PARTIE Ⅰ : Rôle de SIK1 dans la transition d'une lésion rénale aiguë vers une maladie rénale chronique
Mar 25, 2022
Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com
Jinxiu Hul, JiaoQiaot, Qun Yul, Bing Liu1 & et al.
Arrière plan
Lésion rénale aiguë(IRA), une maladie courante caractérisée par une diminution du débit de filtration glomérulaire (TFG) et une augmentation de la créatinine sérique [1], est considérée comme un facteur de risque pour le développement et la progression de la MRC [2,3]. Récemment, l'AKI-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique) transition est devenue l'un des points chauds de l'étude des maladies rénales. Bien qu'il soit rapporté que l'inflammation, l'EMT et la fibrose jouent un rôle vital dans la progression de l'IRA-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition [4,5], le mécanisme moléculaire exact de l'IRA-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)La transition n'est toujours pas claire.
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Kinase inductible par le sel 1(SIK1) fait partie de la famille des protéines kinases activées par l'AMP (AMPK), qui jouent un rôle central dans la régulation du métabolisme, la survie cellulaire et la croissance [6, 7]. Des études ont démontré que l'inhibition de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)favorise la TEM, entraînant la migration et la métastase des tumeurs[8-10]. En outre, il a été rapporté que SIK1(Kinase inductible par le sel 1)régule négativement l'activation induite par le TLR4-de NF-kB et atténue l'expression des cytokines pro-inflammatoires [11]. De plus, des preuves émergentes ont montré un lien entre SIK1(Kinase inductible par le sel 1)et les maladies rénales [6,12]. Par exemple, la régulation à la hausse de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)a inversé la prolifération élevée des cellules mésangiales induite par le glucose et l'accumulation de matrice extracellulaire (ECM) en inhibant l'expression de FN et de PAI -1, qui sont tous deux impliqués dans des troubles fibrotiques, tels que la glomérulosclérose [6,13]. Ainsi, nous supposons que SIK1(Kinase inductible par le sel 1)pourrait être impliqué dans la progression de l'IRA-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition, caractérisée par l'EMT, l'inflammation et la fibrose rénale.
La voie WNT/-caténine est une voie de signalisation complexe et hautement conservée qui régule divers processus biologiques, tels que le développement des organes, l'homéostasie tissulaire et la carcinogenèse [14, 15]. Bien que silencieux dans le rein adulte normal, il s'avère être réactivé dans diverses maladies rénales, y compris les lésions rénales aiguës, la néphropathie diabétique, la fibrose interstitielle et les maladies rénales kystiques [16]. De plus, il a été rapporté que l'extinction de la voie WNT/-caténine améliore la fibrose rénale, retardant la progression de l'IRA-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)dans les lésions induites par l'I/R [17]. Mais si SIK1(Kinase inductible par le sel 1)pourrait participer à l'AKI-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition en modulant la voie WNT/-caténine reste à clarifier.
De nouvelles preuves ont montré que Snail et Twistl, les facteurs de transcription EMT, jouent un rôle important dans la pathogenèse de la fibrose rénale[18-20]. Il a été rapporté que la suppression conditionnelle de Twistl ou Snail dans les cellules épithéliales tubulaires proximales inhibait l'EMT, atténuant la fibrose interstitielle dans la fibrose rénale induite expérimentalement chez la souris [21]. Considérant que Snail et Twist1 sont des molécules importantes situées en aval de la voie WNT/-caténine, nous avons émis l'hypothèse qu'elles pourraient également jouer un rôle vital dans SIK1.(Kinase inductible par le sel 1)AKI-CKD médiée(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition.
Ainsi, dans cette étude, nous avons cherché à élucider le rôle et le mécanisme de SIK1(Kinase inductible par le sel 1) dans AKI-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition, qui fournira une nouvelle cible thérapeutique pour la prévention clinique et le traitement de la fibrose rénale et fournira une nouvelle façon de retarder la progression de l'IRA-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition.
