PARTIE Ⅱ : Préconditionnement et postconditionnement de la metformine pour réduire les lésions de reperfusion de l'schémie dans un modèle de perfusion normothermique de machine de rein de rat et de porc Lsolated Ex Vivo
Mar 26, 2022
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Tobias M.Huink,Leonie H.Venemal,Rene A.Posma,Nynke J.de Vries, Andrie C.Westerkampl,& et al.
INTRODUCTION
La transplantation rénale est le traitement de choix pour les patients atteints d'insuffisance rénale terminale. Malheureusement, la demande est supérieure à la disponibilité des organes.2 Cette pénurie a entraîné une utilisation accrue d'organes de qualité sous-optimale provenant de donneurs après décès circulatoire (DCD).5 Les reins des donneurs DCD sont plus susceptibles aux lésions d'ischémie-reperfusion (IRl), qui est liée à des incidences significativement plus élevées de fonction retardée du greffon, affectant à la fois les résultats à court et à long terme. déclenchant une cascade de réponses cellulaires néfastes.67 La sévérité de l'ischémie est fortement corrélée à l'échec précoce du greffon rénal après une transplantation rénale et contribue à l'augmentation de la morbidité. Par conséquent, l'ischémie chaude (W) pendant le prélèvement et l'implantation d'organes, et le temps d'ischémie froide pendant la conservation, respectivement, doivent être réduits au minimum. Les stratégies de perfusion de la machine peuvent jouer un rôle central dans la diminution de l'IRI en fournissant de l'oxygène pendant les phases ischémiques du don d'organes. En outre, il fournit une plate-forme pour ajouter d'éventuels agents protecteurs avant la reperfusion (préconditionnement) ou pendant la reperfusion (post-conditionnement) et constitue une méthode appropriée pour évaluer la fonction rénale et les lésions à court terme.9-11
Le biguanidemetformineest le médicament antihyperglycémiant oral le plus utilisé pour traiter les patients atteints de diabète de type 2. Le mécanisme d'action et les effets pléiotropes demetforminerésultent principalement de l'inhibition du complexe 1 au sein de la chaîne respiratoire mitochondriale.12-14 Par conséquent,metforminepeut atténuer l'IRI au-delà de ses actions hypoglycémiantes et a été proposé comme agent de protection des organes dans les circonstances où l'IRI se produit, comme la transplantation.15,16
Le but de cette étude était d'évaluer les effets bénéfiques potentiels du préconditionnement et du postconditionnement avecmetforminesur l'IRI dans deux modèles différents de perfusion de machine normothermique ex vivo (NMP) isolés utilisant des reins de rat et de porc.
NOURRIR LES REINS :CISTANCHE AUX HERBES DU DRAGON
MÉTHODES
Étude sur les rats
Animaux.Des rats Lewis mâles pesant 270-300 g ont été utilisés (Harlan Laboratories, Boxmeer, Pays-Bas). Le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Groningue a approuvé le protocole d'étude (DEC6708C). Les animaux ont reçu des soins conformément à la loi néerlandaise sur les expérimentations animales, conformément aux principes de protection des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé.
Conception expérimentale, prélèvement d'organes et préservation.Un total de 31 rats ont été divisés en 6 groupes (n=5-6 par groupe ; Figure 1). Dans tous les groupes, 15 minutes de W et 24 heures de conservation au froid ont été utilisées pour induire une lésion ischémique. Le préconditionnement a été réalisé en administrant 300 mg/kgmetformine(chlorhydrate de 1,1-diméthylbiguanide ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) dissous dans une solution saline (00,9 % de NaCl) ou une solution saline seule par gavage oral 12 et 2 heures avant la néphrectomie. Solution saline, 30 mg/Lmetformineou 300mg/Lmetforminea été ajouté au perfusat comme agent de post-conditionnement. La concentration de 300 mg/kg de poids corporel a été choisie, car cette dose entraînait unemetforminedes concentrations qui correspondent à celles trouvées chez l'homme lors de l'entretienmetforminethérapie.17
Le prélèvement de reins a été effectué avec des modifications mineures de la procédure DCD, comme décrit précédemment.18 En bref, les rats ont été anesthésiés avec 2 à 5 % d'isoflurane et une laparotomie a été réalisée via une incision médiane. L'anticoagulation, utilisant 500 UI d'héparine (Leo Pharma, Ballerup, Danemark), a été administrée via la veine pénienne dorsale. Après 15 minutes de WI, une néphrectomie du rein gauche a été réalisée. L'artère rénale et l'uretère ont été canulés. Le rein a été rincé in situ avec 10 ml de solution saline (37 degrés) et 5 ml de solution de stockage à froid à 4 degrés de l'Université du Wisconsin (UW) (Bridge to Life, Columbia, SC). Une fois retirés, les reins ont été à nouveau rincés avec 5 ml d'UW et stockés dans l'UW pendant 24 heures à 4 degrés.
