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2.6. Effets anti-apoptotique des cytokinines déterminés par les mesures d'activité Caspase-3/7

Comme le montrent les tests de coloration PI décrits ci-dessus, SAL a induit des augmentations des taux de mortalité des cellules SH-SY5Y. Comme SAL est associé à la fois à l'apoptose et à la nécrose [51], nous avons également étudié l'activation de la caspase-3 et 7 (casp-3/7) en tant que marqueur spécifique de l'apoptose (la phase d'exécution) [52] après avoir exposé les cellules aux CK. Les activités caspase-3/7 enregistrées après le traitement avec chacun des composés testés ont été normalisées par rapport à celles enregistrées après le traitement avec 50{{30}} uM SAL (fixé à 100 pour cent). Comme le montre la figure 4, l'inhibiteur de caspase bien connu Ac-DEVD-CHO (inclus en tant que contrôle spécifique lié à l'apoptose) a fortement inhibé l'activité de la caspase-3/7 à des concentrations sous-micromolaires (à 36,3 ± 2,66 et 25,2 ± 2,69 pour cent des niveaux dans les cellules traitées avec SAL seul à 0,05 et 0,5 uM, respectivement). Des niveaux similaires d'inhibition ont déjà été observés [53] dans différents modèles in vitro de neurodégénérescence à base de cellules SH-SY5Y. Le contrôle positif NAC a également réduit de manière significative l'activité de la caspase-3/7, à 88,7 ± 1,87 % et 78,5 ± 2,56 % des niveaux induits par SAL à 100 μM et 1 000 μM, respectivement. Les CK testées ont eu un large éventail d'effets sur les activités caspase-3/7. Fait intéressant à partir des ribosides CK, seul cZR a eu des effets significatifs sur les activités à 0,1 uM (les réduisant à 83,3 ± 4,33 % des niveaux induits par SAL, respectivement), tandis que l'iPR à 1 uM n'a pas entraîné de réduction significative de casp-3 ,sept. Enfin, K3G a diminué l'activité caspase-3/7 avec un effet maximal à 10 uM (à 81,7 ± 4,31 % du niveau induit par SAL). Dans l'ensemble, SAL a induit une augmentation de 1.6- fois de l'activité de la caspase-3/7 par rapport aux cellules témoins saines (CTR, figure 4), conformément aux résultats d'une étude antérieure, dans laquelle un taux similaire La concentration de SAL (400 uM) et la même lignée cellulaire ont été utilisées [54]. La NAC est connue pour influencer l'activité de la caspase-3/7 dans plusieurs modèles deneuronalmort [55–58]. Cependant, les résultats présentés ici fournissent la première démonstration de leur caspase-3/7 dans un modèle de SAL induit par les cellules SH-SY5Y.neuronaldécès. Le contrôle positif a réduit l'activité de la caspase-3/7 induite par 500 uM de SAL de la même manière que les CK, mais cZR et K3G étaient efficaces même à des concentrations sous-micromolaires ou micromolaires. D'autres études avec des modèles de stress associés à la MP (toxicité induite par l'inhibiteur du protéasome MG 132- ou H2O2- dans les cellules SH-SY5Y [17] et les fibroblastes [15]) et la maladie de Huntington (modèle de carence sérique chez Les cellules PC12 [19]) ont également montré que les CKs K et tZR peuvent avoir des activités anti-apoptotique (caspase-3) [17], et que K et tZR peuvent avoir des activités anti-sénescence [17,19] . De plus, les associations entre la diminution de casp-3,7 l'activation etneuroprotecteuractivité ont été signalés pour les modèles SAL et SAL [54, 59, 60].

Figure 4. Activité caspase-3/7 dans le modèle de MP induit par SAL. Trois exemplaires en au moins quatre jours indépendants. * P comparé au véhicule avec 500 uM SAL, # P comparé au véhicule sans 500 uM SAL.

