Deuxième partie Comment l'échinacoside traite-t-il les dommages oxydatifs de l'ADN et inhibe-t-il l'apoptose cellulaire?

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3. Expérimental Section

3.1. Cellules et Produits chimiques

Une lignée cellulaire d'adénocarcinome colorectal humain SW480 a été achetée auprès de l'ATCC. Les cellules ont été cultivées dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY, USA) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (Gibco) et 1 % (v/v) pénicilline-streptomycine (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) à 37 degrés dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2.Échinacosidea été acheté auprès de Yuanye Biotechnology, Shanghai, Chine (HPLC > 98 %). Des solutions mères ont été préparées dans du DMSO (Sigma-Aldrich) et des solutions de travail ont été préparées dans un milieu de culture cellulaire.

3.2. Test de viabilité MTT

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96-puits à raison de 1 × 104 cellules par puits pendant 12 h, puis incubées en présence deÉchinacosideou 0.01 % de DMSO pendant 24 ou 48 h. Au final, 20 μL de solution de MTT (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-bromure de diphényltétrazolium) (5 mg/ mL dans du PBS, pH 7,2) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a été ajouté à chaque puits et les plaques ont été incubées pendant 4 h. Après avoir retiré le milieu contenant du MTT, 150 µL de DMSO ont été ajoutés dans chaque puits. Les plaques ont été incubées sur un agitateur de plaques pendant 10 min et l'absorbance à 570 nm a été mesurée par un lecteur de microplaques BioRad 680 (Hercules, CA, USA). Chaque expérience a été menée deux fois en triple. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism (San Diego, CA, USA).

3.3. Essai de formation de colonies

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 6-puits à une densité de 1 × 104 par puits pendant 12 h, puis incubées en présence deÉchinacosideou {{0}}.01 % de DMSO pendant 10 jours. Les plaques ont été lavées avec du PBS et les cellules ont été fixées avec du méthanol glacé et colorées avec une solution de cristal violet (Sigma-Aldrich) (0,5 % dans du méthanol à 25 %). Les images ont été photographiées après que les plaques ont été séchées pendant une nuit. Les cristaux de cristal violet ont été dissous dans de l'éthanol à 70 % et l'absorbance à 595 nm a été mesurée par un lecteur de microplaques BioRad. Les données ont été analysées à l'aide du logiciel GraphPad Prism.

3.4. Analyse de la fragmentation de l'ADN avec fluorescence DAPI Coloration

Après le traitement médicamenteux, les cellules des plaques {{0}}puits ont été lavées une fois dans du PBS, fixées dans du paraformaldéhyde glacé à 4 % (PFA) (Sigma-Aldrich) dans du PBS pendant 20 min, puis colorées avec 4 ,6-diamidino-2- phénylindole (DAPI) (Sigma-Aldrich) (0,2 ug/mL) pendant 10 min à température ambiante. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été scellées dans du milieu de montage VECTASHIELD (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). La morphologie nucléaire a été photographiée avec un microscope à fluorescence Olympus.

L'échinacoside dans le cistanche peut booster le système immunitaire

3.5. Analyse du cycle cellulaire

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96-puits à raison de 1 × 104 cellules par puits pendant 12 h, puis incubées en présence deÉchinacosideou {{0}}.01 % de DMSO pendant 24 h. À la fin, les cellules ont été récoltées avec de la trypsine (Invitrogen), lavées deux fois dans du PBS, puis fixées avec de l'éthanol glacé (70%) pendant 2 h à -20 degrés. Les cellules fixées ont été lavées deux fois dans du PBS froid et remises en suspension dans 300 μL de PBS fraîchement préparé avec 0,1 % de Triton X-100, 0,2 mg/mL de RNase A sans DNase (Sigma), 10 ug/mL d'iodure de propidium (PI) (Roche, Indianapolis, IN, États-Unis). Après incubation à 37 degrés dans l'obscurité pendant 20 min, les cellules ont été filtrées à travers une maille en nylon (Falcon, BD Bioscience, San Jose, CA, USA), chargées dans le cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel ModFit (Topsham, ME, USA).