Machine à perfusion normothermique.La méthode NMP de rat a été largement décrite précédemment.18 En bref, la NMP a été réalisée pendant 90 minutes à l'aide d'une pompe à rouleaux (Ismatec ISM404, Zürich, Suisse). La pression de perfusion était fixée à 102 mmHg, contrôlée au niveau de l'artère rénale. Dans le groupe témoin, le liquide de perfusion consistait en 100 ml de William's Medium E additionné de 30 mmol/L HEPES, 50 g/L d'albumine et 7 mmol/L de créatinine (tous Sigma-Aldrich). Dans les groupes expérimentaux, soit 30 ou 300 mg/Lmetforminea été ajouté au perfusat. Le liquide de perfusion a été oxygéné avec 95 % d'oxygène et 5 % de dioxyde de carbone avec un débit de 0,5 L/min. La température du liquide de perfusion a été maintenue à 37 degrés à l'aide d'un bain-marie et d'un échangeur de chaleur (Julabo, Seelbach, Allemagne). Le débit a été enregistré toutes les 10 minutes, à l'aide d'un capteur de débit calibré (ME1PXN Inline, Transonic Systems, Ithaca, NY). Après la NMP, les biopsies des reins ont été immédiatement immergées dans du formaldéhyde à 4 % ou congelées instantanément dans de l'azote liquide, puis stockées à -80 degrés.
Figure 1Représentation schématique des groupes expérimentaux. Les groupes contiennent 5 à 7 reins. HMP, machine à perfusion hypothermique ; NMP, machine à perfusion normothermique ; WIT, temps d'ischémie chaude.
Étude porcine
Animaux.Des reins de porcs femelles Dutch Landrace ont été prélevés dans un abattoir. Les animaux ont été étourdis et saignés selon les procédures standard locales. Au cours de l'exsanguination, environ 1 L de sang a été prélevé dans un récipient contenant 25 000 UI d'héparine non fractionnée (Leo Pharma). Étant donné que des déchets d'abattoir ont été utilisés, aucune approbation du comité d'éthique animale n'a été requise.
Conception expérimentale, prélèvement d'organes et préservation.Pour induire une lésion ischémique, 30 minutes de WI ont été utilisées. Après cette période, le rein a été rincé avec 180 ml de solution saline à 4 degrés. Immédiatement après le rinçage, une biopsie corticale a été prélevée (Invivo, Best, Pays-Bas) et conservée dans du formaldéhyde tamponné à 4 %. Pour faciliter le transport de l'abattoir au laboratoire et comme technique de conservation, l'artère rénale a été canulée et les reins ont été attachés à une configuration de perfusion hypothermique à pression pulsée (HMP) (Kidney Assist Transport ; Organ Assist, Groningen, Pays-Bas ). Les reins ont été perfusés à 4 degrés à l'aide de 500 ml de solution de perfusion pour machine UW pendant 3 heures (Bridge to Life, Londres, Royaume-Uni) avec ou sans l'ajout de 2 mgmetformine, avec une pression artérielle moyenne de 25 mmHg. L'oxygène (100 %) a été fourni à l'oxygénateur (Hilite LT1000 ; Medos Medizintechnik AG, Stolberg, Allemagne) avec un débit fixe de 0,1 L/min.
Machine à perfusion normothermique.Les reins ont été reperfusés en utilisant une configuration NMP ex vivo pendant 4 heures qui a été décrite précédemment. Dans notre étude, l'augmentation des doses demetformineou une solution saline ont été ajoutés à l'aide d'une pompe à perfusion. En bref, après HMP, l'artère rénale a été canulée et rincée. L'uretère a été canulé pour la collecte d'urine. Ensuite, le rein a été pesé et une biopsie a été prise et stockée dans du formaldéhyde tamponné à 4 % pour une analyse plus approfondie. Par la suite, les reins ont été placés dans un circuit NMP à pression contrôlée ex vivo. La NMP a été réalisée avec 500 mL déleucocytés (BioR 02 plus ; Fresenius Kabi, Bad Homburg, Allemagne) sang autologue oxygéné (carbogène, débit 0,5 L/min) pendant 4 heures à une pression artérielle moyenne de 80 mmHg. D'autres composés ajoutés au liquide de perfusion sont fournis dans le tableau S1. Dans le groupe expérimental,metforminedissous dans la solution de lactate de Ringer (20 mg/mL ; Baxter, Utrecht, Pays-Bas) a été perfusé à l'aide d'une pompe à perfusion contrôlée par un logiciel sur mesure dans lequel des profils de perfusion pouvaient être définis (Alaris ; CareFusion, Rolle, Suisse). Toutes les 30 minutes pendant le NMP , la vitesse de perfusion a été augmentée selon un schéma prédéfini (Tableau S2). Ce schéma était basé sur des données pharmacocinétiques humaines indiquant quemetformineest quatre fois plus élevée que la clairance de la créatinine.19 Dans le groupe témoin, les reins ont été perfusés sans addition demetformine. Pour chaque expérience, le débit a été enregistré à l'aide de la sonde de débit clampon (ME7PXL ; Transonic Systems), qui était fixée au tube à proximité de l'artère rénale. Cette sonde de débit a été calibrée pour la tubulure utilisée. Toutes les 15 minutes pendant la NMP, l'urine a été collectée et remplacée par un volume correspondant de solution de lactate de Ringer, qui a également été enregistré. La température du liquide de perfusion a été maintenue à 37 degrés à l'aide d'un échangeur de chaleur intégré, relié à un bain-marie (Julabo). Des échantillons de sang et d'urine ont été prélevés après 15 et 60 minutes et toutes les heures suivantes pour des analyses biochimiques. Une fois la NMP terminée, des biopsies ont été prélevées et stockées dans du formaldéhyde tamponné à 4 %, ou congelées instantanément et stockées à -80 degré pour une analyse plus approfondie.