2.7. Identification de l'activité neuroprotectrice de la cytokinine dans le modèle de mort cellulaire induite par le glutamate

Comme les cellules SH-SY5Y n'expriment pas toutes les sous-unités des récepteurs NMDA [61], le mécanisme le plus probable de la toxicité du glutamate (Glu) est le blocage de l'antiporteur Xc cystine/glutamate avec induction massive de stress oxydatif [62]. Les auteurs précédents ont déjà démontré une association entre la mort cellulaire induite par le glutamate et la nécroptose dans les cellules SH-SY5Y [63], et l'importance de l'activation de la caspase -3 dans la toxicité induite par le glutamate à leur égard [62,64]. Plusieurs études ont également montré la survenue d'une mort cellulaire induite par le fer (ferroptose) après une intoxication au glutamate [62, 65, 66], et ont indiqué la survenue de trois types de mort cellulaire (nécroptose, apoptose et ferroptose) suite au blocage du Xc -système antiporteur. Afin de réaliser une évaluation complète de laneuroprotecteurpotentiel du testécytokinines, le système de test de mort cellulaire induite par le glutamate a été inclus dans un panel analytique avec leneuroprotecteurchélateur du fer déféroxamine (DFO) et inhibiteur de la nécroptose nécrostatine-1 (NEC-1) [67] comme témoins positifs. Ici, les cellules SH-SY5Y ont été différenciées pendant 48 h, puis traitées avec 160 mM de Glu ou en co-traitement avec diverscytokinineconcentrations ({{0}}.1–10 uM) pendant 24 h et colorées par PI. Dans ce modèle, l'effet de Glu sur la mort cellulaire était un signal PI de 100 %, de sorte que la réduction de la mort cellulaire par les composés testés a été évaluée. Glu a induit une augmentation presque 4- de la mort cellulaire par rapport aux témoins sains SH-SY5Y (26,1 ± 0,42 %). Dépistage des témoins positifs etcytokininesont révélé que les deux témoins positifs NEC-1 (50 uM, 76,6 ± 2,51 %) et DFO (10 uM, 84,2 ± 4,54 %) diminuaient la mort cellulaire induite par le glutamate. Comme le montre la figure 5A, à partir du panneau decytokinines, seulement troiscytokininesont pu protégerneurone-comme les cellules SH-SY5Y de la même manière que les témoins positifs. Le plus actifcytokininesétaient trans-zéatine (tZ) (0.1 uM, 79,5 ± 2,91 % ; 1 uM, 81,3 ± 2,77 %) et cis-zéatine (CZ) (0.1 uM, 82,1 ± 3,29 pour cent ; 1 uM, {{20}}.2 ± 2,89 pour cent) et kinétine (K) (1 uM, 88.0 ± 3,76 pour cent ; 10 uM, 79,9 ± 3,44 %). Pour confirmer leur activité prometteuse, un test orthogonal a été utilisé pour élucider plus en détail les effets biologiques des CK dans ce modèle : un test de libération de lactate déshydrogénase (LDH) [68], qui a également montré un spectaculaire (4- fois) augmentation de la toxicité suite au traitement au Glu. Fait intéressant, la détermination de la libération de LDH nous a permis de différencier les activités des CK des témoins positifs (NEC-1 et DFO). Les CK avaient une activité protectrice modérée mais significative (tZ a réduit les taux de mortalité à 91,9 ± 1,40 % à 0,1 uM ; cZ les a réduits à 92,3 ± 1,15 % à 0,1 uM et 91,7 % ± 1,56 % à 1 uM ; K les a réduits à 92,2 ± 1,06 pour cent à 1 uM). Les témoins positifs NEC -1 et DFO avaient des effets protecteurs plus forts mais étaient efficaces à des concentrations beaucoup plus élevées (réduisant les taux à 76,9 ± 2,94 % et 81,6 ± 3,74 % à 50 et 10 uM, respectivement) (Figure 5B). Le test LDH a validé les indications obtenues avec la coloration PI et les effets observés des contrôles positifs étaient cohérents avec les données publiées [69,70]. Les découvertes concernant les effets de K dans le modèle de mort cellulaire induite par Glu dans les cellules HT22 [18] et nos observations des effets de CK représentatives telles que tZ, cZ et K montrent que les CK sont des candidats prometteurs pour le traitement des maladies neurodégénératives associées au stress oxydatif [ 71]. Enfin, tZ et cZ ont été préférés car ils étaient efficaces à des concentrations plus faibles et ont été sélectionnés, avec K, pour d'autres études de leurs effets sur les niveaux de stress oxydatif et l'activation de la caspase-3,7.

