Identification de la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles en tant que nouveau biomarqueur urinaire précoce pour les lésions rénales ischémiques

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JAYA MISHRA,* QING MA,* ANNE PRADA,* MARK MITSNEFES,* KAMYAR ZAHEDI,* JUN YANG,† JONATHAN BARASCH,†, et PRASAD DEVARAJAN*

* Néphrologie et hypertension, centre médical de l'hôpital pour enfants de Cincinnati, Cincinnati, Ohio ; et † Néphrologie, Collège des médecins et chirurgiens, Université de Columbia, New York, New York

Résumé.

Aigurénall'échec (ARF) secondaire à une lésion ischémique reste un problème courant et potentiellement dévastateur. Une stratégie d'interrogation à l'échelle du transcriptome a été utilisée pour identifier les gènes rénaux induits très tôt après l'ischémie rénale, dont les produits protéiques pourraient servir de nouveaux biomarqueurs pour l'ARF. Sept gènes régulés à la hausse plus - 10- fois ont été identifiés, dont l'un (Cyr61) a récemment été signalé comme étant induit après une ischémie rénale. De manière inattendue, l'induction des six autres transcrits était nouvelle dans le domaine de l'ARF. Dans cette étude, l'un de ces gènes précédemment non reconnus a été davantage caractérisé, à savoir la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles (NGAL), car il s'agit d'un petit polypeptide sécrété résistant aux protéases et par conséquent facilement détecté dans l'urine. La régulation positive marquée des niveaux d'ARNm et de protéines de NGAL chez la souris post-ischémique précoceun reina été confirmé. L'expression de la protéine NGAL a été détectée principalement dans les cellules proliférantes des cellules tubulaires proximales positives à l'antigène nucléaire, dans une distribution cytoplasmique ponctuée co-localisée avec des marqueurs d'endosomes tardifs. La NGAL a été facilement détectée dans l'urine lors de la toute première production d'urine après l'ischémie dans les modèles de souris et de rat d'ARF. L'apparition de NGAL dans les urines était liée à la dose et à la durée derénalischémie et précédé l'apparition d'autres marqueurs urinaires tels que la N-acétyl- -D-glucosaminidase et la 2-microglobuline. L'origine de NGAL à partir de cellules tubulaires a été confirmée dans des cellules tubulaires proximales humaines en culture soumises à une lésion ischémique in vitro, où l'ARNm de NGAL a été rapidement induit dans les cellules et la protéine NGAL était facilement détectable dans le milieu de culture en 1 h d'épuisement léger de l'ATP. La NGAL était également facilement détectable dans l'urine de souris présentant une néphrotoxicité induite par le cisplatine, précédant à nouveau l'apparition de la N-acétyl- -D-glucosaminidase et de la 2-microglobuline. Les résultats indiquent que la NGAL pourrait représenter un biomarqueur urinaire précoce, sensible et non invasif pour les maladies ischémiques et néphrotoxiques.rénalblessure.

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Aigurénaléchec(ARF) secondaire à une lésion ischémique ou néphrotoxique reste un problème courant et potentiellement dévastateur en néphrologie clinique, avec un taux de mortalité constamment élevé malgré des progrès significatifs dans les soins de support (1–4). Des études pionnières sur plusieurs décennies ont mis en lumière les rôles de la vasoconstriction persistante, de l'obstruction tubulaire, des altérations structurelles et métaboliques cellulaires et de la réponse inflammatoire dans la pathogenèse de l'ARF (4–7). Bien que ces études aient ouvert la voie à des approches thérapeutiques réussies dans des modèles animaux, les efforts de recherche translationnelle chez l'homme ont donné des résultats décevants (2–4). Les raisons en sont peut-être la réponse multiforme du rein à l'ischémie et aux néphrotoxines et la rareté des marqueurs précoces de l'IRA avec un retard résultant dans l'initiation du traitement (4–8).

Les tentatives de démêler la base moléculaire de ces myriades précocesrénalles réponses ont été facilitées par les progrès récents de la génomique fonctionnelle qui ont produit de nouveaux outils pour l'analyse à l'échelle du génome de processus biologiques complexes tels que l'ARF ischémique (8-11). Les méthodes de puces à ADNc fournissent des profils d'expression parallèles et quantitatifs de milliers de gènes qui, combinés à des outils bioinformatiques, peuvent identifier des gènes dans une voie biologique, caractériser la fonction de nouveaux gènes et détecter des sous-classes de maladies (9). En utilisant cette technique de criblage, nous avons identifié un sous-ensemble de sept gènes dont l'expression est régulée à la hausse 0- fois dans les premières heures après l'ischémierénalblessuredans un modèle de souris. L'un de ces transcrits, la protéine 61 riche en cystéine (Cyr61), a été très récemment confirmé comme étant induit par une ischémie rénale (8), mais le comportement des six autres gènes exprimés de manière différentielle est nouveau dans la littérature ARF. Dans cette étude, nous avons choisi de caractériser davantage l'un de ces gènes jusque-là non reconnus, à savoir la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles (NGAL), car il s'agit d'un petit polypeptide sécrété qui peut être détectable dans l'urine, notamment parce qu'il est résistant aux protéases. Nos résultats indiquent que NGAL peut représenter un nouveau biomarqueur urinaire précoce pour ischémique et néphrotoxiquerénalblessure.

