PREMIÈRE PARTIE L’échinacoside augmente la quantité de spermatozoïdes chez le rat en ciblant le récepteur hypothalamique des androgènes

Comment l’échinacoside stimule-t-il l’œstrogène et augmente-t-il le nombre de spermatozoïdes?

Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 & Xiaoying Zhang1,2

L’infertilité masculine est un problème de santé majeur avec une prévalence estimée à 4,2% de l’infertilité masculine dans le monde. Nos premiers travaux ont démontré que les extraits de Cistanche protègent contre les dommages aux spermatozoïdes chez la souris et queéchinacoside(L') est l’un des principaux composants actifs. Nous rapportons ici un rôle essentiel pourL', un produit naturel qui inverse ou protège contre l’oligo comme l’aspermie chez le rat.L'a été dosé par CLHP, la quantité et la qualité des spermatozoïdes ont été évaluées et les niveaux d’hormones ont été déterminés par un dosage du sorbant radioimmu. ECH a réduit les niveaux de récepteurs aux androgènes (AR) et de clégènes liés aux stéroïdes tels que déterminés par transfert western et analyse qPCR. L’interaction entreL'et la RA a été évaluée par ELISA indirect et amarrage moléculaire. Les résultats montrent que l’ECH combiné à l’AR hypothalamique dans la poche de Met-894 et Val-713 inhibe le transfert de l’AR à partir dele cytoplasme aux noyaux dans l’hypothalamus. Alors que la rétroaction négative de la régulation des hormones sexuelles a été inhibée, la rétroaction positive a été stimulée pour augmenter la sécrétion de l’hormone lutéinisante et de la testostérone améliorant par la suite la quantité de spermatozoïdes. Prises ensemble, ces données démontrentcelaL'bloque l’activité AR dans l’hypothalamus pour augmenter la quantité de spermatozoïdes et protéger contre l’oligo-aspermie chez le rat.

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La production de testostérone dans les cellules testiculaires est fortement régulée par l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique (HPG) en formant une boucle de rétroaction homéostatique1. L’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH), sécrétée par l’hypothalamus, peut stimuler la sécrétion de l’hormone lutéinisante (LH) de l’hypophyse, ce qui stimule davantage la production de testostérone dans les cellules testiculaires de Leydig. La testostérone est biosynthétisée par une série d’enzymes stéroïdogènes. En tant que l’une des principales voies, la protéine régulatrice aiguë stéroïdogène (StAR) peut transporter le cholestérol de sources intracellulaires dans les mitochondries2 où il est exposé à l’enzyme de clivage de la chaîne latérale du cholestérol (CYP11A1), à la 3β-hydroxystéroïde déshydrogénase (HSD3β), à la 17α-hydroxylase (CYP17A1) et à la 17βhydroxystéroïde déshydrogénase (HSD 17β) qui catalysent la conversion du cholestérol en testostérone3,4. La testostérone retourne ensuite négativement à l’élément HPG pour réguler à la baisse la sécrétion de LH d’une manière dose-dépendante.

L’effet de la testostérone sur la boucle de rétroaction de l’axe HPG se produit en se liant au récepteur des androgènes (AR), présent à la fois dans l’hypothalamus et l’hypophyse5. Chez la souris, l’ablation de la RA et la production minimale de testostérone entraînent une augmentation des niveaux de LH et d’hormone folliculo-stimulante (FSH)6, ce qui suggère que la RA participe à la régulation de la boucle alimentaire négative. Le mécanisme génomique classique de la signalisation de la testostérone se produit lorsque la testostérone diffuse dans la cellule et se lie à l’AR. Ce complexe ligand-récepteur se transloque ensuite vers le noyau où il se lie aux éléments de réponse aux androgènes (ARE) dans les régions régulatrices des gènes sensibles à la testostérone pour modifier leur translocation. La testostérone induit également la voie non classique de l’action hormonale stéroïde, caractérisée par des événements rapides qui conduisent à l’activation de cascades de signalisation cytosoliques normalement déclenchées par des facteurs de croissance7,8. Les voies de testostérone classiques et non classiques contribuent toutes deux au maintien de la spermatogenèse et de la fertilité. Cependant, la fonction de l’AR est plus importante dans la voie classique car la testostérone agit pour augmenter la qualité du sperme.

