PARTIE 1 L'échinacoside induit une vasorelaxation de l'artère pulmonaire du rat en ouvrant les canaux NO-cGMP-PKG-BKCa et en réduisant les niveaux intracellulaires de Ca2 plus

Comment l'échinacoside induit-il la relaxation veineuse ?

Xiang-Yun GAI1, 2, 3, Yu-hai WEI4, Wei ZHANG2, Ta-na WUREN2, Ya-ping WANG2, Zhan-Qiang LI2, Shou LIU2, Lan MA2, Dian-Xiang LU2, Yi ZHOU1, 2, Ri- li GE1, 2, * 1 Département de pharmacologie, École des sciences de la vie et biopharmaceutique, Université pharmaceutique de Shenyang, Shenyang 110016, Chine ; 2 Centre de recherche pour la médecine de haute altitude, Faculté de médecine de l'Université de Qinghai, Xining 810001, Chine ; 3 École de pharmacie, Université Qinghai pour les nationalités, Xining 810007, Chine ; 4 Bureau d'inspection et de quarantaine des entrées-sorties du Qinghai, Xining 810001, Chine

Objectif:Une vasoconstriction pulmonaire soutenue telle qu'elle est ressentie à haute altitude peut entraîner une hypertension pulmonaire (HTP). Le but principal de cette étude est d'étudier l'effet vasorelaxant deéchinacoside(ECH), un glycoside phényléthanoïde de l'herbe tibétaine Lagotis brevituba Maxim etCistanche tubulosa, sur l'artère pulmonaire et son mécanisme potentiel.

Méthodes :Des anneaux artériels pulmonaires obtenus à partir de rats Wistar mâles ont été suspendus dans des chambres d'organes remplies de solution de Krebs-Henseleit, et la tension isométrique a été mesurée à l'aide d'un transducteur de force. Les niveaux intracellulaires de Ca2 plus ont été mesurés dans des cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires de rat cultivées (PASMC) à l'aide de Fluo 4- AM.

Résultats: ECH(30–300 μmol/L) des artères pulmonaires de rat relâchées précontractées par la noradrénaline (NE) de manière dépendante de la concentration, et cet effet a pu être observé à la fois dans les anneaux d'endothélium intact et dénudé d'endothélium, mais avec une réponse maximale significativement plus faible et un CE50 plus élevée dans les anneaux dépourvus d'endothélium. Cet effet a été significativement bloqué par L-NAME, TEA et BaCl2. Cependant, IMT, 4-AP et Gli n'ont pas inhibéECH-relaxation induite. Dans des conditions sans Ca2 plus extracellulaire, la contraction maximale a été réduite à 24,54 % ± 2,97 % et 10,60 % ± 2,07 % dans les anneaux traités avec 100 et 300 μmol/L d'ECH, respectivement. Dans des conditions d'influx de calcium extracellulaire, la contraction maximale a été réduite à 112,42 % ± 7,30 %, 100,29 % ± 8,66 % et 74,74 % ± 4,95 % dans les anneaux traités avec 30, 100 et 300 μmol/L d'ECH, respectivement. Après que les cellules aient été chargées avec Fluo 4-AM, l'intensité moyenne de fluorescence était plus faible dans les cellules traitées avecECH(100 μmol/L) qu'avec NE.

Conclusion: ECHsupprime la contraction induite par la NE de l'artère pulmonaire du rat en réduisant les niveaux intracellulaires de Ca2 plus et induit sa relaxation par la voie NO-cGMP et l'ouverture des canaux K plus (BKCa et KIR).

Mots clés:Herbe tibétaine;échinacoside; hypertension pulmonaire; haute altitude; vasorelaxation; NON; BKCa; KIR ; anneau artériel; cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires.

Pour plus d'information veuillez contacter:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola a de nombreux effets, cliquez ici pour en savoir plus