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2.8. Effets des cytokinines sur le stress oxydatif induit par Glu dans les cellules SH-SY5Y

Contrairement au modèle précédent, Glu peut induire un stress oxydatif dans les cellules SH-SY5Y par différentes voies. L'une est basée sur le blocage de l'antiport Cystine/glutamate (Xc-), qui entraîne une déplétion en glutathion (GSH) et des effets négatifs sur l'activité de la superoxyde dismutase (SOD) [62]. La mort cellulaire médiée par Glu implique également la formation de ROS induite par la Rac-NADPH-oxydase (en particulier le radical superoxyde) dans les cellules SH-SY5Y [72]. Ces résultats indiquent que la principale cause de mort cellulaire dans le modèle induit par Glu est la SG. Au sein du modèle,neurone- des cellules de type Glu ont été co-traitées avec Glu et des composés testés, colorées par DHE et observées par microscopie à fluorescence. Comme on peut le voir sur la figure 6A, une augmentation spectaculaire de la fluorescence du DHE rouge a été observée dans les cellules traitées au Glu, qui a été améliorée par les substances témoins positives et les CK testées. Sur la base de l'observation au microscope, la quantification des niveaux de superoxyde a été effectuée dans les cellules induites par Glu d'une manière similaire, par le test DHE, à celles des cellules induites par SAL. Les résultats ont été normalisés par rapport aux niveaux induits par Glu seul (fixé à 100 %), ce qui a entraîné une augmentation spectaculaire, presque 3- fois, des niveaux de superoxyde en seulement 4 h dansneurone-like SH-SY5Y par rapport aux niveaux dans les cellules témoins saines (CTR : 33,79 ± 1,45 %). Comme le montre la figure 6B, les CK telles que tZ, cZ et K ont considérablement réduit le niveau de superoxyde dans les cellules intoxiquées par le Glu : 0.1 uM tZ, 0.1 uM cZ, 1 uM et 10 uM K l'a réduit à 81,0 ± 4,03, 80,6 ± 3,89, 81,8 ± 3,39 et 83,8 ± 2,32 pour cent des niveaux dans les cellules traitées avec Glu seul. Ces niveaux sont comparables à ceux obtenus avec l'inhibiteur de nécroptose NEC -1 (80,5 ± 3,19 % à 5 uM et 80,4 ± 2,70 % à 50 uM) et le chélateur de fer DFO (80,2 ± 3,80 % à 10 uM). Les résultats obtenus avec le modèle de mort cellulaire induite par Glu, en particulier les effets des témoins positifs, sont cohérents avec les rapports précédents [70,73]. Les preuves antérieures que les CK ont des effets de réduction de la SG dans des modèles induits par Glu ou similaires se limitent à une démonstration que K est un puissant agent de réduction de la SG (à environ 23 uM) dans le modèle de mort cellulaire induit par Glu à base de cellules HT22 [18 ]. Nous avons constaté que K avait un effet réducteur de la SG à des concentrations plus faibles (1 à 10 uM) dans nos cellules SH-SY5Y. De plus, des effets bénéfiques à long terme de tZ sur les fibroblastes humains, y compris une activité de décomposition du peroxyde d'hydrogène, ont été observés [15], suggérant que tZ et cZ pourraient avoir des effets indirects de réduction de la SG dans les modèles de mort cellulaire induits par Glu. De plus, d'autres rapports ont souligné les associations entre l'effet de réduction de la SG médié par les CK et l'activité protectrice [22, 74–76]. Pris ensemble, tZ, cZ et K ont montré des effets de réduction de la SG étonnamment forts, comparables à ceux des témoins positifs, malgré des forces différentes dans l'ensemble.neuroprotecteureffet.

Figure 5. (A) Taux de mortalité desneurone-comme les cellules SH-SY5Y dans le modèle de mort cellulaire induit par le glutamate (Glu); (B) Toxicité induite par Glu (libération de LDH) deneurone-comme les cellules SH-SY5Y. Triplicats en au moins trois jours indépendants.* P comparé au véhicule avec 160 uM de Glu, # P comparé au véhicule sans 160 uM de Glu.