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matériaux et méthodes
Patients et échantillons de tissus
L'étude a été approuvée par le comité d'éthique de la recherche clinique de l'hôpital provincial du Shandong affilié à l'université du Shandong. Des échantillons de reins humains ont été prélevés chez des patients atteints d'IRA(Lésion rénale aiguë) diagnostiqués sur la base d'une biopsie rénale, et les échantillons de rein des groupes témoins ont été obtenus à partir de tissus paracancéreux de patients atteints de tumeurs rénales ayant subi une résection chirurgicale. Les échantillons de tissus ont été conservés dans de l'azote liquide et le consentement éclairé a été signé par tous les patients conformément à la Déclaration d'Helsinki.
Construction d'AAV9-Sik1(Kinase inductible par le sel 1)
Le virus adéno-associé recombinant (AAV9-Sik1) et le contrôle négatif du virus adéno-associé (AAV9-NC) ont été construits par GENECHEM (Shanghai, Chine). Le vecteur de virus adéno-associé AAV9-Sik1 recombinant GV467 comprend un promoteur, une région codant pour l'anticorps, une région codant pour la protéine fluorescente verte EGFP et une région codant pour la protéine tag 3FLAG. La capacité du vecteur AAV9 à transduire les reins a été vérifiée (fichier supplémentaire 1).
Animaux et méthodes de modélisation
Des programmes expérimentaux de modélisation et de suivi ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Shandong. Des souris C57BL/6 âgées de 4-6 semaines et pesant 15-20 g ont été fournies par l'Experimental Animal Center de l'Université du Shandong et ont été réparties au hasard en 4 groupes : groupe témoin (témoin), souris normales traitées avec le groupe AA ( AA), souris AA traitées avec AAV9-groupe Sik1 (AAV9-Sik1 plus AA), souris AA traitées avec AAV9-groupe NC (AAV9-NC plus AA) . Les souris du groupe AA ont reçu une injection d'AA (10 mg/kg) par voie intrapéritonéale, tandis que les souris du groupe témoin ont reçu une injection de PBS. Les 3, 7, 14 et 28 après l'injection d'AA, l'urine de souris de 24 h a été recueillie dans une cage métabolique et le surnageant a été stocké à -20 degré C après centrifugation. Le sang a été centrifugé à 3000r pendant 10 min et le surnageant a été stocké à -20 degré 0,24 h. Les protéines urinaires, la créatinine sérique (Scr) et l'azote uréique sanguin (BUN) ont été mesurés par l'analyseur biochimique automatique. L'IL sérique -1 et le TNF- ont été détectés par ELSA. Ensuite, les souris ont été sacrifiées et pesées. Après cela, les reins ont été excisés et pesés. Tous les échantillons de rein ont été divisés en deux parties, dont l'une a été fixée dans du paraformaldéhyde à 4 % pour la coloration histologique, tandis que l'autre a été stockée sous -80 degré pour la PCR en temps réel et la détection par Western blot.
Histologie et immunohistochimie
Après fixation dans du paraformaldéhyde à 4 %, les échantillons de rein ont été déshydratés, transparents, inclus dans de la paraffine et sectionnés en tranches de 4 μm d'épaisseur. Ensuite, les lames ont été déparaffinées, hydratées et colorées. Pour l'analyse histologique rénale, la coloration HE, la coloration PAS et la coloration trichrome de Masson ont été utilisées conformément aux instructions du fabricant. Pour l'analyse immunohistochimique, les sections ont été incubées avec un anticorps primaire contre SIK1(Kinase inductible par le sel 1)(51045-1-AP, Proteintech, États-Unis), E-cadhérine (20874-1-AP, Proteintech, États-Unis), -SMA (ab32575, Abcam, États-Unis), COL1(bs-10423R, Bioss , Pékin, Chine) à 4 degrés pendant la nuit. Après incubation avec l'anticorps secondaire, le DAB a été ajouté, suivi d'une contre-coloration nucléaire avec de l'hématoxyline. Enfin, les images ont été observées au microscope (Leica, Allemagne). Le pourcentage de coloration positive pour SIK1(Kinase inductible par le sel 1), E-cadhérine, -SMA et COLl ont été mesurés à l'aide d'un logiciel quantitatif Image-Pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD) [22].