Introduction

Une vasoconstriction pulmonaire soutenue telle qu'elle est ressentie à haute altitude peut entraîner une hypertension pulmonaire (HTP) et une hypertrophie médiale [1], qui ont été identifiées comme la principale cause d'hypertrophie ventriculaire droite et d'insuffisance cardiaque [2]. Les personnes vivant à haute altitude, de manière temporaire ou permanente, peuvent présenter une hypertension pulmonaire légère à modérée, et celles qui sont plus susceptibles à l'hypoxie peuvent avoir une vasoconstriction pulmonaire exagérée, entraînant diverses maladies de haute altitude associées à une morbidité et une mortalité importantes, telles que œdème pulmonaire de haute altitude et maladies cardiaques[3].Échinacoside(ECH) (Figure 1) est unglycoside de phényléthanoïdetrouvé dans une variété d'herbes chinoises telles que l'herbe tibétaine Lagotis brevituba Maxim etCistanche tubulosa[4, 5]. Lagos brevituba Maxim est une espèce de Lagotis spp appartenant aux Scrophulariaceae et pousse largement à une altitude supérieure à 3000 mètres sur le plateau Qinghai-Tibet.ECHpossède diverses caractéristiques pharmacologiques souhaitables, telles que des propriétés antioxydantes, anti-inflammatoires, neuroprotectrices, hépatoprotectrices et de piégeage des radicaux d'oxyde nitrique (NO) [6]. Il peut également provoquer une relaxation dépendante de l'endothélium dans les anneaux aortiques thoraciques du rat et guérir les maladies cardiovasculaires [7]. Cependant, à notre connaissance, il n'y a pas eu d'étude portant sur ses effets sur le tonus vasculaire des artères pulmonaires. Les objectifs de cette étude sont les suivants : (1) pour explorer si ECH induit une vasorelaxation in vitro dans les artères pulmonaires de rat précontractées avec de la noradrénaline (NE), et si cet effet, le cas échéant, est dépendant de l'endothélium ou agit directement sur le muscle lisse vasculaire ; (2) étudier l'effet de l'ECH sur l'afflux de calcium extracellulaire et la libération de calcium intracellulaire dans les cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires de rat (PASMC); et (3) identifier les voies possibles et les canaux K plus impliqués dans la relaxation induite par l'ECH.

matériaux et méthodes

Réactifs

ECH a été gracieusement fourni par le Dr Peng-fei TU de l'Université de Pékin (Pékin, Chine), avec une pureté de plus de 98% déterminée par chromatographie liquide à haute performance. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) a été acheté auprès de Solar Science & Technology Co, Ltd (Pékin, Chine); NE, acétylcholine (ACh, supérieure ou égale à 99 %), indométhacine (IMT), chlorhydrate d'ester méthylique de Nω-nitro-L-arginine (L-NAME), chlorure de tétraéthylammonium (TEA), chlorure de baryum (BaCl2), {{ 9}}aminopyridine ({{10}}AP) et glibenclamide (Gli) de Sigma Chemical Co (St Louis, MO, USA) ; le milieu de Eagle modifié à haute teneur en glucose de Dulbecco (DMEM), le sérum bovin fœtal (FBS) et la trypsine de Gibco BRL Co, Ltd (Gaithersburg, MD, États-Unis); anticorps de souris anti-actine de muscle lisse primaire de rat (-SMA) et anticorps secondaire de chèvre anti-souris de Boshide Biotech Co, Ltd (Wuhan, Chine); Indicateurs Fluo Calcium (Fluo 4-AM) d'Invitrogen Corp (Carlsbad, Californie, États-Unis) ; et tous les sels inorganiques de Beijing Chemical Reagent Co, Ltd (Pékin, Chine). L'IMT a été dissous dans du DMSO et 5 % de NaH2PO4, Gli, Fluo 4- AM et ECH ont été dissous dans du DMSO, et tous les autres réactifs ont été dissous dans une solution de Krebs-Henseleit (KH) ou de PBS. Des expériences préliminaires ont montré que le DMSO à moins de 0,1 % (v/v) n'avait aucun effet sur le développement de la tension des anneaux artériels pulmonaires isolés.

Animaux d'expérimentation

Toutes les procédures et tous les protocoles ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux du Collège médical de l'Université de Qinghai. Des rats Wistar mâles, âgés de 6 à 8 semaines, d'un poids corporel de 250 à 300 g, ont été achetés au Centre animalier de l'Université de Lanzhou (Lanzhou, Chine) et maintenus avec un régime de laboratoire standard et de l'eau du robinet à volonté à une température ambiante de 22± 2 degrés et une humidité relative de 45 à 55 % tout au long des expériences.