Figure 6. (A) Stress oxydatif induit par Glu (OS) et activité de réduction de l'OS des composés indiqués chez l'hommeneuroneCellules de type SH-SY5Y visualisées par microscopie à fluorescence après marquage au dihydroéthidium (DHE). Barres=50 euh. Les images montrentneurone-cellules SH-SY5Y de type SH-SY5Y traitées par DMSO (témoin), 160 mM de glutamate (Glu) seul et avec : 10 uM de déféroxamine (plus DFO), 50 uM de nécrostatine{{6} } ( plus NEC -1), 0,1 uM tZ ( plus tZ) et 0,1 uM cZ ( plus cZ) pendant 4 h, puis coloré par DHE. (B) Formation de radicaux superoxyde induite par Glu dansneurone-comme les cellules SH-SY5Y après 4 h. Le graphique affiche la quantification des cellules colorées au DHE à l'aide du lecteur de microplaques Infinite M200 Pro (Tecan, Autriche). Trois exemplaires en cinq jours indépendants.

* P comparé au véhicule avec 160 uM de Glu, # P comparé au véhicule sans 160 uM de Glu.

2.9. Effets des cytokinines sur l'activité de la caspase-3/7 dans le modèle de mort cellulaire induite par Glu

Glu a des effets toxiques similaires sur les cellules SH-SY5Y aux effets précédemment rapportés sur les cellules HT22 associées au blocage de l'antiporteur Xc. Ainsi, des mécanismes de mort cellulaire non apoptotiques (ferroptose, nécroptose, etc.) sont impliqués dans les deux cas [62] bien que l'expression de la caspase -3 et, dans une certaine mesure, de la sous-unité NMDA de NR1 puisse être plus fortement présente dans SH -Cellules SY5Y [61]. Par conséquent, les étapes finales de la mort cellulaire dans les deux lignées cellulaires peuvent différer. Un rôle contributif de l'activité caspase -3 a été observé dans de nombreuses études dans le modèle de mort cellulaire induit par Glu des cellules SH-SY5Y [62, 77–79]. Dans cet essai,neuroneLes cellules de type SH-SY5Y ont été traitées ici avec 160 mM de Glu, ce qui entraîne une élévation de l'activité caspase-3/7. Dans le but d'élucider le rôle de l'apoptose dans la mort induite par Glu des cellules SH-SY5Y, un inhibiteur spécifique de la caspase-3/7, Ac-DEVD-CHO, a été appliqué et s'est avéré avoir un fort effet inhibiteur : à 50 nM, il a réduit l'activité de la caspase-3,7 à 23,70 ± 1,01 % du niveau dans les cellules traitées

avec Glu seul et à 0.5 uM, il a presque complètement bloqué l'activité (la réduisant à un niveau normalisé de seulement 7,22 ± 1,05 % ; comparable au niveau observé dans les cellules saines :

7,8 ± 0.39 pour cent), comme illustré à la Figure 7. L'application de témoins positifs a entraîné une diminution progressive dose-dépendante de l'activité caspase-3,7. Fait intéressant, NEC-1 a eu un léger effet avec un effet maximum à 50 uM et DFO a eu une activité inhibitrice plus robuste à 10 uM (réduisant l'activité à 80,5 ± 1,85 et 75,8 ± 3 .00 pour cent , respectivement). D'autre part, seuls des effets légers mais significatifs sur casp-3,7 ont été obtenus par tZ à 1 uM (89,5 ± 2,50 %), cZ à 0,1 uM (87,4 ± 1,62 %) et K à 1 uM ( 91,0 ± 2,06 pour cent). Pris ensemble, les résultats montrent que les deux témoins positifs avaient une activité de diminution de l'activité caspase-3/7 plus forte que les CK testées, mais les CK avaient des effets à des concentrations beaucoup plus faibles. Dans l'ensemble, les résultats indiquent que la modulation de l'activité caspase-3/7 joue un rôle clé dans le puissantneuroprotecteuractivité d'agents tels que DFO [58] dans le modèle de mort cellulaire induit par Glu [79, 80]. Cependant, comme indiqué dans cette section, NEC-1 avait égalementneuroprotecteuractivité, suggérant que d'autres types de mort cellulaire pourraient être impliqués dans la mort induite par Glu des cellules SH-SY5Y de type neurone [63, 67, 81]. Des indications que des mécanismes indépendants de la caspase sont impliqués dans la mort cellulaire induite par Glu ont également été obtenues dans des analyses des effets de NEC-1 [70], DFO [69] et K [18] sur les cellules HT22.

Figure 7. Activité caspase-3/7 dans le modèle Glu des dommages oxydatifs deneurone-comme les cellules SH-SY5Y. Trois exemplaires en au moins quatre jours indépendants. * P comparé au véhicule avec 160 uM de Glu, # P comparé au véhicule sans 160 uM de Glu.

