Expression humaine de l'alpha défensine 5 dans le rein humain et les voies urinaires
Mar 16, 2022
Pour plus d'informations : ali.ma@wecistanche.com
John David Spencer et autres
Résumé
Arrière plan:Les mécanismes qui maintiennent la stérilité dans les voies urinaires sont incomplètement compris. Des études récentes ont mis en cause l'importance des peptides antimicrobiens (AMP) dans la protection des voies urinaires contre les infections. Ici, nous caractérisons l'expression et la pertinence de l'alpha-défensine humaine AMP 5 (HD5) chez l'humainun reinet des voies urinaires chez les sujets normaux et infectés.
Méthodologie/Conclusions principales :Utilisation d'ARN isolé de l'hommeun rein, de l'uretère et du tissu vésical, nous avons effectué une PCR quantitative en temps réel pour montrer que DEFA5, le gène codant pour HD5, est exprimé de manière constitutive dans l'ensemble des voies urinaires. Avec la pyélonéphrite, l'expression de DEFA5 a augmenté de manière significative dans leun rein. En utilisant l'analyse immunoblot, la production de HD5 a également augmenté avec la pyélonéphrite. Immunomarquage localisé HD5 à l'urothélium de la vessie et de l'uretère. Dans le rein, HD5 était principalement produit dans le néphron distal et les tubules collecteurs. En utilisant des tests immunoblot et ELISA, HD5 n'a pas été systématiquement détecté dans des échantillons d'urine humaine non infectés, ce qui signifie que la production urinaire de HD5 a augmenté avec l'infection des voies urinaires par E. coli.
Conclusions/Importance :DEFA5 est exprimé dans l'ensemble des voies urinaires chez les sujets non infectés. Plus précisément, HD5 est exprimé dans l'urothélium du bas appareil urinaire et dans les tubules collecteurs duun rein. Avec l'infection, l'expression de HD5 augmente dans leun rein, et les niveaux deviennent détectables dans l'urine. À notre connaissance, nos découvertes représentent les premières à quantifier l'expression et la production de HD5 dans le rein humain. De plus, il s'agit du premier rapport à détecter la présence de HD5 dans des échantillons d'urine infectés. Nos résultats suggèrent que HD5 pourrait avoir un rôle important dans le maintien de la stérilité des voies urinaires.
Introduction
Le tractus urinaire, hormis le méat urétral, est généralement stérile malgré sa proximité avec la flore fécale. Les mécanismes précis par lesquels les voies urinaires maintiennent leur stérilité ne sont pas bien compris. Les mécanismes proposés contribuant à la défense des voies urinaires comprennent le débit urinaire, les altérations du pH et de l'osmolarité de l'urine, la vidange régulière de la vessie, les composants de défense chimique de l'uroépithélium et l'excrétion/l'afflux épithélial de cellules immunitaires effectrices avec stimulation bactérienne [1]. De plus, il a récemment été démontré que les peptides antimicrobiens (AMP) jouent un rôle important dans le maintien de la stérilité des voies urinaires [2]. Les AMP, qui servent d'antibiotiques naturels produits par presque tous les organismes, sont un composant omniprésent du système immunitaire inné. Les AMP sont des molécules cationiques exprimées par les globules blancs phagocytaires et les cellules épithéliales. Chez l'homme et d'autres mammifères, les défensines sont une grande famille d'AMP. Les défensines ont généralement une activité antimicrobienne à large spectre contre les bactéries gram-positives et gram-négatives, les virus, les champignons et les protozoaires [2,3]. Les défensines sont initialement synthétisées sous forme de préproprotéines et subissent un traitement pour devenir des peptides matures et biologiquement actifs [4]. Chez l'homme, les défensines sont classées dans l'une des deux familles en fonction de leur schéma de pontage disulfure - les alpha-défensines ou les bêta-défensines [5].