Perfusion artérielle pulmonaire in vitro

Préparation des anneaux artériels pulmonaires de rat

Des rats pesant 250–300 g ont été anesthésiés par injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (40 mg/kg), puis leur cœur et leurs poumons ont été prélevés et immédiatement immergés dans une solution de KH glacée contenant (en mmol/L) : 118 NaCl, 4,7 KCl, 2,5 CaCl2, 1,2 MgSO4·7H2O, 1,2 KH2PO4, 25 NaHCO3 et 11,1 glucose (pH 7,4). Les artères intrapulmonaires (0,7 à 1,5 mm de diamètre) ont été disséquées sans tissu conjonctif environnant ni adventice, puis coupées en anneaux d'environ 2 à 3 mm de longueur. Les anneaux ont été suspendus dans des chambres d'organes remplies de 10 mL de solution de KH à 37 degrés et gazés avec 95 % d'O2 à 5 % de CO2 [8], et la tension isométrique a été mesurée à l'aide d'un transducteur de force (JH-2, Space Medico -Institut d'ingénierie, Pékin, Chine)

Évaluation de l'activité des anneaux vasculaires et évaluation de la fonction endothéliale

Les anneaux vasculaires ont été laissés s'équilibrer pendant 2 h sous une tension basale de 400 mg, période pendant laquelle la solution de KH a été changée toutes les 15 min ; puis 1 μmol/L de NE a été ajouté dans la chambre pour évaluer l'activité de chaque anneau en détectant le pourcentage de contraction. Avant et après le protocole expérimental, le pourcentage de contraction a été mesuré (Figure 2A et 2B). L'endothélium a été retiré dans certains anneaux en frottant doucement la surface intimale avec un fil d'acier fin, et l'intégrité a été évaluée qualitativement par le degré de relaxation provoqué par l'ACh (10 μmol/L) dans le pourcentage de tonus contractile induit par NE (1 µmol/L). Si la relaxation avec l'ACh était supérieure à 80 %, l'endothélium restait en bon état ; si la relaxation était inférieure à 30 %, l'endothélium était détruit (figures 2A et 2B) [9].

Isolement et culture de PASMC de rat

Les artères pulmonaires distales ont été isolées des lobes pulmonaires de rats, et l'endothélium et l'adventice ont été soigneusement retirés. Une fois les tissus hachés en morceaux de {{0}} mm, ils ont été immédiatement ajoutés aux flacons, maintenus à 37 degrés et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié pendant environ quatre heures, puis cultivés avec du DMEM à haute teneur en glucose. complété avec 20 pour cent de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine pendant environ cinq jours. La moitié du milieu de culture a été remplacée par du milieu frais lorsque les cellules ont émergé. Lorsque les cellules ont atteint 80 % de confluence, elles ont été récoltées avec 0,125 % de trypsine et ensemencées dans les flacons (rapport 1: 2) contenant du DMEM à haute teneur en glucose additionné de 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline et 100 U/mL de streptomycine . Des cellules avec trois à huit passages ont été utilisées pour toutes les expériences.

Identification des PASMC par immunohistochimie

Les PASMC étaient positifs pour la coloration immunochimique lorsque des caractéristiques typiques de « colline et vallée » ont été observées. Les cellules ont été ensemencées dans des plaques à puits 6- avec des lamelles en verre. Lorsque les cellules ont atteint 80 % de confluence, elles ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4 %, bloquées avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % pendant 15 min, puis incubées avec un anticorps primaire anti-SMA de souris pendant une nuit à 4 degrés. Après avoir été lavées trois fois dans du PBS pendant 10 min, les cellules ont été incubées avec un anticorps secondaire anti-souris de chèvre à température ambiante pendant 45 min, lavées à nouveau trois fois dans du PBS pendant 10 min et visualisées avec de la diaminobenzidine.

Détection de la concentration de calcium intracellulaire dans les PASMC de rat

Les PASMC ont été ensemencés dans des plaques {{0}}puits avec des lamelles en verre. Lorsque les cellules ont atteint 80 % de confluence, les milieux de culture ont été remplacés par du DMEM sans sérum. Vingt-quatre heures plus tard, les cellules ont été chargées avec 7 μmol/L Fluo 4-AM à 37 degrés pendant 30 min dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. Le colorant résiduel a été lavé avec une solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) contenant les éléments suivants (en mmol/L) : 1,26 CaCl2, 0,49 MgCl2·6H2O, 0,41 MgSO4·7H2O, 5,33 KCl, 0,44 KH2PO4, 4,17 NaHCO3, 137,93 NaCl, 0,34 Na2HPO4 et 5,56 D-Glucose, sans rouge de phénol. Les cellules chargées de Fluo 4-AM ont été exposées à l'une des trois conditions de traitement : (1) le groupe témoin (groupe con), dans lequel les cellules ont été incubées avec du DMEM sans sérum ; (2) le groupe NE, dans lequel les cellules ont été incubées avec du DMEM sans sérum additionné de 1 μmol/L de NE pendant 10 min ; et (3) le groupe NE plus ECH (100 μmol/L) (groupe NE plus ECH100), dans lequel les cellules ont été incubées avec du DMEM sans sérum additionné de 1 μmol/L de NE pendant 10 min et 100 μmol/L d'ECH pendant 20 min. L'intensité de la fluorescence a été observée et photographiée par microscopie à fluorescence (IX71, Olympus, Tokyo, Japon) [11]. Six champs de vision (200×) ont été collectés pour chaque échantillon. La concentration de calcium intracellulaire a été quantifiée en mesurant l'intensité de fluorescence moyenne à l'aide du logiciel Image Pro-Plus 6.0.