Culture cellulaire et traitement
Des cellules épithéliales tubulaires proximales humaines (HK2) ont été cultivées dans un milieu DMEM (Gibco, États-Unis) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (Gibco, États-Unis) et de 1 % de pénicilline-streptomycine (Sigma, États-Unis) à 37 °C dans un atmosphère humidifiée contenant 5 pour cent de CO,. L'acide aristolochique (AA) (Sigma, USA) a été dissous dans du DMSO à 1 mg/mL et les cellules ont été traitées avec la concentration finale à 10 μmol/L, 20 μmol/L, 40 μmol/L et 60 μmol/L, et le groupe témoin a été traité avec la même quantité de DMSO.
Transduction de vecteurs lentiviraux et transfection d'ARNsi Les constructions d'ARNh lentivirales ciblent SIK1(Kinase inductible par le sel 1), -caténine et un shRNA brouillé, ainsi qu'un vecteur de surexpression lentiviral pour SIK1(Kinase inductible par le sel 1)et le vecteur de contrôle vide ont été construits par Cyagen (Guangzhou, Chine). Les séquences cibles sont listées comme suit : SIKI shRNA:5'-GCGCTGGCATTGATTACTATC-3';
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Résultats
SIK1(Kinase inductible par le sel 1)a été régulé à la baisse dans AKI(Lésion rénale aiguë)
Considérant que SIK1(Kinase inductible par le sel 1)joue un rôle important dans les lésions rénales, nous avons d'abord détecté l'expression de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)dans les tissus rénaux de l'IRA(Lésion rénale aiguë)patients et IRA(Lésion rénale aiguë)souris. La coloration immunohistochimique a révélé que, non seulement chez les patients mais aussi chez les souris, le SIK1(Kinase inductible par le sel 1)l'expression des tubules rénaux dans le contrôle est plus élevée que celle dans l'IRA(Lésion rénale aiguë)groupe, qui a indiqué que SIK1(Kinase inductible par le sel 1)a été régulé à la baisse pendant l'AKI(Lésion rénale aiguë)(Fig.la,b). En outre, nous avons effectué une coloration HE et trichrome de Masson pour analyser les changements histopathologiques dans des échantillons de rein d'IRA.(Lésion rénale aiguë)malades (Fig. 1c). Par rapport au témoin, un gonflement des cellules épithéliales tubulaires rénales, une dégénérescence vacuolaire et un œdème interstitiel ont été observés dans le groupe AKI par coloration HE. De plus, par rapport au témoin, des cellules tubulaires notamment aplaties, une bordure en brosse détachée et des draps tubulaires élargis ont été observés dans le groupe AKI par coloration au trichrome de Masson. Pris ensemble, tous ces résultats indiquent que SIK1(Kinase inductible par le sel 1)pourrait jouer un rôle dans la lésion tubulaire.
Fig.1 SIK1 était régulé à la baisse dans AKI(Lésion rénale aiguë).a Images représentatives de coloration immunohistochimique de SIK1 dans Control et AKI(Lésion rénale aiguë)les patients. Barre d'échelle=50 μm. Le graphique a montré l'analyse quantitative de SIK1 dans des sections colorées par immunohistochimie.b Images représentatives de coloration immunohistochimique de SIK1 dans Control et AKI(Lésion rénale aiguë)souris. Barre d'échelle=50 μm. Le graphique a montré l'analyse quantitative de SIK1 dans des coupes colorées par immunohistochimie. c Images représentatives de la coloration HE et du trichrome de Masson dans les tissus rénaux de l'IRA(Lésion rénale aiguë)les patients. Barre d'échelle=10 μm. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd * P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
SIK1(Kinase inductible par le sel 1)était régulée à la baisse dans l'AKI-CKD induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)souris de transition
Pour obtenir un modèle murin d'AKI-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition, nous avons injecté de l'AA par voie intrapéritonéale à des souris. Par rapport au témoin, les souris traitées avec l'AA ont présenté une production accrue de facteurs inflammatoires, d'EMT et de fibrose rénale (Fig. 2a-d). De plus, l'indice rénal, le Scr sérique, le BUN et les protéines urinaires sur 24 heures ont été améliorés lors du traitement aux AA (Fig. 2e). De plus, l'AA altérait la structure rénale, entraînant une atrophie des cellules épithéliales tubulaires rénales, un élargissement du limen et une ampleur différente du dépôt de fibres de collagène dans le tubulointerstitium (Fig.2f). Tout ce qui précède a indiqué que l'AKI-CKD induite par l'AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)modèle de transition a été établi avec succès. Explorer le rôle de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)dans l'IRA-IRC induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique) transition, nous avons évalué son expression dans les échantillons de reins de souris injectés avec AA. Nous avons trouvé SIK1(Kinase inductible par le sel 1)et p-SIK1(Kinase inductible par le sel 1)(Thr182) ont diminué de manière dépendante du temps après l'injection d'AA (Fig.2g), ce qui indique un rôle potentiel pour SIK1(Kinase inductible par le sel 1)dans la régulation de l'AKI-CKD induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition.