Dans les voies urinaires, les bêta-défensines sont largement exprimées dans l'uroépithélium. Cellules épithéliales tapissantun reinl'anse de Henle, le tubule distal et le canal collecteur expriment de manière constitutive la bêta-défensine humaine 1 (hBD1). Bien que les niveaux urinaires de hBD1 soient insuffisants pour tuer les bactéries envahissantes, hBD1 fournit un revêtement antimicrobien à action rapide des lumières tubulaires et prévient l'infection en inhibant la fixation bactérienne à l'urothélium [6]. Des études récentes indiquent que l'état redox de hBD1 affecte de manière significative la puissance antimicrobienne, de sorte que le peptide réduit est beaucoup plus puissant que la forme oxydée liée au disulfure [7]. La signification de ceci à la surface urothéliale n'a pas été déterminée. Une autre défensine, la bêta-défensine humaine 2 (hBD2) n'est pas exprimée de manière constitutive dans le tissu rénal sain ; cependant, l'expression de hBD2 est induite par l'infection [8].
Contrairement aux bêta-défensines, le rôle des alpha-défensines d'origine épithéliale n'est pas bien décrit dans les voies urinaires. L'expression et la fonction des alpha-défensines HD5 et HD6 ont été principalement rapportées dans l'intestin grêle où elles sont sécrétées par les Panethcells dans les cryptes intestinales et contribuent à l'équilibre du microbiote intestinal [9]. HD5 a également été localisé dans les voies génitales masculines et féminines, avec des preuves suggérant qu'il est inductible et important dans l'éradication de l'infection [10,11,12]. Le HD5 urinaire a été détecté chez des patients ayant subi une reconstruction de la néovessie iléale et une dérivation urinaire du conduit iléal, la source de production de HD5 étant principalement attribuée aux cellules de Paneth iléales [13,14]. HD5 a une activité antibactérienne contre les bactéries gram-positives uropathogènes courantes et les bactéries gram-négatives [15]. HD5 a également une activité antimicrobienne contre les virus uropathogènes comme l'adénovirus et le virus BK [16,17,18]. Dans cette étude, nous fournissons la description initiale et la quantification de l'expression de HD5 chez l'humainun reinet définir plus précisément son expression dans le bas appareil urinaire pendant la stérilité et l'infection.
Résultats
L'ARNm DEFA5 est exprimé de manière constitutive dans la vessie, l'uretère et les reins humains
La PCR quantitative en temps réel démontre que tous les tests de vessie, d'uretère etun reinles spécimens sans infection expriment constitutivement DEFA5. L'expression de DEFA5 était significativement plus élevée dans les voies urinaires inférieures que dans les voies urinaires supérieures (p= 0.014). Dans la vessie (n=4), l'expression moyenne de DEFA5 était de 4 656 637 transcrits pour 10 ng d'ARN et dans l'uretère (n=4) l'expression moyenne de DEFA5 était de 4 1126 170 transcrits pour 10 ngARN (Figure 1A) . Dans le rein (n=6), l'expression moyenne de DEFA5 était de 2 9376 274 transcrits pour 10 ng d'ARN. L'expression de DEFA5 a été analysée séparément dans le cortex rénal, la moelle et le bassin. L'expression de DEFA5 n'a pas varié de manière significative selon la région rénale (p= 0.45).
L'expression de DEFA5 et l'expression du peptide HD5 augmentent avec la pyélonéphrite
Analyse PCR quantitative en temps réel réalisée surtissus rénaux avecla pyélonéphrite a démontré une augmentation significative de l'expression de DEFA5 par rapport aux tissus rénaux non infectés. Avec la pyélonéphrite (n= 6), l'expression moyenne de DEFA5 a augmenté à 7 82961 052 transcrits par 10 ng d'ARN (p= 0.019) (Figure 2A).
Pour évaluer davantage cette augmentation de l'expression avec la pyélonéphrite, nous avons effectué une analyse par immunotransfert sur le mêmeun reintissu utilisé pour l'analyse PCR en temps réel afin d'évaluer les augmentations simultanées de la production de peptides HD5 (figure 2B, panneau du milieu). L'analyse par immunotransfert, à l'aide d'antisérums polyclonaux HD5, a démontré une production significativement plus élevée de peptides HD5 dans les tissus rénaux atteints de pyélonéphrite (n {{5} }) par rapport aux non infectésun reintissus(n=6). Non infectéun reintissus ont exprimé 300625 ng HD5/gramme de poids de tissu humide tandis queun reintissu avec pyélonéphriteexprimait 600621 ng HD5/gramme de poids de tissu humide (p 0,0001). Les transferts ont été sondés à nouveau avec GAPDH pour servir de contrôle de chargement (figure 2B, panneau du milieu) et une coloration à l'argent a également été réalisée pour confirmer une charge de protéines égale (figure 2B, panneau supérieur).