3. Conclusion

En résumé, notre étude a révélé que les CK et leurs métabolites ontneuroprotecteuractivités dans le modèle induit par SAL dela maladie de Parkinsonet dommages oxydatifs induits par Glu dans le SH-SY5Y différencié humainneuronalcellules. K3G, cZR et iPR se sont avérés avoir une signification biologiqueneuroprotecteurActivités. De plus, les CK actives étaient efficaces à des concentrations inférieures (sub-micromolaires et micromolaires) à la substance témoin positive NAC. K3G, cZR et iPR ont également eu des effets positifs sur la viabilité, la cytotoxicité, le stress oxydatif et l'activité caspase-3,7 (sauf iPR). Les démonstrations orthogonales indiquent fortement que l'activité anti-oxydante du stress joue un rôle clé dans les effets protecteurs des CK dans le modèle de mort cellulaire induite par SAL. Seuls trois métabolites du panel testé de CK (tZ, cZ et K) sont protégésneurone-like SH-SY5Y dans le modèle de dommages oxydatifs induit par Glu de la même manière que le chélateur du fer NEC1 et l'inhibiteur de la nécroptose DFO. Pour confirmer leur activité prometteuse, nous avons testé leurs effets dans un test de libération orthogonale de lactate déshydrogénase (LDH). Les CK avaient une activité protectrice modérée mais significative. Celle-ci était plus faible que les activités correspondantes des substances témoins, mais malgré les différences dans la modulation deneuronalsanté, les trois CK testées ont stimulé de puissantes réductions de la formation de radicaux superoxydes, de la même manière que les substances témoins positives. Les CK ont également eu des effets comparables sur le stress oxydatif induit par Glu dans les cellules SH-SY5Y à ceux de NEC1 et DFO, mais ces composés ont eu des effets inhibiteurs plus forts sur l'activité caspase-3/7 que les CK. Comme la mort cellulaire induite par Glu ne repose pas sur une voie dépendante de la caspase, comme le montrent les études sur les effets de DFO et NEC-1 sur les cellules HT-22 [70], les CK peuvent apparemment moduler à la fois la caspase- mort cellulaire dépendante et indépendante en réduisant le stress oxydatif [18, 82]. Dans les études en cours, le mécanisme d'action détaillé des CK et/ou leurs effets mitochondriaux surneuronalou des cellules d'astrocytes seront étudiées.

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4. Matériels et méthodes

4.1. Produits chimiques et réactifs

Cytokinineles étalons ont été obtenus auprès d'OlChemIm (Olomouc, République tchèque). La calcéine AM (solution à 1 mg/mL) et le kit de libération de LDH, ainsi qu'un kit d'excroissance des neurites ont été achetés auprès de ThermoFisher. Iodure de propidium, dihydroéthidium, composants du tampon de dosage caspase- 3/7, milieu DMEM/F12 1 : 1, sérum bovin fœtal, trypsine, ATRA, bromhydrate de salsolinol, sel monosodique de glutamate, déféroxamine, N-acétylcystéine , Ac-DEVD-CHO et DMSO pour les cultures cellulaires ont été achetés auprès de Sigma Aldrich (Merck). Le substrat Ac-DEVD-AMC a été fourni par Enzo Life Science.

4.2. Essais d'activité de piégeage des radicaux ORAC

La capacité des composés à piéger les radicaux libres in vitro a été déterminée par le test ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity). Brièvement, de la fluorescéine (100 uL, 500 mM) et 25 uL de la solution du composé testé ont été ajoutés à une microplaque 96-puits pré-incubée à 37oC. Ensuite, 25 uL de 250 mM 2,2<-azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride (aaph)="" was="" quickly="" added,="" the="" microplate="" was="" shaken="" for="" 5="" s="" and="" red="" fluorescence="" (with="" 485="" and="" 510="" nm="" excitation="" and="" emission="" wavelengths,="" respectively)="" was="" measured="" every="" 3="" min="" over="" 90="" min="" using="" an="" infinite="" 200="" microplate="" reader="" (tecan,="" männedorf,="" switzerland).="" nauc="" (net="" area="" under="" curve)="" values="" were="" used="" to="" express="" antioxidant="" activities="" relative="" to="" that="" of="" trolox="" (a="" synthetic="" hydrophilic="" analog="" of="" α-tocopherol,="" vitamin="" e).="" substances="" with="" orac="" values="" greater="" than="" zero="" are="" deemed="" to="" actively="" trap="" free="">