Fig.2 SIK1 était régulé à la baisse dans l'AKI-CKD induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)souris de transition.une analyse ELISA de l'IL-1 et de l'expression du TNF- dans différents groupes de souris. b Western blot et analyse PCR en temps réel de l'expression des marqueurs d'inflammation et de fibrose (Capase1/p20/p10, FN et COL1) ; c Analyse Western blot et PCR en temps réel de l'expression des marqueurs EMT (E-cadhérine, vimentine et -SMA). d Images représentatives de coloration immunohistochimique de la E-cadhérine dans différents groupes de souris. Barre d'échelle=50 μm. Le graphique a montré l'analyse quantitative de la E-cadhérine dans des coupes colorées par immunohistochimie. e L'indice rénal, Scr, BUN et les taux de protéines urinaires sur 24 h dans différents groupes de souris. f Coloration histologique représentative (HE, PAS et coloration trichrome de Masson) des tissus rénaux dans différents groupes de souris. Barre d'échelle=50 μm. g Analyse Western blot des taux de protéines SIK1 et p-SIK (Thr182) chez des souris C57BL/6. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd * P<0.05 vs="" control.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Surexpression de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)AKI-CKD atténuée induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition
Pour spécifier la fonction de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)dans l'IRA-IRC induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition, nous avons injecté AAV9-SikI dans la veine caudale de souris pour surexprimer SIK1(Kinase inductible par le sel 1). Nous avons constaté qu'après avoir été injecté avec AAV9-Sik1, le dysfonctionnement rénal induit par l'AA était significativement amélioré, comme en témoignent les niveaux réduits de l'indice rénal, Scr, BUN et de la protéine urinaire de 24 h (Fig.3a). La PCR en temps réel a révélé qu'AAV9-Sik1(Kinase inductible par le sel 1)réponse inflammatoire induite par les AA soulagée (Fig. 3b). De plus, AAV9-Sik1(Kinase inductible par le sel 1)amélioré de manière significative les dommages histopathologiques induits par l'AA (Fig.3c). De plus, les résultats de la coloration immunohistochimique suggèrent que l'AAV9-Sik1(Kinase inductible par le sel 1)fibrose interstitielle atténuée et EMT dans le processus d'AKI-CKD induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition (Fig.3d). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que SIK1(Kinase inductible par le sel 1)a joué un rôle protecteur dans l'AKI-CKD induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition.
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SIK1(Kinase inductible par le sel 1)était régulée à la baisse dans les cellules HK2 traitées aux AA Un grand nombre d'études ont montré que le tubule proximal du rein est l'une des principales cibles de lésions dans l'IRA(Lésion rénale aiguë), et la lésion du tubule proximal peut jouer un rôle physiopathologique important dans le développement de l'IRA-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition. Pour évaluer plus avant si SIK1(Kinase inductible par le sel 1)était régulée à la baisse in vitro, nous nous sommes concentrés sur les cellules HK2 dans cette étude. En effectuant des dosages CCK8, nous choisissons 10 μmol/L AA comme concentration optimale pour les expériences ultérieures (fichier supplémentaire 2). De manière constante, le traitement aux AA a montré une augmentation de l'inflammation, de l'EMT et de la fibrose dans les cellules HK2 (Fig.4a-c), suggérant une lésion des cellules HK2 induite par les AA in vitro. Par la suite, nous avons examiné les niveaux de protéines de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)et observé une diminution notable de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)et p-SIK1 (Thr182) dans des cellules HK2 en présence d'AA (Fig. 4d). De plus, nous avons détecté l'emplacement de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)protéine dans les cellules HK2 avant et après exposition à l'AA par coloration par immunofluorescence. Dans les cellules non stimulées, SIK1(Kinase inductible par le sel 1)a été observée à la fois dans le noyau et dans le cytoplasme. Lorsqu'il est traité avec AA, l'expression de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)a été réduit et le SIK1(Kinase inductible par le sel 1)a été progressivement détecté dans le noyau (Fichier complémentaire 3). Collectivement, ces résultats ont élucidé que SIK1 était impliqué dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA.