Matériaux et méthodes

Modèles murins d'ischémie-reperfusion rénale

Nous avons utilisé des modèles murins bien établis dans lesquels les conséquences structurelles et fonctionnelles de brèves périodes derénalischémie ont déjà été documentées (11-15). En bref, des souris mâles Swiss-Webster (Taconic Farms, Germantown, NY) pesant de 25 à 35 g ont été hébergées avec 12 :12-h lumière : cycle d'obscurité et ont eu libre accès à la nourriture et à l'eau. Les animaux ont été anesthésiés avec du pentobarbital sodique (50 mg/kg par voie intrapéritonéale) et placés sur une table chauffante pour maintenir une température rectale de 37 degrés. Trois protocoles distincts ont été utilisés : (1) ischémie unilatérale sans ARF, (2) ischémie bilatérale avec ARF et (3) ischémie subclinique légère bilatérale. Pour les expériences d'ischémie unilatérale, le pédicule rénal gauche a été occlus avec une pince vasculaire non traumatique pendant 45 min, période pendant laquelle le rein a été maintenu au chaud et humide. La pince a ensuite été retirée, le rein a été observé pour le retour du flux sanguin et l'incision a été suturée. Les souris ont été autorisées à récupérer dans une cage chauffée et des collectes d'urine chronométrées ont été obtenues. Après 0, 3, 12 ou 24 h de reperfusion, les animaux ont été ré-anesthésiés, la cavité abdominale a été ouverte et le sang a été obtenu par ponction de la veine cave inférieure pour la mesure de la créatinine sérique par un kit de dosage colorimétrique quantitatif (Sigma, Saint-Louis, MO). Les souris ont été tuées, les reins ont été fixés par perfusion in situ avec du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS, et les deux reins ont été récoltés (le rein droit a servi de témoin pour chaque animal). Au moins trois animaux séparés ont été examinés à chacune des périodes de refusion. La moitié de chaque rein a été congelée rapidement dans de l'azote liquide et stockée à 70 degrés jusqu'à ce qu'elle soit traitée ultérieurement ; un échantillon a été fixé dans du formol, inclus en paraffine et sectionné (4 m). Les coupes de paraffine ont été colorées avec de l'hématoxyline-éosine et examinées histologiquement. Les reins clampés présentaient les changements morphologiques caractéristiques résultant d'une lésion d'ischémie-reperfusion, comme précédemment publié par d'autres (12-14) et par nous (11). L'autre moitié de chaque rein a été incluse dans le composé OCT (Tissue-Tek) et des coupes congelées (4 m) ont été obtenues pour l'immunohistochimie. Pour l'ischémie bilatérale avec des expériences ARF, les deux reins ont été clampés pendant 30 min et examinés à diverses périodes de refusion comme détaillé ci-dessus. Ce groupe de huit animaux a été conçu pour représenter l'ARF clinique et a affiché une élévation significative de la créatinine sérique 24 h après la blessure. Pour les expériences d'ischémie subclinique légère bilatérale, les deux reins ont été clampés pendant 5, 10 ou 20 min seulement et examinés à diverses périodes de reperfusion comme ci-dessus. Ce léger degré de blessure a été conçu pour simuler une ischémie rénale subclinique, et les souris de ce groupe n'ont présenté aucune élévation de la créatinine sérique mesurée 24 h après la blessure.

Modèle de rat de lésion rénale d'ischémie-reperfusion

Nous avons utilisé des modèles de rongeurs bien établis derénallésion d'ischémie-reperfusion (10). Brièvement, des rats mâles Sprague-Dawley pesant 200 à 250 g (Taconic Farms) ont été anesthésiés avec de la kétamine (150 g/g) et de la xylazine (3 g/g) et soumis à une occlusion bilatérale de l'artère rénale avec des pinces microvasculaires pendant 30 min comme détaillé dans le protocole souris. Des collectes d'urine chronométrées ont été obtenues à 3, 6, 9, 12 et 24 h de reperfusion, et du sang a été prélevé pour la mesure de la créatinine au moment de la mise à mort (24 h).