AMÉLIORER LA FONCTION RÉNALE SUPPLÉMENT CISTANCHE
Les deux études
Analyses biochimiques.Les échantillons de perfusat et d'urine ont été centrifugés (1 300 g pendant 10 minutes dans le modèle de rat et 1,000 g pendant 12 minutes dans le modèle porcin, respectivement, tous deux à 4 degrés) et le surnageant a été stocké à {{7} } diplôme . La lactate déshydrogénase (LDH), l'aspartate aminotransférase (ASAT) et la créatinine ont été déterminées dans le perfusat et la créatinine dans l'urine, respectivement, par le Laboratoire du Centre médical universitaire de Groningue à l'aide d'analyses biochimiques standard. La quantité de protéines excrétées dans l'urine de rat a été mesurée à l'aide d'un dosage de protéines Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), tandis que la concentration totale de protéines dans l'urine de porc a été mesurée à l'aide d'analyses biochimiques standard au laboratoire.
Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel.La réaction en chaîne par polymérase (PCR) en temps réel a été réalisée selon les procédures standard sur le système de PCR en temps réel Tagman Applied Biosystems 7900HT, comme décrit précédemment. codant pour l'ET-1 ); la monoxyde d'azote synthase endothéliale (eNOS) ; et le facteur 2 de type Krüppel (KLF-2), l'activation endothéliale (facteur de Von Willebrand (wWF) ; la molécule d'adhérence des cellules vasculaires 1 (VCAM -1) et IL-6), et la protéine de choc thermique 70 (HSP-70) a été réalisée avec les ensembles d'amorces répertoriés dans le tableau S3.En bref, l'ARN total a été extrait des coupes de rein à l'aide TRlzol (Life Technologies, Gaithersburg, MD). L'ADNc obtenu à partir de rats a été utilisé comme référence interne pendant la PCR pour tester l'efficacité de l'amorce. L'expression génique a été normalisée avec la moyenne de la teneur en ARNm de l'actine. Les résultats ont été exprimés sous la forme 2- △ACT, où la valeur CT représente la différence entre les valeurs de seuil de cycle.
Figure 2Paramètres de perfusion et de fonction rénale évalués pendant et après la perfusion normothermique de reins de rat et de porc. Clairance totale de la créatinine des reins de rat (a) et de porc (b). Production totale d'urine (c, d) et protéines totales excrétées dans l'urine (e, f) des reins de rat et de porc, respectivement. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard de la moyenne. Les groupes contiennent 5 à 7 reins. *P < 0.05="" et="" **p=""><>
Cotation morphologique.Les biopsies stockées dans du formaldéhyde à 4% ont été incluses dans de la paraffine et ont été coupées en tranches de 4 μm. Les coupes ont ensuite été colorées avec de l'acide périodique de Schiff et notées sur la nécrose des cellules tubulaires proximales (allant de légère à sévère : 1-5), l'œdème (allant de léger à sévère :1-4) et la vacuolisation des cellules tubulaires proximales ( allant de léger à sévère : 1-4).21 L'évaluation histopathologique a été effectuée en aveugle par deux chercheurs. Un pathologiste clinique indépendant possédant une vaste expérience dans l'évaluation des signes histopathologiques de blessure après la perfusion machine d'organes de rat et de porc a validé les scores.
Calculs.La résistance vasculaire intrarénale (RVI) a été calculée en divisant la pression artérielle moyenne par le débit (exprimé en mmHg/mL min). La clairance de la créatinine a été calculée pour estimer le taux de filtration glomérulaire à l'aide de l'équation suivante : [créatinine dans l'urine]* débit urinaire/[créatinine dans le perfusat].
Analyses statistiques.Toutes les données sont exprimées en tant que moyenne ± erreur standard de la moyenne. Lors de la comparaison de deux groupes à un moment donné, les différences ont été évaluées à l'aide d'un test t de Student non apparié. Les différences pour la production totale d'urine, les scores morphologiques et l'expression des gènes ont été testées à l'aide d'une analyse de variance. Tous les tests statistiques sont bilatéraux et P inférieur ou égal à 0.05 a été considéré comme statistiquement significatif. La version 23 de SPSS Statistics (IBM, Armonk, NY) a été utilisée pour toutes les analyses. L'aire sous la courbe (ASC) a été calculée selon la règle du trapèze et a été utilisée pour approximer la clairance totale de la créatinine, la quantité totale de protéines excrétées dans l'urine et les niveaux totaux d'ASAT et de LDH dans le perfusat.
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