analyses statistiques

Les données ont été exprimées en moyenne ± ET. Lorsqu'une différence appropriée et significative a été évaluée par le test de Dunnett ou le test de Student-Newman-Keuls pour des comparaisons multiples après une analyse de variance à un facteur (ANOVA). Un niveau de probabilité de P<0.05 was="" considered="">

Résultats Effets vasorelaxants de l'ECH sur artère pulmonaire isolée

Au début de l'expérience, l'ajout cumulé d'ECH de 30 à 300 μmol/L n'avait pas d'effet significatif sur la tension basale de l'artère pulmonaire. Une fois que la vasoconstriction induite par le NE a atteint un plateau, ECH a été ajouté de manière cumulative (30 à 300 μmol/L) à l'endothélium intact (E plus, Figure 2C) ou aux anneaux dénudés d'endothélium (E–, Figure 2C). Dans les anneaux d'endothélium intacts, l'addition cumulative d'ECH a dilaté les vaisseaux d'une manière dépendante de la concentration, avec un maxi-

pourcentage de relaxation maman de 89,22 % ±0.32 % à 300 μmol/L et une EC50 de 51,60 ± 0,57 μmol/L (Figure 2A et 2C). De même, dans les anneaux dépourvus d'endothélium, l'ECH a également dilaté les vaisseaux d'une manière dépendante de la concentration, mais avec une réponse maximale significativement plus faible de 67,72 % ± 1,69 % (P<0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings)="" and="" a="" higher="" ec50="" of="" 108.51±2.8="" μmol/l=""><0.01 vs="" intact="" endothelium="" rings,="" figure="" 2b="" and="" 2c).="" the="" sustained="" plateau="" of="" the="" high-contraction="" percentage="" induced="" by="" ne="" (1="" μmol/l)="" after="" the="" experimental="" protocol="" indicated="" that="" the="" rings="" pretreated="" with="" ech="" (30–300="" μmol/l)="" had="" good="" activity="" (figure="" 2a="" and="">

Effets de l'ECH sur la libération de calcium intracellulaire et l'influx de calcium extracellulaire

Les anneaux dépourvus d'endothélium ont été exposés à 1 μmol/L de NE jusqu'à ce que la contraction maximale soit atteinte. Dans des conditions extracellulaires sans Ca2 plus, les anneaux ont été équilibrés dans une solution de KH sans Ca2 plus contenant 0.2 mmol/L d'EGTA avant le début des expériences. Après trois lavages avec une solution de Ca2 plus - et de KH sans EGTA, les anneaux ont été pré-incubés avec de l'ECH (30, 100 et 300 μmol/L) pendant 20 min, puis réexposés à 1 μmol/L de NE. Les anneaux produits

contractions non soutenues qui sont rapidement revenues à la ligne de base, par rapport aux contractions initiales induites par NE, qui ont servi de référence. La contraction maximale du contrôle était de 33,27 % ± 2,94 % (figures 3A et 3E), mais a été considérablement réduite à 24,54 % ± 2,97 % et 10,60 % ± 2,07 % dans les anneaux prétraités avec 100 et 300 μmol/L d'ECH, respectivement (P<0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3c–3e).="" under="" extracellular="" calcium="" influx="" conditions,="" 2.5="" mmol/l="" cacl2="" was="" added="" to="" the="" chamber="" when="" the="" curve="" reached="" a="" plateau.="" the="" control="" group="" produced="" sustained="" contractions,="" with="" a="" maximum="" contraction="" of="" 139.89%±7.38%="" (figure="" 3a="" and="" 3e);="" but="" the="" maximum="" contraction="" was="" significantly="" reduced="" to="" 112.42%±7.30%,="" 100.29%±8.66%,="" and="" 74.74%±4.95%="" in="" rings="" pretreated="" with="" 30,="" 100,="" and="" 300="" μmol/l="" of="" ech,="" respectively=""><0.01 vs="" control="" group;="" figure="" 3b–3e).="" under="" these="" conditions,="" the="" maximal="" effect="" caused="" by="" ech="" was="" more="" pronounced="" with="" 300="" μmol/l="" than="" with="" 100="" or="" 30="" μmol/l=""><0.01 vs="" 30="" or="" 100="" μmol/l="" ech="" group).="" different="" concentrations="" of="" ech="" all="" shortened="" the="" platform="" of="" sustained="" contraction,="" which="" was="" induced="" by="" extracellular="" calcium="" influx="" at="" different="" levels="" (figure="">