Fig. 3 La surexpression de SIK1 atténue l'AKI-CKD induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition.un. L'indice rénal, Scr, BUN et les niveaux de protéines urinaires sur 24 h dans différents groupes de souris. b Analyse par PCR en temps réel des niveaux d'ARNm de la caspase 1 et de l'IL-1 dans différents groupes de souris. c Les colorations HE, PAS et trichrome de Masson ont été utilisées pour évaluer les modifications histologiques et l'étendue de la fibrose tubulo-interstitielle. Barre d'échelle=50 µm. d Images de coloration immunohistochimique représentatives de la protéine E-cadhérine, -SMA et COLI dans différents groupes de souris. Barre d'échelle=50 µm. Les graphiques ont montré l'analyse quantitative de la E-cadhérine, -SMA et COL1 dans des sections colorées par immunohistochimie. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd *P< 0.05="" vs="" control,="">< 0.05="" vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
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Surexpression de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)amélioration des lésions des cellules HK2 induites par les AA
Pour mieux comprendre le rôle de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA, nous avons construit des lignées cellulaires qui régulaient de manière stable SIK1(Kinase inductible par le sel 1)par infection par des lentivirus de cellules HK2 (fichier supplémentaire 4). La surexpression de SIK1 a entraîné une augmentation significative de la E-cadhérine et réprimé Caspasel / p20 / p10, Vimentin, COLI et Fspl par rapport aux cellules témoins stimulées avec AA seul (Fig. 4e, f). De plus, la surexpression de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)inhibe la capacité de migration des cellules HK2 induite par l'AA (Fig.4g). Ensemble, ces résultats ont démontré que SIK1(Kinase inductible par le sel 1)était protecteur contre les lésions induites par les AA dans les cellules HK2.
Fig.4 SIK1 a été régulé à la baisse dans les cellules HK2 traitées à l'AA et la surexpression de SIK1 a amélioré les lésions des cellules HK2 induites par l'AA.un. Détection par ELISA des taux d'IL{{0}} et de TNF- dans le surnageant de cellules HK2 traitées avec 10 μmol/L d'AA pendant 0 h, 24 h, 48 h, et 72h. b Analyse Western blot des taux de Caspase 1/p20/p10, E-cadhérine, ZO-1, Vimentine et -SMA dans les cellules HK2 traitées avec 10 μmol/L d'AA pendant 0 h, 24 h, 48 h, et 72 h, avec le plus grand effet après 72 h de traitement. -l'actine a été utilisée comme contrôle. c Analyse par PCR en temps réel des niveaux d'ARNm des indicateurs de fibrose précoce (COLI, PAI-1 et MMP9) dans les cellules HK2 traitées avec 10 μmol/L d'AA pendant 72 h. d Analyse Western blot des niveaux de p-SIK1(Thr182) et SIK1 dans les cellules HK2 traitées avec 10 μmol/L d'AA pendant 0 h, 24 h, 48 h et 72 h. e Analyse Western blot de Caspase1/p20/p10, E-cadhérine, Vimentine, Fsp1 et COL1 dans des cellules HK2 traitées avec le vecteur SIK1 (vecteur de surexpression lentivirale SIK1) en présence de 10 µmol/L d'AA ou traitées avec 10 µmol /L AA seul pendant 72 h. f Images d'immunofluorescence représentatives de la E-cadhérine et de la vimentine dans les cellules HK2. Barre d'échelle=50 μm. g Résultats de migration représentatifs des cellules HK2. Barre d'échelle=50 μm. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd * P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
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SIK1(Kinase inductible par le sel 1)voie de signalisation WNT/-caténine régulée in vivo et in vitro