Modèle de souris de lésion rénale induite par le cisplatine

Nous avons utilisé des modèles murins bien établis dans lesquels les conséquences structurelles et fonctionnelles de l'administration de cisplatine ont déjà été documentées (16-18). En bref, les souris ont reçu une seule injection intrapéritonéale de cisplatine (20 mg/kg de poids corporel). Cela entraîne une nécrose et une apoptose des cellules tubulaires et une élévation de l'urée sanguine dans les 3 jours suivant l'injection de cisplatine (16–18). Les animaux ont été logés dans des cages métaboliques et des prélèvements d'urine ont été effectués quotidiennement.

Isolement d'ARN

Des tissus rénaux entiers de souris (ou des cellules de tubules proximaux humains en culture ; voir ci-dessous) ont été rompus avec une terreur tissulaire (Biospec Products, Racine, WI). L'ARN total des reins témoins et ischémiques a été isolé à l'aide du kit RNeasy Mini (Qiagen, Valencia, CA) et quantifié par spectrophotométrie.

Procédures de puce à ADN

Des descriptions détaillées du matériel et des procédures des puces à ADN ont été publiées précédemment (11). En bref, pour chaque expérience, 100 g d'ARN total purifié de rein de souris ont été soumis à une transcription inverse avec la transcriptase inverse Superscript II (Life Technologies, Rockville, MD) en présence de Cy3-dUTP (Amersham, Piscataway, NJ) pour les contrôles et Cy5-dUTP pour les échantillons ischémiques. Les échantillons d'ADNc ont été purifiés à l'aide d'un filtre Microcon YM -50 (Millipore, Madison, WI) et hybrides sur des lames de microréseau contenant 8979 sondes de souris à séquence unique vérifiées (11). Trois animaux distincts ont été examinés pour chacune des périodes de refusion, et au moins deux expériences de microréseau indépendantes ont été réalisées pour chacun des animaux. Les lames de matrice ont été numérisées à l'aide d'un scanner de puces à ADN (GenePix 4000B; Axon Instruments, Foster City, CA) pour obtenir des images TIFF séparées pour la fluorescence Cy3 et Cy5. Les intensités de signal pour Cy3 et Cy5 ont été déterminées pour des gènes individuels à l'aide du logiciel d'extraction de données GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments). Le contrôle de la qualité et l'analyse des données ont été effectués comme décrit précédemment (11).

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Transcription inverse semi-quantitative–PCR

Une quantité égale (1 plus - g) d'ARN total provenant de reins de souris témoins et expérimentales a été rétrotranscrite avec la transcriptase inverse Superscript II (Life Technologies) en présence d'hexamères aléatoires conformément aux instructions du fabricant. La PCR a été réalisée à l'aide d'un kit (Roche, Indianapolis, IN) et des amorces suivantes : souris NGAL sens 5'-CACCACGGACTACAACCAGT TCGC-3', souris NGAL antisens 5'-TCAGTTGTTCAATGCATTG GTCGGTG-3', NGAL humaine sens 5'-TCAGCCGTCGATACACT GGTC-3', et NGAL antisens humain 5'-CCTCGTCCGAGTGG TGAGCAC-3'. Des paires d'amorces pour la souris et l'actine humaine et la glycéraldéhyde -3- phosphate déshydrogénase (GAPDH) ont été obtenues auprès de Clontech (La Jolla, CA). Des réactions fictives dépourvues d'ADNc ont servi de témoins négatifs. Les produits de PCR ont été analysés par électrophorèse sur gel d'agarose suivie d'une coloration au bromure d'éthidium et ont été quantifiés par densitométrie. Les changements de pli dans l'expression de l'ARNm de NGAL dans les reins ischémiques par rapport aux reins témoins ont été exprimés après normalisation pour l'amplification de l'actine ou de la GAPDH.