Rôles de différents inhibiteurs dans la vasorelaxation de l'artère pulmonaire du rat induite par l'ECH

La vasorelaxation de l'artère pulmonaire du rat induite par l'ECH a été étudiée en présence ou en l'absence des inhibiteurs suivants : L-NAME (inhibiteur d'eNOS), IMT (inhibiteur de la cyclooxygénase), TEA (inhibiteur du canal K plus à grande conductance Ca2 plus activé), BaCl2 ( inhibiteur du canal K plus du redresseur entrant), 4-AP (inhibiteur du canal K plus dépendant de la tension) et Gli (inhibiteur du canal K plus sensible à l'ATP). Les anneaux ont été contractés au maximum avec 1 μmol/L de NE, puis L-NAME (100 μmol/L), IMT (10 μmol/L), TEA (1 mmol/L) , BaCl2 (1 mmol/L), 4-AP (1 mmol/L) ou Gli (10 μmol/L) ont été ajoutés, respectivement. Une fois un nouveau plateau atteint, de l'ECH a été ajoutée de manière cumulative de 30 à 300 μmol/L. Les courbes concentration-réponse en présence de différents inhibiteurs sont présentées sur la figure 4. L'effet vasorelaxant de l'ECH sur les anneaux artériels pulmonaires contractés avec 1 μmol/L de NE a été significativement bloqué par L-NAME (100 μmol/L), TEA ( 1 mmol/L) et BaCl2 (1 mmol/L), avec des relaxations maximales de 64,41 % ±3,20 %, 84,38 % ±0,70 % et 75,27 % ±0,93 %, respectivement (P<0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 89.22%±0.32%),="" and="" the="" values="" of="" ec50="" were="" increased="" to="" 197.32±2.75="" μmol/l,="" 91.42±2.11="" μmol/l,="" and="" 115.49±1.75="" μmol/l,="" respectively=""><0.01 vs="" the="" control="" group="" of="" 51.60±0.57="" μmol/l)="" (table="" 1).="" however,="" imt="" (10="" μmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l)="" did="" not="" inhibit="" the="" ech-induced="" relaxation="" (figure="" 4="" and="" table="" 1).="" to="" validate="" the="" effects="" of="" these="" inhibitors="" on="" ech-induced="" relaxation,="" the="" rings="" precontracted="" with="" 1="" μmol/l="" of="" ne="" were="" treated="" with="" l-name="" (100="" μmol/l),="" imt="" (10="" μmol/l),="" tea="" (1="" mmol/l),="" bacl2="" (1="" mmol/l),="" 4-ap="" (1="" mmol/l),="" and="" gli="" (10="" μmol/l).="" after="" a="" new="" plateau="" was="" reached,="" ech="" was="" added="" to="" the="" chamber="" at="" a="" single="" concentration="" of="" 300="" μmol/l="" rather="" than="" in="" a="" cumulative="" manner.="" the="" maximum="" relaxation="" was="" reduced="" to="" 56.33%±0.90%,="" 82.21%±0.92%,="" and="" 72.16%±0.76%="" following="" the="" addition="" of="" l-name,="" tea,="" and="" bacl2,="">

Identification des PASMC de rat

At low magnification, spindle cells were densely packed, and almost all the cells were stained positively for PASMCs (the PASMC purity was >95 pour cent) (Figure 6A). Des myofilaments tachés de brun ont été clairement observés dans le cytoplasme à fort grossissement (figure 6B).

Cistancheéchinacosidepeut résisterapoptose

Effet de l'ECH sur la concentration de calcium intracellulaire dans les PASMC de rat

NE (1 μmol/L) augmente significativement la concentration de calcium intracellulaire (n=6, P<0.01 vs="" the="" control="" group)="" in="" rat="" pasmcs,="" and="" ech="" could="" decrease="" the="" mean="" fluorescence="" intensity="" (n="6,"><0.01 vs="" the="" ne="" group)="" (figure="">