3.6. Analyse de l'apoptose

Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 96-puits à raison de 1 × 104 cellules par puits pendant 12 h, puis incubées en présence deÉchinacosideou 0.01 % de DMSO pendant 24 h. Au final, les cellules ont été examinées à l'aide d'un kit de détection d'apoptose Annexin V-FITC (Best, Shanghai, Chine) conformément aux instructions du fabricant. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS puis remises en suspension dans un tampon de liaison. 5 μL chacun d'annexine V-FITC et d'iodure de propidium (PI) (Roche) ont été ajoutés séquentiellement et les cellules ont été incubées pendant 15 minutes dans l'obscurité à température ambiante. Les cellules ont été chargées sur le cytomètre en flux FACSCalibur (BD Biosciences). Les données ont été analysées à l'aide du logiciel Cell Quest (BD Biosciences).

3.7. Coloration immunofluorescente de 53BP1

Les cellules SW480 ont été ensemencées sur des lamelles rondes dans des plaques 24-puits. Après traitement avecÉchinacosideou {{0}}.01 % de DMSO pendant 24 h, les cellules ont été fixées avec 4 % de PFA pendant 20 min et bloquées avec 15 % de FBS (0,1 % de Triton X-100) ​​pendant 1 h dans la pièce Température. Les cellules fixées ont été incubées pendant 2 h à température ambiante avec un anticorps de lapin anti-53BP1 (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) dilué au 1:1000 dans la solution de blocage, suivi d'une coloration avec Cy3-conjugué anticorps secondaire anti-lapin de chèvre (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, USA) dilué au 1:500 dans un tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante. Après lavage dans du PBS pendant 3 × 5 min, les lamelles ont été scellées sur des lames de verre dans du milieu de montage VECTASHIELD avec DAPI. Les images ont été prises par un microscope confocal Zeiss LCM 510 (Carl Zeiss, Jena, Allemagne).

3.8. 8-Test d'incorporation d'oxoG

L'8-oxoG intracellulaire a été mesuré par coloration avec Alexa 488-avidine conjuguée (Invitrogen) [25]. Les cellules ont été ensemencées sur des lamelles rondes dans des plaques 12-puits. Après traitement avecÉchinacosideou {{0}}.01 % de DMSO pendant 24 h, les cellules ont été fixées avec du méthanol glacé pendant 20 min, suivies d'une incubation dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) (Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) avec 0,1 % de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) pendant 15 min. Les échantillons ont été bloqués dans du TBS avec 0,1 % de Triton X -100 et 15 % de FBS pendant 1 h à température ambiante, puis colorés avec Alexa 488- avidine conjuguée (0,5 ug/mL) dans une solution de blocage pendant 1 h à 37 degrés. Après lavage dans du PBS pendant 3 × 5 min, les lamelles ont été scellées sur des lames de verre dans du milieu de montage VECTASHIELD avec DAPI (Vector Laboratories). Les images ont été prises et analysées par un microscope confocal Zeiss LCM 510.

3.9. Western Blot Une analyse

Les cellules cultivées et traitées dans des plaques {{0}}puits ont été grattées dans un tampon RIPA (150 mM NaCl, 1,0 % IGEPAL CA-630, {{12 }} 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS et 50 mM de Tris, 1 mM de PMSF, pH 8,0) (Sigma). La concentration totale en protéines a été mesurée par le kit BCA (Dingguo, Changchun, Chine) selon les instructions du fabricant. Les échantillons ont été dénaturés à 95 degrés pendant 10 min, séparés sur un gel SDS-PAGE à 4% -12%, puis transférés sur des membranes PVDF (Millipore, Billerica, MA, USA). Les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % dans du TBST pendant 2 h et incubées avec des anticorps primaires (Bcl-2, sc-492, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, États-Unis ; Bax, Santa Cruz , sc-493 ; à c, Santa Cruz, sc-7159 ; p21, ab109520, Abcam, Cambridge, MA, États-Unis ; caspase 3, Abcam, ab32042 ; PARP, Bioss, bs-2318 R ; 53BP1, Bethyl Laboratories, A300-272A) pendant la nuit à 4 degrés. Après lavage avec du PBS, les membranes ont été incubées avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories) et visualisées avec le kit de détection par transfert Western ECL (Transgen Biotech, Changchun, Chine). Les photos ont été capturées et analysées par un imageur (Tanon, Shanghai, Chine).