Microscopie

Pour la détection de NGAL, les coupes congelées ont été perméabilisées avec {{0}}.2 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 10 min, bloquées avec du sérum de chèvre pendant 1 h et incubées avec un anticorps primaire anti-NGAL ( dilution 1:500) pendant 1h. Les lames ont ensuite été exposées pendant 30 min dans l'obscurité à des anticorps secondaires conjugués à Cy5 (Amersham, Arlington Heights, IL) et visualisées avec un microscope à fluorescence (Zeiss Axiophot) équipé de filtres à rhodamine. Pour la co-localisation de NGAL avec Rab11, des coupes en série ont d'abord été incubées avec un anticorps NGAL ou un anticorps monoclonal contre Rab11 (dilution 1:500 ; Transduction Laboratories), puis avec des anticorps secondaires conjugués avec Cy5 (pour NGAL) ou Cy3 (pour Rab11 ) et visualisé avec des filtres de rhodamine ou de fluorescéine, respectivement. Pour la co-localisation de la NGAL avec l'antigène nucléaire des cellules proliférantes (PCNA), les coupes ont été co-incubées avec l'anticorps NGAL et un anticorps monoclonal anti-PCNA (dilution 1:500 ; Upstate), et la détection a été réalisée par coloration à l'immunoperoxydase (ImmunoCruz Staining System, biotechnologie de Santa Cruz). Pour le test TUNEL, nous avons utilisé le kit de test de fragmentation d'ADN ApoAlert (Clontech). Les sections de paraffine ont été déparaffinées à travers du xylène et des qualités décroissantes d'éthanol, fixées avec 4 % de formaldéhyde/PBS pendant 30 min à 4 degrés, perméabilisées avec de la protéinase K à température ambiante pendant 15 min et 0,2 % de Triton X-100/PBS pendant 15 min. min à 4 degrés, et incubé avec un mélange de nucléotides et d'enzyme TdT pendant 60 min à 37 degrés. La réaction a été terminée avec 2 SSC et les coupes ont été lavées avec du PBS et montées avec Crystal/mount (Biomed, Foster City, CA). Les noyaux apoptotiques TUNEL-positifs ont été détectés par visualisation au microscope à fluorescence.

Collecte d'urine

Des souris ou des rats ont été placés dans des cages métaboliques (Nalgene, Rochester, NY), et l'urine a été recueillie avant et toutes les heures aprèsrénalocclusion artérielle. Les échantillons d'urine ont été centrifugés à 5000 g pour éliminer les débris, et le surnageant a été analysé par Western blot. La créatinine urinaire a été mesurée par un kit de dosage colorimétrique quantitatif (Sigma) pour normaliser les échantillons pour la détermination de la NGAL urinaire. Un kit de dosage colorimétrique pour la détermination de la N-acétyl-D-glucosaminidase (NAG) dans l'urine a été obtenu auprès de Roche.

Culture de cellules

Humainrénalles cellules épithéliales tubulaires proximales (RPTEC) ont été obtenues auprès de Clonetics (San Diego, CA). Les cellules ont été cultivées dansrénalmilieu basal de cellules épithéliales additionné deRénalComplexe de milieu de croissance de cellules épithéliales (REGM) ({{0}}.5 l/ml d'hydrocortisone, 10 pg/ml de hEGF, 0,5 - g/ml d'épinéphrine, 6,5 pg/ml de triiodothyronine, 10 plus - g/ml de transferrine, 5 - g/ml d'insuline, 1 - g/ml de sulfate de gentamicine et 2 % de FBS), comme recommandé par le fabricant.

Déplétion légère en ATP des cellules cultivées

Nous avons modifié les protocoles précédemment décrits d'ischémie in vitro par déplétion d'ATP avec des inhibiteurs de la phosphorylation oxydative (19,20). Le deuxième jour après la confluence, les cellules RPTEC ont été incubées avec 1 m d'antimycine A (Sigma) pendant des périodes variables allant jusqu'à 6 h. Nous avons déjà montré que cela se traduit par une légère déplétion partielle réversible de l'ATP et aucune perte de viabilité cellulaire dans d'autres types de cellules épithéliales rénales cultivées telles que les cellules MDCK (19) et 786- O (20). Les niveaux d'ATP ont été surveillés à l'aide d'un kit de dosage à base de luciférase (Sigma) et exprimés en pourcentage des valeurs témoins. Les cellules ont été récoltées à différents moments de l'épuisement de l'ATP et analysées pour l'expression de l'ARNm de la NGAL par transcription inverse-PCR (RT-PCR) et l'expression de la protéine NGAL par analyse Western. La sécrétion de NGAL dans le milieu de culture a également été surveillée.

Autres matériaux et méthodes

Tous les produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma, sauf indication contraire. Pour le transfert Western, les concentrations de protéines ont été déterminées par le test de Bradford (Bio-Rad, Hercules, CA) et des quantités égales de protéines totales ont été chargées dans chaque voie. Un anticorps monoclonal anti-- -tubuline (Sigma) a été utilisé à 1 : 10,000 dilution pour confirmer une charge protéique égale, et un anticorps polyclonal anti-NGAL a été utilisé à 1 : 500 (21). L'anticorps monoclonal anti-2-microglobuline a été utilisé à 1:500 (Sigma). L'immunodétection des protéines transférées a été réalisée en utilisant la chimiluminescence améliorée (Amersham).