Le peptide HD5 est produit dans tout le rein humain et les voies urinaires
L'immunomarquage a été réalisé pour localiser la production de HD5 dans les voies urinaires. L'immunohistochimie (IHC) a montré que l'immunoréactivité HD5 était présente dans l'urothélium de l'uretère et de la vessie de tous les échantillons étudiés (n=4, figure 3). L'IHC a également montré que HD5 était produite dans les tubules du cortex rénal et de la médulla de tous spécimens (n= 6, figure 4). L'immunofluorescence (IF) a démontré que l'expression de HD5 était la plus élevée dans le néphron distal et les tubules collecteurs (Figure 5). L'interstitium et les glomérules n'ont pas montré d'immunoréactivité HD5. L'immunocoloration illustrée sur les figures 3, 4 et 5 a été réalisée à l'aide d'un anticorps anti-HD5 monoclonal de souris (8C8) qui reconnaît le propeptide HD5 (Abcam, Cambridge, MA). Les résultats étaient similaires lors de l'utilisation d'un anticorps polyclonal anti-HD5 de lapin qui reconnaît le propeptide HD5 et le peptide mature (données non présentées) - ce qui suggère que HD5 est stocké sous forme de propeptide.
Avec la pyélonéphrite, l'immunomarquage HD5 a nettement augmenté. L'immunoréactivité HD5 a augmenté dans tout le néphron proximal, le néphron distal et les tubules collecteurs (Figure 4 et Figure 5). Comme dans les échantillons non infectés, les glomérules et l'interstitium n'ont montré aucune expression de HD5 avec l'infection. Les contrôles négatifs n'ont montré aucune immunoréactivité HD5.
L'urine humaine infectée contient des concentrations mesurables de peptide HD5
L'analyse par immunoblot, à l'aide d'un antisérum polyclonal de lapin qui détecte le précurseur proHD5 et les formes traitées ultérieurement, a identifié des niveaux mesurables de HD5 dans 13 des 15 échantillons d'urine testés infectés par E. coli uropathogène (Figure 6A et B). Lorsqu'ils étaient présents, les taux de HD5, normalisés à la créatinine urinaire, variaient de 299,8 à 669,7630 ng HD5/mg de Cr urinaire (110,67 ng/mL à 276,67 ng/mL), ce qui correspond à 11,10 à 27,67 nmol/L. Dans les échantillons d'urine non infectés (n=15), le HD5 était égal ou inférieur à la limite de détection de (,50 ng). Le test immuno-enzymatique (ELISA) sur les mêmes échantillons d'urine, utilisant l'anticorps monoclonal de souris (8C8) qui détecte uniquement le précurseur proHD5, a détecté des niveaux mesurables de proHD5 dans 13 des 15 échantillons infectés testés. Les concentrations urinaires de proHD5 variaient de 122,78 à 490 060,03 ng HD5/mg de Cr urinaire (30,02 ng/mL à 200,5 ng/mL) lorsqu'elles étaient présentes (Figure 7).
Discussion
Dans cette étude, nous fournissons la caractérisation initiale de HD5 chez l'humainun rein, uretère et vessie. HD5 s'est avéré être un AMP important qui prévient l'infection invasive dans l'intestin et est régulé positivement dans le tractus génital pendant l'infection [11,18,19,20,21]. Les AMP dérivés de l'épithélium, comme HD5, se sont avérés importants pour maintenir la stérilité dans les voies urinaires [8,22,23,24]. Les déficiences de ces défenses muqueuses innées peuvent entraîner une infection aiguë et/ou chronique [25,26].
Nos résultats de PCR quantitative en temps réel démontrent que DEFA5 est exprimé de manière constitutive chez l'humainreins, les uretères et la vessie. L'expression de DEFA5 augmente des voies urinaires supérieures vers les voies urinaires inférieures - en suivant le flux du flux urinaire et la proximité croissante avec le point d'invasion du microbiote. À notre connaissance, il s'agit de la première étude à quantifier l'expression de DEFA5 dans le rein et la vessie humains. Récemment, Townes et al ont démontré que l'uretère distal normal peut exprimer DEFA5 [14]. Nos résultats suggèrent également que DEFA5 est exprimé de manière constitutive par l'uretère distal. Bien que l'expression de DEFA5 dans les voies urinaires soit presque 100- fois inférieure à celle trouvée dans les tissus gastro-intestinaux, l'expression uroépithéliale basale de DEFA5 est comparable à l'expression d'amplis urinaires décrits précédemment comme la cathélicidine, hBD-1, hBD -2, et la ribonucléase 7[6,8,22,24,27].