3.10. Mesure du cellulaire RSO

Les ROS intracellulaires ont été mesurés par cytométrie en flux à l'aide d'un kit de dosage des ROS à base de cellules (Beyotime Biotechnology, Haimen, Chine ; S0033). Au bout duÉchinacosidetraitement, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS et incubées avec du diacétate de dichlorofluorescéine 10 μM (DCFH-DA) pendant 30 min à 37 degrés. Les cellules ont ensuite été trypsinisées et analysées par le cytomètre en flux FACSCaliber (BD Biosciences). Les niveaux de ROS intracellulaires ont été exprimés en tant qu'intensité moyenne de fluorescence DCF des cellules.

3.11. Mesure de la membrane mitochondriale Potentiel

Le potentiel de membrane mitochondriale a été mesuré à l'aide du colorant JC-1 (Beyotime Biotechnology, C2006) en suivant les instructions du fabricant. Contrôle etÉchinacoside-les cellules traitées ont été incubées avec JC-1 pendant 20 min, puis examinées avec un microscope à fluorescence Olympus.

3.12. Analyses statistiques

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism. La signification a été calculée à l'aide d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) etp < 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" results="" were="" expressed="" as="" mean="" ±="">

Échinacosidedanscistanche: Neuroprotectioneffets

4. conclusion

Dans cette étude, nous avons testé les effets deÉchinacosidesur une variété de lignées de cellules cancéreuses humaines. Étonnamment, nous avons constaté que

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inhibe la prolifération de l'hépatome humain SK-HEP-1, du cancer du sein MCF-7 et des cellules cancéreuses colorectales SW480. D'autres analyses ont révélé que l'échinacoside arrêtait les cellules SW480 en phase G1 et induisait l'apoptose dépendante de la caspase en activant la voie d'apoptose intrinsèque associée aux mitochondries. L'arrêt du cycle cellulaire était lié à la régulation à la hausse du bloqueur G1/S-CDK et de l'inhibiteur de la synthèse de l'ADN CDKN1B (p21), et l'apoptose était associée à la régulation à la baisse de la protéine anti-apoptotique Bcl-2 et à la régulation à la hausse de la pro-apoptose Bax, ainsi que la perte du potentiel membranaire mitochondrial. L'augmentation significative de la forme oxydée intracellulaire de la guanine, 8-oxoG, suggère qu'il y a eu une oxydation accrue des dNTP et/ou des molécules d'ADN, ce qui peut avoir provoqué l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose dans les cellules cancéreuses SW480. Alors que les mécanismes sous-jacentsÉchinacosideLes effets sur les dommages oxydatifs et l'apoptose restent à caractériser, ces résultats soutiennent l'échinacoside en tant que nouvel échafaudage chimique pour le développement de médicaments anticancéreux.

Remerciements

Ces études ont été soutenues par une subvention de la province de Jilin (numéro de subvention : 20130101120JC) et par un fonds de recherche de l'Université de Jilin (numéro de projet : 450091099029).

Les contributions de l'auteur

Liwei Dong a effectué la plupart des travaux expérimentaux, analysé les données et rédigé le manuscrit. Debin Yu et Nuoting Wu ont effectué le test MTT et de formation de colonies ; Hongge Wang et Jiajing Niu ont réalisé les expériences d'immunocoloration et de Western blot ; Ye Wang a participé aux expériences sur le cycle cellulaire et l'apoptose ; et Zhihua Zou ont développé le concept, analysé les données et supervisé la mise en œuvre de cette étude et la rédaction du manuscrit. Tous les auteurs ont approuvé le manuscrit soumis.

Les conflits d'intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Échinacosidedanscistancheboîteanti-inflammatoire

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