Résultats

Caractérisation des modèles animaux de lésions d'ischémie-reperfusion rénale précoce

Nous avons utilisé des modèles murins dans lesquels les conséquences structurelles et fonctionnelles de brèves périodes d'ischémie rénale ont été documentées (11–15). Les caractéristiques histopathologiques caractéristiques de la lésion ischémique étaient facilement évidentes dans les échantillons de reperfusion 24- h après une ischémie unilatérale (45 min) et bilatérale (30 min). Ceux-ci comprenaient une perte de membranes de bordure en brosse, une dilatation tubulaire, un épithélium tubulaire aplati, des débris luminaux et des infiltrats interstitiels (Figure 1). Nous avons documenté la présence de cellules apoptotiques en utilisant le test TUNEL. L'apoptose était principalement localisée dans les cellules tubulaires distales et la branche ascendante de l'anse de Henle, à la fois dans les cellules détachées de la lumière et dans les cellules attachées. Des cellules tubulaires proximales occasionnelles étaient également apoptotiques, mais les glomérules étaient essentiellement dépourvus d'apoptose. Aucune cellule TUNEL-positive n'a été détectée dans les reins témoins ou dans les échantillons ischémiques où TdT a été omis (non représenté). Les changements histologiques et apoptotiques ci-dessus étaient absents des reins soumis à des degrés d'ischémie plus légers (5, 10 ou 20 min d'ischémie bilatérale ; non illustré). Les niveaux de créatinine sérique reflétaient les changements histopathologiques observés. Ainsi, les souris présentant une ischémie rénale unilatérale ou des degrés légers d'ischémie bilatérale subclinique affichaient des taux de créatinine sérique impossibles à distinguer des animaux témoins, tandis que les souris présentant une ischémie bilatérale pendant 30 min présentaient une élévation significative de la créatinine sérique (Figure 1).

Figure 1. Caractérisation du modèle murin d'ischémierénalblessure. Les panneaux de gauche montrent les résultats de la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (en haut) et à la coloration TUNEL (en bas) de coupes de rein de souris témoins ou après 24 h d'ischémie-reperfusion (IRI). (À droite) Résultats des déterminations de la créatinine sérique chez les souris témoins (Con), après une ischémie unilatérale pendant 45 min (U45) ou après une ischémie bilatérale pendant diverses périodes, comme indiqué. *P 0.05 versus contrôle. Les nombres dans les barres indiquent un nombre d'animaux.

L'ARNm de la NGAL est nettement induit dans le rein post-ischémique précoce

Par analyse de puces à ADN de souris avec unilatéralerénalischémie, NGAL s'est avéré être systématiquement induit (3,2 plus - 0.5- fois, 11,1 plus - 1.2- fois et 4,3 plus {{1{{30} }}}.6- fois à 3, 12 et 24 h de reperfusion) dans le rein de souris ischémique par rapport aux reins témoins du même animal (moyenne plus - ET de trois animaux à chaque instant). Cette découverte a été confirmée par RT-PCR semi-quantitative, en utilisant un protocole de normalisation avec à la fois plus -actine et GAPDH. Aucun changement significatif dans l'expression de l'ARNm de la plus-actine ou de la GAPDH n'a été noté à l'une quelconque des périodes de reperfusion examinées, comme décrit précédemment (11). Cependant, en utilisant des amorces spécifiques à la souris, nous avons détecté une régulation à la hausse significative de l'expression de l'ARNm de la NGAL (4,1 plus -0.5- fois, 9 plus -0.6- fois et 4,2 plus 0.4- fois à 3, 12 et 24 h de reperfusion, respectivement, où les valeurs représentent la moyenne plus - SD de trois animaux distincts). Ces résultats sont illustrés sur la figure 2 et sont globalement en accord avec les changements détectés par l'analyse du transcriptome.

Figure 2. Induction de l'ARNm de la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles rénaux de souris (NGAL) après ischémie. (Haut) Transcription inverse représentative-PCR (RT-PCR) avec des amorces pour l'actine de souris et la NGAL, en utilisant de l'ARN extrait des reins de souris témoins (C) ou après diverses périodes de reperfusion comme indiqué (heures). La voie M contient une échelle d'ADN de 100-bp. (En bas) Pliez l'augmentation de l'expression de l'ARNm de la NGAL à divers moments à partir du contrôle (CON). Les valeurs obtenues par puce à ADN (ligne continue) par rapport à la RT-PCR (ligne pointillée) sont des moyennes SD de trois expériences à chaque instant.

La protéine NGAL est nettement surexprimée dans les tubules proximaux des reins de souris ischémiques précoces

Il était ensuite intéressant de déterminer si l'expression post-ischémique de la protéine NGAL dans le rein est parallèle à celle de l'ARNm. Selon l'analyse Western, la NGAL était juste détectable en tant que peptide immunoréactif 25-kD dans les reins de souris témoins. L'identité de cette bande en tant que NGAL a été établie dans un ensemble séparé d'expériences, où la préincubation de l'anticorps primaire avec de la lipocaline de souris recombinante a complètement bloqué cette immunoréactivité (non représentée). Dans les expériences d'ischémie unilatérale, l'expression de NGAL a été induite de trois à quatre fois par densitométrie dans le rein ischémique de cinq animaux distincts dans les 3 h suivant la blessure, comme le montre la figure 3. Cette réponse a été considérablement améliorée dans les expériences d'ischémie bilatérale de huit animaux distincts. . La NGAL chez ces souris a été induite par trois après 3 h de reperfusion, a culminé à 12- fois dans les échantillons 24- h et a diminué à des niveaux normaux au cours de la période de récupération 72- h (Figure 3) .