Contrairement au tractus gastro-intestinal mature où DEFA5 est exprimé à des niveaux élevés dans les états de santé et d'infection/inflammation, nos données quantitatives de PCR en temps réel démontrent que l'expression de DEFA5 dans leun reinest significativement régulé à la hausse avec l'infection [27,28,29]. Ce schéma d'expression inductible est analogue à l'expression de DEFA5 dans l'appareil reproducteur féminin où l'expression de DEFA5 augmente avec la salpingite [30]. Dans les voies urinaires, Townes et al ont montré une tendance à une plus grande expression urétérale de DEFA5 chez les patients atteints d'IVU ayant subi une dérivation urinaire par conduit iléal [14]
Notre analyse immunoblot complète les données de PCR en temps réel en démontrant que la production de peptide HD5 augmente avec la pyélonéphrite. Ce schéma inductible de production de HD5 est similaire à celui observé chez certains membres de la famille des bêta-défensines.hBD2 montre un schéma de production inductible avec infection des voies urinaires et/ou pyélonéphrite chronique [8,31,32]. Il a été démontré que la production de peptide HD5 augmentait dans le tractus génital féminin supérieur et l'urètre masculin avec inflammation [11,30].
En utilisant l'immunocoloration, nous démontrons que HD5 est produit uniformément dans l'urothélium de l'uretère et de la vessie. Étant donné que la grande majorité des infections urinaires résultent de la flore fécale qui remonte dans la vessie, ces résultats suggèrent que l'expression de HD5 est présente dans les endroits où l'exposition microbienne se produit le plus fréquemment [33]. Par conséquent, HD5 est idéalement positionné pour prévenir une infection microbienne ascendante. Dans leun rein, HD5 est principalement produit dans le néphron distal et le tubule collecteur. Ces résultats suggèrent que HD5 est produit dans des endroits où il sera positionné pour avoir une activité antimicrobienne optimale. Des études antérieures ont montré que les propriétés antimicrobiennes des défensines dépendent de la concentration en sel - des concentrations en sel plus élevées diminuant l'activité antimicrobienne [23,34,35]. Nous supposons que les faibles concentrations de sel du néphron distal et des tubules collecteurs fournissent un milieu favorable à l'activité antimicrobienne HD5.
L'immunoblot et l'analyse ELISA démontrent également que la HD5 est sécrétée dans l'urine à de faibles niveaux. Compte tenu de la taille (8,1 kDa et 3,7 kDa) et de la charge positive de la proHD5 et de la HD5 entièrement traitée, il est possible qu'une partie du peptide HD5 urinaire provienne, au moins en partie, du filtrat plasmatique. Pourtant, il existe peu de preuves suggérant que HD5 persiste dans le plasma [27]. De plus, pour apparaître dans l'urine, HD5 devrait échapper aux mécanismes efficaces d'absorption des peptides dans le tubule proximal [6, 36]. Enfin, les échantillons d'urine utilisés ont subi une centrifugation avant la réalisation des tests, éliminant les sources cellulaires de HD5.
Aux concentrations détectées, il est peu probable que la HD5 urinaire soit directement antimicrobienne contre les micro-organismes uropathogènes, car la HD5 entièrement transformée a une concentration minimale inhibitrice (CMI) comprise entre 6 et 10 mg/mL contre les bactéries uropathogènes à Gram négatif courantes [15]. Cependant, les concentrations à la surface des muqueuses sont susceptibles d'être plus élevées. De plus, l'analyse par immunoblot démontre que les concentrations de HD5 sont significativement plus élevées dans leun rein. Ces résultats suggèrent que HD5 est impliqué dans la défense muqueuse des voies urinaires. Un schéma analogue est observé avec hBD1, où les concentrations urinaires de hBD1 sont insuffisantes pour présenter une activité antimicrobienne, mais des concentrations plus élevées de peptides sont détectées près des tubules rénaux [6,31].