4.3. Culture cellulaire SH-SY5Y

La lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y achetée auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA, États-Unis) a été cultivée dans le Eagle's Medium modifié de Dulbecco et le Ham's F12 Nutrient Mixture (DMEM : F-12, 1:1 ), additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et de 1 % de pénicilline et de streptomycine à 37 oC dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2. Les cellules ont été passées jusqu'à 20 fois et les milieux ont été changés deux ou trois fois par semaine. La densité cellulaire a été définie en fonction de l'essai prévu (5000, 7000, 10 000 ou 20 000 cellules par puits) dans des 96-plaques multipuits dans des volumes totaux de 100 ul de milieu pour chaque expérience. Le lendemain de l'ensemencement, de l'ATRA dans 1 % de milieu FBS DMEM/F12 a été ajouté aux cellules à une concentration finale de 10 uM, et l'incubation a été poursuivie pendant 48 h supplémentaires pour induire la différenciation, permettre la formation de neurites plus longs et réduire prolifération.

4.4. Microscopie

Micrographies deneurone-like SH-SY5Y cellules ont été obtenues à l'aide d'un microscope à fluorescence DM IL LED (Leica Microsystems, Mannheim, Allemagne) avec un filtre d'excitation approprié pour le test, ou une configuration à fond clair avec un appareil photo numérique haute performance DP73 (Olympus, Tokyo, Japon ). Étant donné que le rapport signal sur bruit pour la coloration était modéré, le contraste a été légèrement ajusté dans le logiciel ImageJ (Fidji) sans affecter l'observation résultante. Les images originales sont incluses dans les documents supplémentaires.

4.5. Coloration des membranes cellulaires (kit d'excroissance des neurites, Invitrogen™)

NeuroneDes cellules de type SH-SY5Y (5000 cellules par puits) obtenues par la procédure de différenciation de 48 h ont été colorées par un kit d'excroissance de neurite (Invitrogen™) selon les recommandations du fabricant avec une modification mineure. Les cellules ont été lavées avec du PBS, marquées avec une solution du colorant de coloration membranaire fourni avec le kit (suivant le protocole pour 96 plaques multipuits) dans du PBS pendant 20 min à 37 oC, lavées à nouveau avec du PBS et visualisées au microscope à fluorescence ( avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 533 et 585 nm, respectivement).

4.6. Traitement cellulaire

Après la procédure de différenciation, le milieu de différenciation a été remplacé par un milieu DMEM/F12 à 1 % additionné de composés à tester à des concentrations de 0.1, 1 et 10 uM (avec 7000 cellules par puits pour les tests de cytotoxicité), ou avec la toxine SAL à 500 uM (avec 7000–10 000 cellules par puits) ou 160 mM Glu (avec 20 000 cellules par puits) pendant une durée appropriée pour le type de test (viabilité, mort cellulaire, etc.). Les cellules témoins ont été traitées avec un milieu contenant 0,0,1 % de DMSO.

4.7. Viabilité cellulaire et mort cellulaire

La viabilité deneuroneLes cellules de type SH-SY5Y poussant dans des microplaques 96-puits (avec environ 7000 cellules par puits) après 24 h de traitements ont été évaluées par le test Calcein AM avec une modification mineure [31]. La solution de calcéine AM dans du PBS utilisée avait une concentration de 0,75 uM et le temps d'incubation a été fixé à 50 min. Le nombre de cellules vivantes dans chaque puits a été déterminé à l'aide d'un lecteur de microplaques Infinite M200 Pro (Tecan, Autriche), avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 495 et 517 nm, respectivement.

La mort cellulaire deneurone-like (modèle SAL : 10,000 cellules par puits ; modèle Glu : 20,000 cellules par puits) a été déterminée par dosage PI, comme indiqué par Stone et al. 2003 avec une petite modification [83]. Brièvement, le milieu du modèle induit par SAL a été aspiré et remplacé par une solution à 1 ug/mL de PI dans du PBS, mais les cellules soumises à l'induction de Glu ont une adhérence plus faible, donc une solution à 1 mg/mL de PI dans du PBS a été ajoutée à donner une concentration finale de 1 ug/mL. Dans les deux cas, les cellules ont été incubées pendant 15 à 25 minutes supplémentaires à température ambiante, puis la fluorescence PI a été mesurée par un lecteur Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Autriche) avec respectivement 535 et 617 longueurs d'onde d'excitation et d'émission. La fluorescence PI résultante obtenue avec les toxines seules a été fixée à 100 % de mort cellulaire.