Figure 3. Induction de la protéine NGAL du rein de souris après ischémie unilatérale ou bilatérale. (Haut) Western blots représentatifs avec des échantillons de rein entier obtenus à partir de souris témoins (Con) ou après des périodes de reperfusion comme indiqué (heures), sondés avec un anticorps polyclonal contre NGAL ou un anticorps monoclonal contre la tubuline (pour démontrer une charge protéique égale). Les marqueurs de poids moléculaire sont à gauche. (En bas) Pliez l'augmentation de l'expression de la protéine NGAL à divers moments à partir du contrôle (CON). Les valeurs obtenues par densitométrie sont des moyennes SD de cinq animaux pour l'ischémie unilatérale et de huit animaux pour l'ischémie bilatérale

À l'aide de techniques immunohistochimiques, nous avons ensuite démontré que la protéine NGAL était à peine détectable dans les reins de souris témoins, mais qu'elle est régulée positivement principalement dans les tubules proximaux dans les 3 h suivant l'ischémie, comme illustré à la figure 4. L'identification des tubules proximaux dans ces sections était basée sur la présence d'une brosse membrane frontalière, le rapport entre la taille du noyau et la taille des cellules et la morphologie cellulaire. La NGAL induite est apparue dans une distribution cytoplasmique ponctuée dans les cellules du tubule proximal, rappelant une protéine sécrétée. Ce schéma d'expression était identique dans les modèles unilatéraux et bilatéraux de lésion d'ischémie-reperfusion et était constamment évident chez tous les animaux étudiés. Les glomérules étaient dépourvus d'expression de NGAL et aucun neutrophile exprimant NGAL n'était évident. Parce qu'il a été démontré que NGAL dans des cellules rénales de tumeur de Wilms cultivées co-localise au moins en partie avec des endosomes (21), nous avons examiné dans des coupes en série la distribution de NGAL et de Rab11 (un marqueur de recyclage tardif des endosomes). Les images fusionnées ont montré une co-localisation significative de NGAL avec Rab11 (Figure 4). Pour explorer la signification fonctionnelle de l'expression accrue de NGAL après une ischémie, nous avons examiné des sections de rein en série pour l'expression de NGAL, des noyaux TUNEL-positifs ou des noyaux PCNA-positifs. Alors que les cellules tubulaires surexprimant NGAL n'étaient pas TUNEL-positives (non illustrées), une co-localisation significative de NGAL et de PCNA était évidente dans les cellules proliférantes et régénérantes à la période de refusion 48-h (Figure 4).

Figure 4. Induction de la protéine NGAL de rein de souris après ischémie. (Haut) Résultats d'immunohistochimie représentatifs sur des coupes congelées de reins de souris obtenus à partir de souris témoins ou après différentes périodes de refusion comme indiqué (heures), sondés avec un anticorps polyclonal anti-NGAL. G, glomérule. Le panneau étiqueté HP est un grossissement de 100 plus à haute puissance, et les autres panneaux sont à 20. (En bas) Les deux panneaux de gauche montrent un tubule après 3 h de reperfusion, exprimant NGAL (rouge) ou Rab11 (vert). Le troisième panneau montre une image fusionnée, indiquant la co-localisation en jaune. Le panneau à l'extrême droite montre la co-localisation de NGAL avec l'antigène nucléaire cellulaire proliférant dans les tubules après 48 h de refusion.

La protéine NGAL est facilement détectée dans l'urine immédiatement après l'induction de l'ARF chez la souris