Parce que IHC démontre que proHD5 est une forme majeure de HD5 dans leun reinet parce que la mature et la proHD5 sont détectées dans l'urine, nous supposons que la HD5 est principalement sécrétée par une molécule précurseur, puis subit un traitement protéolytique pour générer des formes matures - similaires aux voies gastro-intestinales et génito-urinaires [11, 30, 37]. Dans l'intestin grêle, les cellules de Paneth produisent de la trypsine, qui clive le propeptide HD5 de sorte que le peptide entièrement traité est la forme prédominante dans la lumière intestinale [37]. Dans l'urètre masculin, les principales enzymes de traitement et d'activation du HD5 sont les protéases des neutrophiles apportées par les neutrophiles recrutés au site de l'infection [11]. Les contributions du trypsinogène épithélial, de la trypsine urinaire et/ou des protéases neutrophiles sur le traitement HD5 dans les voies urinaires au cours de l'infection restent à déterminer. De plus, les effets des modifications de l'environnement urinaire sur la fonction HD5 (altérations de l'osmolarité, du pH et des concentrations cationiques) restent également à déterminer.
En conclusion, il s'agit de la première étude à identifier et quantifier l'expression et la production de HD5 dans les voies urinaires. Nos résultats suggèrent que HD5 est un AMP dérivé de l'épithélium qui peut jouer un rôle important dans l'immunité innée de l'uroépithélium humain empêchant la translocation d'agents pathogènes envahisseurs dans la circulation. L'élucidation des facteurs qui régulent la production de HD5 peut donner un nouvel aperçu de la pathogenèse des infections urinaires chez les patients à risque d'infections urinaires et les patients atteints d'infections chroniques.
Méthodes
Approbation de l'étude
Un consentement écrit éclairé a été obtenu de tous les patients participant à cette étude. Pour les sujets de moins de 18 ans, un consentement écrit des parents/tuteurs a été obtenu. Le comité d'examen institutionnel du NationwideChildren's Hospital (NCH) a approuvé cette étude ainsi que le processus et les documents de consentement (IRB07-00383).
Échantillons de tissus humains et d'urine
Des tissus d'uretère distal et de vessie non infectés (n= 4) ont été obtenus d'enfants subissant une réimplantation urétérale pour des raisons autres qu'une infection récurrente. Non infectéun reinéchantillons (n = 6) ont été prélevés sur des patients subissant une néphrectomie pour des tumeurs rénales. Les échantillons de tissus étaient exempts de signes macroscopiques de maladie ou d'inflammation.Un reindes tissus de patients atteints de pyélonéphrite chronique ont été fournis par le Cooperative HumanTissue Network (n=6) [38]. Deux pathologistes indépendants ont confirmé le diagnostic histopathologique de pyélonéphrite. Les échantillons de tissus ont été congelés ou conservés sous forme de coupes neutres fixées au formol et incluses en paraffine. Des coupes de tissu rénal non infecté ont été disséquées dans le cortex, la moelle ou le bassinet du rein avant stockage (n=4).
Des échantillons d'urine non infectés et infectés ont été obtenus d'enfants se présentant au service des urgences du NCH ou à la clinique de néphrologie. Le diagnostic d'IU a été posé par une culture d'urine positive selon l'American Academy of PediatricsGuidelines [39]. Tous les échantillons d'urine infectés contenaient 0,106 UFC/mL d'E.coli. Les valeurs de pH urinaire variaient de 5,5 à 8,5 (urine moyenne 6,9). La composition ionique urinaire n'a pas été mesurée. Les échantillons d'urine ont été centrifugés pour éliminer les sédiments d'urine et un cocktail d'inhibiteurs de protéase a été ajouté (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA).
Isolement de l'acide ribonucléique et transcription inverse
L'ARN total a été isolé à partir de tissus congelés à l'aide du système d'isolation d'ARN PromegaTotal (Promega, Madison, WI, USA). Pour la synthèse d'ADNc, 4 à 8 mg d'ARN total ont été rétrotranscrits avec la transcriptase inverse Superscript III en utilisant une amorce oligo-(dT) 12–18 selon le protocole du fournisseur (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA).