4.8. Mesure du Stress Oxydatif par le dosage du Dihydroéthidium (DHE)

Les cellules ont été différenciées et traitées comme décrit dans la section précédente pour SAL-induction (10, 000 cellules par puits, 24 h ou Glu-induction (20, 000 cellules par puits, 4 h). Après les traitements, les cellules ont été centrifugées à 500 xg pendant 330 s, puis les milieux de culture ont été remplacés (après aspiration) par une solution de DHE 10 uM dans du PBS. 96-les plaques multipuits contenant des cellules ont été incubées dans l'obscurité pendant 30 minutes à la pièce température, puis la fluorescence DHE a été mesurée par un lecteur de microplaques Infinite M200 Pro (Tecan, Grödig, Autriche) avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 500 et 580 nm, respectivement La fluorescence DHE résultante obtenue avec SAL ou Glu seul a été définie comme un radical superoxyde à 100 %. Des microphotographies par fluorescence illustratives de cellules colorées au DHE ont été obtenues après mesure du DHE avec le lecteur de microplaques.

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4.9. Mesure de l'activité Caspase-3/7

Des dosages de caspase-3/7 en une étape ont été effectués selon une procédure précédemment publiée [84]. Pour les cultures soumises à l'induction SAL et à l'induction Glu, les mélanges réactionnels (caspase-3, tampon 7 et composants avec des cellules dans des plaques multipuits 96-) ​​ont été incubés pendant 2 h et 3 h à 37 oC, respectivement. L'activité caspase-3/7 a ensuite été mesurée par un lecteur de microplaques Infinite M200 Pro (Tecan, Autriche) avec des longueurs d'onde d'excitation et d'émission de 346 et 438 nm, respectivement.

4.10. Analyses statistiques

Les expériences ont été réalisées en trois exemplaires et répétées en trois à cinq (n {{0}}–5) jours indépendants. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Les valeurs de toutes les variables mesurées sont exprimées en moyennes ± SEM, qui ont été calculées à l'aide de Prism 8.4.3 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA), qui a également été utilisé pour générer les chiffres. L'analyse statistique a été réalisée par le progiciel PAST (ver. 1.97) [85]. Pour l'expérience de différenciation, le test t de Student a été utilisé. Le reste des expériences a été évalué par le test non paramétrique de Kruskal – Wallis avec test post hoc de Mann – Whitney avec correction séquentielle de Bonferroni. Une valeur de p < 0,05="" était="" considérée="" comme="">

Documents supplémentaires : Les images originales sont disponibles en ligne.

Contributions des auteurs : les contributions des auteurs ont été les suivantes : enquête, méthodologie, validation, analyse des données, GG, CWD et JG ; rédaction—préparation du brouillon original GG, CWD et MS ; conservation des données, acquisition de financement, supervision, rédaction-révision et édition, CWD, MS et PK Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement : Ce travail a été soutenu financièrement en partie par des subventions de l'Agence interne de subventions de l'Université Palacky à Olomouc, en République tchèque (IGA{{0}}PrF_2020_021), l'Agence tchèque de subventions ({{ 2}}S), et le Fonds européen de développement régional—Projet ENOCH (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/ 16_019/ 0000868) et une bourse étudiante du Fonds de dotation de l'Université Palacky.

Déclaration du comité d'examen institutionnel : sans objet.

Déclaration de consentement éclairé : non applicable.

Déclaration de disponibilité des données : les données sont contenues dans l'article ou le matériel supplémentaire.

Remerciements : Les auteurs remercient Dita Jordovd, Jana Hrubešovd et Lucie Koplikovd pour leur excellente assistance technique. En outre, les auteurs remercient Sees-editing Ltd., Royaume-Uni, pour l'édition anglaise du manuscrit.

Conflits d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.

Disponibilité des échantillons : Les échantillons des composés ne sont pas disponibles auprès des auteurs.