Il était ensuite d'un intérêt considérable de déterminer si l'expression post-ischémique de la protéine NGAL pouvait être détectée dans l'urine, suggérant ainsi son utilité en tant que biomarqueur non invasif précoce de l'ischémie.rénalblessure. Avec l'utilisation des concentrations de créatinine urinaire pour égaliser le chargement de l'échantillon, la NGAL était absente de l'urine avant l'ischémie. À l'opposé, la NGAL s'est manifestée sous la forme d'une bande 25-kD dans les 2 h suivant la blessure (dans la toute première production d'urine après l'ischémie) chez tous les animaux examinés (cinq avec une ischémie unilatérale et huit avec une ischémie bilatérale), comme le montre Figure 5. L'identité de cette bande en tant que NGAL a été établie dans un ensemble séparé d'expériences, dans lesquelles la préincubation de l'anticorps primaire avec de la lipocaline de souris recombinante a complètement bloqué cette immunoréactivité (non illustré). Remarquablement, la NGAL était facilement détectable dans aussi peu que 1 litre d'urine non traitée par analyse Western et a persisté pendant toute la durée examinée (24 h de reperfusion). Nous avons ensuite comparé l'excrétion urinaire de NGAL avec celle de marqueurs de blessure précédemment établis, tels que la 2-microglobuline et la NAG. Alors que la NGAL urinaire était évidente dans les 2 h suivant l'ischémie, la 2- microglobuline n'était détectable dans les mêmes échantillons urinaires qu'après 12 h d'ischémie unilatérale et 8 h d'ischémie bilatérale (Figure 5). De même, l'excrétion urinaire de NAG n'a augmenté de manière significative qu'après 12 h d'ischémie unilatérale et 8 h d'ischémie bilatérale par rapport aux animaux témoins non ischémiques (Figure 5).

Figure 5. Détection précoce de la protéine NGAL dans l'urine chez les souris atteintes d'ischémie aiguërénaldéfaillance (ARF). (Haut) Western blots représentatifs d'échantillons d'urine non traités (1 à 2 plus - l par voie, normalisés pour la teneur en créatinine) ont été obtenus à des périodes de reperfusion comme indiqué (heures), après unilatéral ou bilatéralrénalclampage artériel. Les marqueurs de poids moléculaire sont affichés à gauche. Les transferts ont été sondés avec du NGAL (en haut) ou de la {{0}}microglobuline (Beta2-M ; au milieu). (En bas) Déterminations de la N-acétyl--D-glucosaminidase (NAG) urinaire à diverses périodes de reperfusion comme indiqué, à partir de cinq animaux pour une ischémie unilatérale et de huit animaux pour une ischémie bilatérale. Les valeurs sont moyennes SD. *P 0,05 par rapport au contrôle à chaque instant, ANOVA.

La protéine NGAL est facilement détectée dans l'urine même après une ischémie rénale légère chez la souris

Pour déterminer la sensibilité de la détection urinaire de NGAL en l'absence d'ARF manifeste, nous avons utilisé des protocoles dans lesquels des ensembles séparés de souris ont été soumis à seulement 5, 10 ou 20 min derénalocclusion artérielle. Ces études ont été conçues pour évaluer l'excrétion urinaire de NGAL après une ischémie rénale subclinique légère. La créatinine sérique mesurée après 24 h de refusion était dans les limites normales chez toutes ces souris (Figure 1). Frappant, NGAL a été facilement détecté dans aussi peu que 1 litre d'urine non traitée chez ces animaux (Figure 6), bien que son apparition ait été quelque peu retardée par rapport aux animaux atteints d'IRA manifeste. Ainsi, alors que 30 min d'ischémie bilatérale ont entraîné une excrétion urinaire de NGAL en 2 h (Figure 5), les souris avec 20 ou 10 min d'ischémie bilatérale ont manifesté une NGAL urinaire après 4 h et celles avec 5 min d'ischémie n'ont excrété de NGAL qu'après 6 h ( Figure 6). Ainsi, l'apparition de NGAL dans les urines est corrélée à la dose et à la durée de l'ischémie rénale.

La protéine NGAL est facilement détectée dans l'urine immédiatement après l'induction de l'ARF chez le rat

Figure 6. Détection de la protéine NGAL dans l'urine chez des souris présentant une ischémie rénale subclinique. Western blot représentatif d'échantillons d'urine non traités (1 à 2 l par voie, normalisés pour la teneur en créatinine) obtenus à des périodes de reperfusion comme indiqué (heures), après 5, 10 ou 20 min de serrage bilatéral de l'artère rénale. Les marqueurs de poids moléculaire sont affichés à gauche. Ces animaux présentaient une créatinine sérique normale à 24 h de refusion.

Parce qu'un débat existe concernant les différences d'espèces dans les réponses à l'occlusion de l'artère rénale (22), nous avons ensuite examiné le comportement de NGAL dans un modèle animal différent, à savoir un modèle de rat bien établi de lésion rénale d'ischémie-reperfusion. Avec l'utilisation des concentrations de créatinine urinaire pour égaliser le chargement de l'échantillon, la NGAL était absente de l'urine avant l'ischémie. À l'opposé, la NGAL s'est manifestée sous la forme d'un 25-peptide immunoréactif kD dans les 3 h suivant la blessure (dans la toute première production d'urine après l'ischémie), comme le montre la figure 7. En comparaison, la créatinine sérique dans ce modèle de la lésion ischémique n'était élevée qu'après 24 h de reperfusion (non illustré). Une fois de plus, la NGAL était détectable dans 1 l d'urine non traitée et persistait pendant toute la durée examinée (24 h de reperfusion).