Considérant le rôle critique de la voie WNT/-caténine dans l'IRA-CKD(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)transition, nous avons exploré si SIK1(Kinase inductible par le sel 1)régularise la voie WNT/-caténine. Des expériences in vivo, nous avons observé que la surexpression de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)inhibe les niveaux de protéines de WNT1, de p- -caténine (Y654) et de -caténine nucléaire dans l'AKI-CKD induite par les AA(Insuffisance rénale aiguë en maladie rénale chronique)souris (Fig.5a). Pour explorer davantage si SIK1(Kinase inductible par le sel 1)régulé la voie WNT/-caténine in vitro, nous avons réduit au silence l'expression de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)par shRNA dans les cellules HK2 (fichier supplémentaire 5). Conformément aux résultats in vivo, le silençage de SIK1 a entraîné une augmentation notable des niveaux d'ARNm de -caténine, TCF4 et LEF1 (Fig.5b). D'ailleurs, le renversement de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)augmenté les niveaux de protéines de la -caténine et de la p- -caténine (Y654) (Fig. 5c). De plus, le renversement de SIK1(Kinase inductible par le sel 1)promu la translocation nucléaire de la -caténine (Fig.5d). Collectivement, ces données suggèrent que SIK1(Kinase inductible par le sel 1)régulé la voie WNT/-caténine in vivo et in vitro.
Fig.5 SIK1 régule la voie WNT/-caténine in vivo et in vitro.un. Analyse Western blot des niveaux de protéine SIK1, WNT1, p- -caténine (Y654) et nucléaire -caténine dans différents groupes de souris. b Analyse PCR en temps réel de la -caténine, du TCF4 et du LEF1 dans les cellules HK2 traitées avec le shRNA SIK1 ou le shRNA Scramble. c Analyse Western blot -caténine et p- -caténine (Y654) dans des cellules HK2 traitées avec du shRNA SIK1 ou du shRNA Scramble.d Images représentatives d'immunofluorescence de -caténine dans des cellules HK2. Barre d'échelle=50 euh. Les données sont présentées commemoyenne ± sd*P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Une voie de signalisation WNT/-caténine est impliquée dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA
Pour déterminer si la voie WNT/-caténine jouait un rôle dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA, nous avons testé les niveaux d'expression de WNT1, de la -caténine nucléaire et de la p- -caténine (Y654) après le traitement aux AA. Les résultats du Western blot ont montré que WNT1, la -caténine nucléaire et la p- -caténine (Y654) augmentaient de manière significative après stimulation par AA (fichier supplémentaire 6a). En outre, la coloration par immunofluorescence a révélé la translocation nucléaire de la -caténine (fichier supplémentaire 6b), ce qui suggère que la stimulation de l'AA peut activer la voie de signalisation WNT/-caténine. Considérant que la -caténine est le composant central de la voie WNT/-caténine, nous nous demandons si la régulation de la -caténine régule les lésions des cellules HK2 induites par les AA. Ainsi, nous avons renversé de manière stable la -caténine par le lentivirus shRNA dans les cellules HK2 (fichier supplémentaire 6c). Et nous avons observé que l'inactivation de la -caténine altérait l'expression de Caspasel, IL-1, Vimentin, PAI-1 et MMP9 induite par l'AA et favorisait l'expression de la E-cadhérine (Fig.6a, b). De plus, les cellules shRNA -caténine stimulées avec AA présentaient une migration significativement réduite par rapport aux cellules témoins -caténine stimulées avec AA seul (Fig.6c). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que la voie WNT/-caténine est impliquée dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA.
