoxine MVIIC, l’effet de 20 pM d’échinacoside sur la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine n’était pas significatif (1,8 土 0,2 nmol/mg/5 min;t(8) = 1,06,p= 0,32). Dantrolène (10 ^M), un inhibiteur du Ca intracellulaire²+ libération de Crom le réticulum endoplasmique [28], réduction de la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine (5,6 土 0,3 nmol/mg/5 min; F(2,14) = 104,95,p= 0,000). Cependant, en présence de dantrolène, 20 pJMéchinacosidepourrait encore inhiber la libération de glutamate de manière significative (3,3 土 0,2 nmol/mg/5 min;p= 0,000). Des résultats similaires ont été observés en utilisant 100 pM 7-chloro-5-(2-chlorophène)-1,5-dihydro-4,1-benzothiazépine-2(3H)-one (CGP37157), un bloqueur membranaire-permeaWe du Na mitochondrial⁺/Ca²+ échange. Dans les cinq préparations synaptomomiques examinées, 20 pMéchinacosidecombiné à 100 pM CGP37157 a réduit la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine de 48,3 % 土 5,2 % (F(2,13) = 136,79,p= 7,000), similaire à l’inhibition par l’échinacoside seul (46,2 % 土 2,3 % ;p= 0,89;

2.4.EchinacosideInhibcts 4-Aminopyridine-Evoked (Glutamate Release by Signaling through Protein Kinase C

Comme l’illustre la figure 3, le 10 °jlM 2-[1-(3-diméthylaminopropyl)indol-3-yl]-3-(indol-3-yl)maléimide (GF109203X), un inhibiteur de la protéine kinase C [29], a réduit la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine (F(2,13) = 19,46, p = 0,000). Dans les synaptosomes traités par GF109203X, l’échinacoside de 20 pM a réduit la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine de seulement 5,5 % 土 1,8 % (p = 0,89), moins que celle de l’échinacoside seul (42,4 % 土 2,3 % ; p = f.000). Des résultats similaires ont été obtenus avec le 5,6,7,13-tétrahydro-13-méthyl-5-oxo-12H-indolo[2,3-a]pyrrolo[3,4-c]carbazole-12-propanenitrile (Go6976), un sélectif pour les isoformes C de la protéine kinase ca2+ dépendante (a, |3I, |3II, y) [29]. En présence de 3 pM Go6976, 20 pMéchinacosideréduction de la libération de glutamate de 11,9 % 土 2,9 % (p = 0,59), ce qui signifie une réduction significative par rapport à celle de l’échinacoside seul (42,4 % 土 2,3 % ; p = 0,000 ; Graphique 3). En revanche, la rottlerine 3 pM, un inhibiteur de la protéine kinase C6 indépendante de Ca2+ [30], n’a pas modifié de manière significative la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine (1 mM) (p = 0,45). Néanmoins, en présence de rottlerin, l’échinacoside de 20 pM a effectivement provoqué une inhibition moyenne de 37,1 % 土 5,6 % de la libération (F(2,13) = 19,72, p = 0,000), similaire à celle de l’échinacoside seul (p = 0,41 ; Graphique 3). De plus, l’inhibiteur de la protéine kinase 2-(2-amino-3-méthoxyphényl)-4H-1-benzopyran-4-one activé par les mitogènes (PD98059) (50 pM) et l’inhibiteur de la protéine kinase A N-[2-(p-bromocinnamylamino)éthyl]-5-isoquinolinesulfonamide (H89) (100 pM) ont réduit la libération de glutamate évoqué par la 4-aminopyridine (p = 0,000). Même en présence de PD98059 ou H89, 20 pMéchinacosideréduit efficacement le rejet (F(2,13) = 52,3, p = 0,000; Graphique 3).

La figure 4 montre que la 4-aminopyridine tha11 mM a augmenté la phosphorylation de la protéine kinase C dans les synaptosomes (t(4) = —6,871,p= 0,002). Lorsque les synaptosomes ont été prétraités avec 20 pM d’échinacoside pendant 10 minutes avant l’ajout de 4-aminopyridine, la phosphorylation induite par la 4-aminopyridine de la protéine kinase C a considérablement diminué (F(2_un6) = 29,202,p= 0,00 1).

Echinacosidedanscistanchepeut stimuler leSystème immunitaire

2.5.Echinacoside-L’inhibition médiée de la libération de glutamate n’implique pas un acide gamma-aminobutyrique de type A (GAB³Un_Un) Récepteur

Dans la figure 5, l’effet de l’échinacoside sur la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine en l’absence ou en présence de SR95531 (un antagoniste du GABA_Un) a été comparé. De plus, 100 pM SR95531 n’ont pas modifié de manière significative la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine (1 mM). Dans l'

Synaptosomes traités par SR95531, l’application d’échinacoside de 20 pM a entraîné une inhibition de 43% de la libération de glutamate évoquée par la 4-aminopyridine (F(2,12) = 42,63,p= 0,000), qui n’était pas significativement différente de l’inhibition produite par l’échinacoside seul (40 %;p= 0,000). Un résultat similaire a été obtenu avec un autre antagoniste des récepteurs GABAa, la bicuculline (50 pM). La libération mesurée en présence de bicucline et