Echinacoside(L') est l’un des composants bioactifs dérivés des espèces de plantes médicinales Echinacea9 et Cistanche10. Avec un large éventail d’activités pharmacologiques, les extraits d’échinacée sont l’un des suppléments à base de plantes les plus populaires en Europe et aux États-Unis, principalement en raison de leurs propriétés antioxydantes11 et de leur capacité à prévenir le rhume12. IntéressantCistancheextraits etL'ont été traditionnellement utilisés comme agent tonique pour guérir le dysfonctionnement de la reproduction et stimuler l’activité sexuelle masculine en médecine traditionnelle chinoise10. Certains produits en vente libre d’extraction de Cistanche ont été développés comme suppléments nourrissants et gagnent en popularité sur les marchés des aliments naturels de chine et de certains autres pays asiatiques (China Food and Drug Administration)13. Cependant, les mécanismes sous-jacents deL'les mesures à prendre demeurent floues. L’infertilité masculine est un problème de santé majeur avec une prévalence estimée à 4,2 % de l’infertilité masculine dans le monde14. Le diagnostic de l’infertilité masculine est actuellement basé sur l’étude de la qualité du sperme, y compris l’analyse des paramètres séminaux tels que la concentration, la motilité et la morphologie des spermatozoïdes15. Le bisphénol A (BPA) imitant les œstrogènes te est un contaminant environnemental répandu qui a été étudié pour son impact sur la fertilité masculine chez plusieurs espèces d’animaux et d’humains16. Le BPA perturbe l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, inhibe les expressions des enzymes stéroïdogènes testiculaires et la synthèse de la testostérone chez les chiots mâles17, provoquant un état d’hypogonadisme hypogonadotrope18. Dans cette étude, nous étudions les effets deL'sur la qualité du sperme et les niveaux d’hormones. En outre, le BPA a été choisi comme agent modèle de lésion du sperme pour étudier plus avant l’effet protecteur deL'contre la mauvaise qualité du sperme.

Résultats ECH améliore la quantité de sperme. Le nombre de spermatozoïdes dans l’épididyme de cauda, la viabilité des spermatozoïdes et la motilité des spermatozoïdes sont présentés dans le tableau 1. Le traitement avec 80 mg / kg d’ECH et 15 mg / kg de propionate de testostérone (TP) a considérablement augmenté le nombre de spermatozoïdes épididymaires. Cependant, il n’y avait pas de différence significative dans la viabilité et la motilité des spermatozoïdes.

ECH augmente les niveaux de testostérone et de LH dans le sérum, l’encéphalon + hypophyse et les testicules. Le traitement par ECH a notamment augmenté les taux de LH dans le sérum, l’encéphale + hypophyse et les testicules (Fig. 1A). Dans le groupe ECH(H), les taux de LH ont significativement augmenté de 1,1 fois dans le sérum, de 1,4 fois dans l’encéphale + hypophyse et de 1,2 fois dans les testicules. La testostérone a été significativement augmentée de 1,5 et 1,3 fois dans l’encéphale + hypophyse et le testicule, respectivement, mais pas dans le sérum après le traitement par ECH(H). Après le traitement par TP, les niveaux de testostérone ont été significativement augmentés de 1,6, 1,8 et 1,4 fois dans le sérum, l’encéphalon + hypophyse et les testicules.

ECH a augmenté l’expression des gènes de l’enzyme stéroïdogène. ECH a significativement augmenté les expressions d’enzymes stéroïdogènes clés dans le testicule (Fig. 1B). Les taux d’ARNm du CYP11A1, du CYP17A1, du HSD3β1/2 et du HSD17β dans le groupe ECH(H) ont été multipliés par plus de 3, tandis que les taux d’ARNm StAR n’ont montré aucune différence significative avec tous les traitements ECH (p>0,05). La TP n’a pas modifié de manière significative l’expression du CYP11A1, du CYP17A1, du HSD3β1/2 et du HSD17β. Cela se reflète dans une analyse complète de la carte thermique de l’effet de l’ECH sur l’expression des enzymes stéroïdogènes indiquant que l’ECH a significativement augmenté les niveaux d’ARNm du CYP11A1, du CYP17A1, du HSD3β1/2 et du HSD17β, et en particulier du HSD3β1/2 (Fig. 1C).

L’ECH peut traverser la barrière hémato-encéphalique et, dans une moindre mesure, la barrière hémato-testiculaire. Pour évaluer la boucle de rétroaction des androgènes à l’axe HPG, la capacité de l’ECH à pénétrer dans l’hypothalamus a été évaluée dans une série d’études PK. Des concentrations d’ECH ont été détectées dans l’hypothalamus après 12h d’administration orale unique de 30 mg/kg d’ECH, et ECH a montré une pénétrance marquée de l’hypothalamus avec un rapport hypothalamus/plasma moyen de 33,92 % (Fig. 2A). Les valeurs de Te T1/2 étaient de 2,61±0,42 h et 1,88±0,22 h dans le plasma et l’hypothalamus, respectivement (Fig. 2B). Cependant, un accès très limité de l’ECH dans les testicules a été détecté à l’aide de la CLHP. Les concentrations d’ECH dans les testicules étaient de 0,083 μg/mL, 0,043 μg/mL et 0,028 μg/mL à 0,5 h, 1 h et 1,5 h respectivement, après le traitement.