Clonage de plasmides spécifiques au gène pour les courbes standard
L'ADNc codant pour DEFA5 et GAPDH a été cloné dans un vecteur plasmidique 4- Topo (Invitrogen) conformément aux instructions du fabricant. Les plasmides ont été séquencés pour confirmer que le bon
constructions ont été obtenues. Des dilutions en série de plasmides spécifiques à un gène ont été quantifiées (par absorbance spectrophotométrique à 260 et électrophorèse sur gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium) et utilisées dans une PCR en temps réel pour générer des courbes standard pour chaque réaction.
PCR quantitative en temps réel
Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide d'ADNc simple brin deun rein, de l'uretère et du tissu de la vessie avec des paires d'amorces oligonucléotidiques spécifiques à l'aide du système de PCR en temps réel 7500 (Applied Biosystems, Carlsbad, Californie, États-Unis). : 59- TCC CTC CTG CAG GTG ACC CCA-39 et amorce inverse DEFA5 59-GTG GCT CTT GCC TGA GAA CCT GA-39).
En bref, l'ADNc correspondant à 10 ng d'ARN a servi de modèle dans une réaction de 25 ml contenant 2,0 mM de chaque amorce et 16 Light-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green mix. Les conditions de PCR étaient les suivantes : dénaturation initiale à 95 uC pendant 10 minutes, suivie de 40 cycles, chaque cycle consistant en une dénaturation à 94 uC pendant 30 secondes, un annelage à 64 uC pendant 30 secondes et une extension à 72 uC pendant 30 secondes. L'émission de fluorescence cycle à cycle a été surveillée à 530 nm et analysée à l'aide de 7500Software V2.0.3 (Applied Biosystems). Des normes de plasmide spécifiques au gène ont été incluses avec chaque ensemble de réactions. En tant que contrôle positif, l'ARN de l'iléon terminal a été inclus dans chaque série de réactions et les résultats ont été comparés aux normes publiées précédemment [27].
Pour confirmer l'amplification par PCR du produit prévu, un échantillon représentatif a été analysé par électrophorèse sur un gel d'agarose à 1,5 %. Les produits ont été visualisés par coloration au bromure d'éthidium et comparés à des normes de taille d'ADN pour confirmer la taille de produit anticipée (non représentée). De plus, une courbe de profil de température de fusion de chaque réaction de PCR a été déterminée à la fin de chaque réaction.
Anticorps HD5
Le propeptide HD5 (AA20-94) et les formes partiellement traitées (AA36-94 et 56–94) ont été identifiés à l'aide d'un anticorps anti-HD5 monoclonal de souris (8C8) disponible dans le commerce (Abcam). Le propeptide HD5 et le peptide mature (AA63-94) a été identifié à l'aide d'un antisérum polyclonal de lapin décrit précédemment [13,40].
Immunoblot
Sections du mêmeun reinles échantillons utilisés pour l'analyse PCR quantitative en temps réel (3 à 6 mg de poids humide) ont été pulvérisés à l'aide d'un mortier et d'un pilon dans de l'azote liquide et dissous dans un tampon RIPA avec des inhibiteurs de protéase. Les protéines urinaires ont été extraites d'échantillons d'urine à l'aide du ProteospinTM Urine Protein Concentration Micro Kit (Norgen Biotek Corporation, Thorold, ON, Canada). Les concentrations de protéines rénales et urinaires ont été quantifiées à l'aide d'un test de Bradford modifié et confirmées à l'aide d'une lecture anOD280 nm. Des concentrations égales de tissu rénal ou de protéines urinaires ont été chargées sur des gels à gradient de dodécylsulfate de sodium à 18 % et soumises à une électrophorèse. Pour assurer une charge protéique égale, une coloration à l'argent a été réalisée.
Après séparation électrophorétique, les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. Après fixation avec 00,05 % de glutaraldéhyde dans du TBS, les membranes ont été bloquées dans du lait écrémé à 5 % pendant 30 à 60 minutes et incubées dans une dilution 1:1000 d'antisérum polyclonal HD5 de lapin pendant la nuit . Après lavage, l'anticorps secondaire, une IgG anti-lapin conjuguée à la peroxydase de raifort anti-lapin diluée au 1:10,000 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), a été appliquée pendant 1 heure à température ambiante. Immunoblots deun reinles tissus ont également été sondés avec un anticorps anti-GAPDH (Sigma Aldrich) pendant deux heures à température ambiante, puis incubés avec l'anticorps secondaire décrit ci-dessus. Les protéines ont été visualisées à l'aide d'un système de détection ECL et d'un film de chimiluminescence conformément aux instructions du fabricant (BioExpress, Kaysville, UT, USA).