Fig.6 La voie de signalisation WNT/B-caténine est impliquée dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA.Les cellules HK2 ont été traitées avec du shRNA B-caténine ou du shRNA Scramble en présence de 10 umol/LAA.analyse PCR en temps réel de Caspase1.L-1BE-cadherin.Vimentin, PA/-1.and Niveaux d'ARNm de MMP9 dans les cellules HK2. b Images d'immunofluorescence représentatives de la E-cadhérine et de la vimentine dans les cellules HK2. Barre d'échelle=50 um.c Résultats représentatifs de la migration des cellules HK2. Barre d'échelle=50 euh. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd * P<0.05 vs="" control,=""><0.05 vs="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Une voie de signalisation WNT/-caténine est nécessaire pour SIK1(Kinase inductible par le sel 1)lésion médiée des cellules HK2 induite par AA
Pour étudier si SIK1(Kinase inductible par le sel 1)les lésions des cellules HK2 induites par les AA régulées par la voie de signalisation WNT / -caténine, la -caténine a encore diminué dans SIK1(Kinase inductible par le sel 1)cellules HK2 renversées. Par rapport aux cellules inactivées SIK1, une inactivation supplémentaire de la -caténine a diminué les niveaux d'ARNm de Caspasel, COLl et Vimentin, tout en augmentant les niveaux d'ARNm de la E-cadhérine (Fig. 7a). Les résultats du West-ern blot étaient cohérents avec la PCR en temps réel, montrant que le silence de la -caténine et SIK1 a inversé la régulation à la baisse de la E-cadhérine, la régulation à la hausse de Caspasel/p20/p10 et de la vimentine induite par SIK1(Kinase inductible par le sel 1)renversement (Fig. 7b).
Collectivement, ces résultats ont indiqué que l'inhibition de la -caténine a inversé la réponse inflammatoire, l'EMT et la progression de la fibrose médiée par SIK1(Kinase inductible par le sel 1)knockdown, qui révèle fortement que la voie WNT / -caténine était nécessaire pour SIK1(Kinase inductible par le sel 1)lésion médiée des cellules HK2 induite par les AA.
Fig.7 La voie WNT/-caténine est nécessaire pour la lésion des cellules HK2 médiée par SIK1 induite par l'AA.Les cellules HK-2 ont été co-transfectées avec le shRNA SIK1 et B-caténine ou transfectées avec le shRNA SIK1 ou -caténine seul, puis traitées avec 10 umol/L d'AA pour une analyse PCR en temps réel de 72 ha de Caspase1, COL1. Expression de la E-cadhérine et de la vimentine. b. Analyse Western blot de l'expression de Caspase1/p20/p10, E-cadhérine et Vimentine. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd * P<0.05 vs=""><0.05 vs="" sik1="" shrna,=""><0.05vs β-catenin="" shrna.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">
Le rôle de Twist1 dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA
Agissant en tant qu'EMT-TF, Twistl peut favoriser l'EMT et la fibrose rénale. Dans cette étude, nous avons trouvé que l'AA favorisait l'expression des protéines et de l'ARNm de Snail et Twist1 tandis que la caténine knockdown inhibait l'expression de Snail et Twist1 induite par AA (Fig.8a), indiquant que Snail et Twist1 étaient situés en aval de la -caténine et jouaient un rôle dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA. Pour vérifier notre hypothèse, nous avons renversé Twist1 par siRNA (fichier supplémentaire 7) et effectué une PCR en temps réel et une analyse Western blot. Comme prévu, par rapport aux cellules témoins stimulées avec AA seul, l'expression de la vimentine et de COLI a été réduite tandis que ZO -1 a été augmenté dans les cellules siARN Twist1 en présence d'AA, suggérant que le silence de Twist1 atténuait l'apparition d'EMT et la progression de la fibrose rénale induite par l'AA (Fig. 8b et c).
Fig.8 Le rôle de Twist dans les lésions des cellules HK2 induites par les AA.une analyse Western blot et PCR en temps réel des niveaux de Snail et Twist1 dans les cellules HK2. b Analyse par PCR en temps réel des niveaux de Twist1, COL1, ZO-1 et Vimentin dans les cellules HK2 traitées avec l'ARNsi Twist1 ou l'ARNsi NC.c. Analyse par Western blot des niveaux de Twist1, ZO-1 et de vimentine dans les cellules HK2 traitées avec l'ARNsi Twist1 ou l'ARNsi NC. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sd * P<0.05 ys="" control.=""><0.05 ys="" aa.="" all="" experiments="" were="" performed="" in="">