L’ECH réduit la translocation hypothalamique de l’AR vers le noyau. Pour tester l’effet de l’ECH sur la translocation de l’AR, l’expression de l’AR dans le cytoplasme et le noyau du testicule et de l’hypothalamus a été déterminée à l’aide d’une analyse par transfert de Western. Comme le montre la Fig. 3A, la protéine AR régulée par ECH a été réduite de cinq fois dans les noyaux hypothalamiques par rapport au groupe témoin. Le traitement par l’enzalutamide, un inhibiteur de la RA, a réduit de 4,8 fois les niveaux de protéine AR dans les noyaux hypothalamiques. Notamment, la RA cytoplasmique était plus élevée avec le traitement ECH et le traitement par enzalutamide que les témoins, ce qui suggère que l’ECH bloque le transport AR du cytoplasme au noyau dans l’hypothalamus. Comme prévu, l’ECH n’inhibe pas le transport de la RA du cytoplasme au noyau dans le testicule (Fig. 3B).

ECH a augmenté les expressions des gènes liés à l’axe HPG. ECH a significativement augmenté les expressions de LHβ, LHR, GnRH 1 et Gnrhr dans les pools de mélange d’encéphalon + hypophyse, cependant, il n’y avait pas de différence significative dans les niveaux de GnRH 1 après le traitement par TP. L’analyse de la carte thermique montre que les expressions de la GnRH 1 et LH β étaient les plus élevés parmi les gènes liés à l’axe HPG.

La RA est une cible d’ECH. Pour confirmer les relations entre ECH et AR, ECH-Ovalbumin (ECH-OVA) a été synthétisé avec succès (Fig. 5A, B). Le poids moléculaire de l’ECH-OVA est plus grand que celui de l’OVA, ils ont donc des taux de mobilité différents (Fig. 5A), et le pic d’absorbance de l’ECH-OVA est compris entre ECH et OVA (Fig. 5B),

suggérant que l’ECH a été conjugué avec succès à l’OVA. Les résultats ELISA indirects (Fig. 5C) montrent que l’anticorps anti-AR est capable de détecter la protéine AR présente dans les puits contenant de l’ECH-OVA (indiqué par l’anticorps anti-OVA), ce qui suggère que l’ECH peut se lier à la protéine AR. ECH se combine avec la poche AR de Met-894 et Val-713. Le composé ECH a été amarré au site AF2 à la surface de l’AR humain, et le mode de liaison théorique de l’ECH et de l’AR a été montré sur la Fig. 5D. Le composé ECH a adopté une liaison de conformation compacte à la poche de l’AR humain. Deux groupes phényles de l’ECH se lient au domaine hydrophobe de la poche AR et ont maintenu des contacts hydrophobes étroits avec les résidus Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737, Met-894 et Ile-898, tandis que les deux autres côtés de l’ECH ont été positionnés à l’entrée de la poche et n’ont établi que quelques contacts. Une analyse détaillée a montré que le Met-894 (longueur de liaison: 2,4Å) et le Val-713 (longueur de liaison: 2,7Å) formaient des liaisons hydrogène avec les groupes hydroxy1 de l’ECH, qui était la principale interaction entre l’ECH et l’AR humain. ECH atténue les dommages à la reproduction induits par le BPA. Pour étudier l’effet de l’ECH sur les dommages à la reproduction, la qualité du sperme et les niveaux d’hormones sexuelles et d’enzymes stéroïdogènes ont été examinés chez des souris induites par le BPA. Comme le montre la Fig. 6, le traitement au BPA a considérablement diminué le nombre de spermatozoïdes et la motilité des spermatozoïdes de 26,5% et 39,2%, respectivement. L’administration d’ECH a empêché la diminution du nombre de spermatozoïdes et de la motilité des spermatozoïdes de 35,5% et 30,1%, respectivement. L’administration de BPA a également entraîné une diminution significative de la sécrétion de LH et de T, et l’ECH a considérablement augmenté les niveaux de LH et de T de 24,1% et 18,3%, respectivement, par rapport au traitement au BPA seul (Fig. 6A, B). Les taux d’ARNm de StAR, CYP17A1, 3β-HSD et 17β-HSD dans le traitement par BPA-ECH ont été significativement augmentés par rapport au traitement au BPA (Fig. 6C, D).