HD5 a été quantifié en comparant les intensités de bande résultantes avec une dilution en série de la protéine proHD5 recombinante standard (Peptides International, Louisville, KY, USA).Un reinLes concentrations de HD5 ont été normalisées en fonction du poids des tissus humides. Les concentrations urinaires de HD 5 ont été divisées par la créatinine urinaire afin d'établir des ratios urinaires HD5-/créatinine standardisés (mg/mg) pour tenir compte de la dilution de l'urine. Les concentrations de créatinine urinaire ont été déterminées à l'aide du test sur microplaque de créatinine d'Oxford Biomedical Research (Rochester Hills, Michigan, États-Unis).
Immunohistochimie
Après déparaffinage, réhydratation et récupération d'antigène, un bloc de biotine et un bloc de protéines sans sérum ont été réalisés (Superblock, ScyTek Laboratories, Logan, UT, USA). Les lames ont été incubées pendant une nuit à 4 uC avec un anticorps monoclonal de souris HD5(8C8) (1 :2{{10}}0 ; Abcam) ou un antisérum polyclonal de lapin (1 :500) suivi d'un anticorps anti-polyvalent biotinylé frelaté Streptavidine/HRP (Laboratoires ScyTek). Les coupes ont été développées en utilisant du tétrachlorure de diaminobenzidine à 0,1 % avec du peroxyde d'hydrogène à 0,02 % et contre-colorées avec de l'hématoxyline. Les sections de contrôle négatif ont été incubées avec du sérum non immun à la place de l'anticorps HD5.
Immunofluorescence
Une immunofluorescence à double marquage a été réalisée pour aider à localiser l'expression de HD5 dans leun rein. Le tube collecteur a été doublement marqué pour les cellules principales avec un anticorps polyclonal de chèvre anti-aquaporine humaine -2 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californie, États-Unis) [41]. L'anse de Henle a été doublement marquée avec un anticorps polyclonal de souris anti-uromoduline humaine (Sigma-Aldrich) et le tubule proximal a été doublement marqué avec de l'aquaporine polyclonale de chèvre antihumaine-1 (Santa Cruz) [41,42]. Anti-chèvre polyclonal d'âne rhodamine (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, Pennsylvanie, États-Unis), anti-souris de chèvre rhodamine (JacksonImmunoResearch Laboratories) et anti-lapin polyclonal d'âne FITC (Santa Cruz) ont servi d'anticorps secondaires.
Toutes les sections ont été préparées comme indiqué ci-dessus. Ils ont été incubés avec un mélange d'antisérums de souris contre HD5 (1:200)(Abcam), AQP-2 (1:500), uromoduline (1:500), AQP-1 (1:400) atroom température pendant 90 minutes. L'anticorps secondaire a été appliqué pendant 90 minutes à température ambiante et les coupes ont été montées à l'aide d'un milieu de montage avec DAPI. Du sérum non immun a été utilisé comme contrôle négatif. Les lames ont été examinées avec un microscope Leica DM4000B et photographiées numériquement à l'aide d'une caméra/logiciel Spot RT (Diagnostic Instruments, SterlingHeights, MI, USA).
ELISA
Link Biotin Antibody Labeling Kit, Novus Biologicals) un anticorps monoclonal de souris pendant 2 heures à température ambiante, de la streptavidine-peroxydase de raifort (Biolegend, San Diego CA, USA) a été ajouté pendant 30 minutes. Après incubation avec une solution de substrat TMB pendant 15 minutes (Kem-En-Tec Diagnostics), la réaction a été terminée avec une solution STOP (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) et lue à une longueur d'onde de 450 nm. Les concentrations de HD5 du test ELISA ont été divisées par la créatinine urinaire pour établir des rapports HD 5-/créatinine urinaires standardisés (mg/mg) pour tenir compte de la dilution de l'urine comme décrit ci-dessus.
Références
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