Figure 7. Détection précoce de la protéine NGAL dans l'urine chez des rats atteints d'ARF ischémique. Western blot représentatif d'échantillons d'urine non traités (1 à 2 l par voie, normalisés pour la teneur en créatinine) obtenus à des périodes de reperfusion comme indiqué (heures), après 30 min de serrage bilatéral de l'artère rénale chez le rat. Les marqueurs de poids moléculaire sont affichés à gauche. Ces animaux présentaient une augmentation significative de la créatinine sérique à 24 h de refusion.

L'ARNm de la NGAL est induit dans des cellules tubulaires proximales humaines en culture après une ischémie légère précoce

Pour confirmer l'origine de NGAL à partir de cellules ischémiques du tubule proximal, nous avons modifié les protocoles précédemment décrits d'ischémie in vitro par déplétion d'ATP dans des cellules de tubule proximales humaines en culture (RPTEC). L'incubation de 1- m d'antimycine a entraîné une légère déplétion partielle de l'ATP à environ 83 plus 3 % du contrôle en 1 h, avec une diminution plus progressive à environ 75 plus - 3 % du contrôle en 6 h ( moyenne-SD de quatre expériences). Aucune conséquence morphologique de cette déplétion légère en ATP n'a été perceptible. L'ARNm de la NGAL était juste détectable dans les cellules au repos. Cependant, après un épuisement partiel de l'ATP, une induction rapide et dépendante de la durée de l'ARNm de la NGAL était évidente par RT-PCR, comme le montre la figure 8.

La protéine NGAL est facilement détectée dans le milieu après une ischémie précoce in vitro

Nous avons ensuite examiné l'expression de la protéine NGAL dans les cellules RPTEC et le milieu de culture après un léger appauvrissement en ATP. La protéine NGAL était détectable dans les cellules RPTEC témoins et son expression augmentait après l'épuisement de l'ATP de manière dépendante de la durée, comme le montre la figure 8. Aucune protéine immunoréactive NGAL n'a été trouvée dans le milieu de culture des cellules témoins, mais la NGAL était facilement détectable en 1 h d'épuisement léger de l'ATP (Figure 8). D'autres augmentations de l'abondance des protéines NGAL ont été notées liées à la durée de l'épuisement de l'ATP. Ces résultats suggèrent que la protéine NGAL induite est rapidement sécrétée dans le milieu, analogue à l'apparition rapide de NGAL dans l'urine après une ischémie rénale in vivo.

Figure 8. Induction d'ARNm de NGAL après ischémie in vitro. (Haut) RT-PCR représentative avec des amorces pour la NGAL humaine, utilisant de l'ARN extrait de cellules épithéliales tubulaires proximales rénales (RPTEC) après diverses périodes d'épuisement partiel de l'ATP, comme indiqué (heures). La voie M contient une échelle d'ADN de 100-bp. (Moyen) Augmentation de l'expression de l'ARNm de la NGAL à différents moments à partir du contrôle (0), normalisée pour l'expression de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase. Les valeurs indiquées sont des moyennes SD de trois expériences à chaque instant. (En bas) Western blot représentatif avec des échantillons de RPTEC après diverses périodes d'épuisement partiel de l'ATP comme indiqué (heures), obtenu à partir de quantités égales de culots cellulaires (Pel) ou du milieu de culture (Sup), sondé avec un anticorps polyclonal anti-NGAL. Les marqueurs de poids moléculaire sont à gauche. La figure est représentative de trois expériences distinctes.

La protéine NGAL est facilement détectée dans l'urine tôt après l'induction de la néphrotoxicité induite par le cisplatine

Nous avons ensuite souhaité déterminer si la NGAL pouvait être détectée dans l'urine après d'autres formes de lésions des cellules tubulaires. Dans un modèle murin établi de néphrotoxicité du cisplatine, la NGAL a été facilement détectée dans l'urine en 1 jour après l'administration de cisplatine (Figure 9). En revanche, la 2-microglobuline urinaire était à peine détectable après 2 jours et ne pouvait être détectée de manière fiable qu'au jour 4 à 5 après le cisplatine. De même, l'augmentation de l'excrétion urinaire de NAG n'était pas évidente avant les jours 4 et 5 après l'administration de cisplatine (Figure 9).

Figure 9. Détection précoce de la protéine NGAL dans l'urine chez des souris présentant une lésion induite par le cisplatine. (A) Western blots représentatifs sur des échantillons d'urine non traités (1 à 2 l par voie, normalisés pour la teneur en créatinine) obtenus à des jours comme indiqué après l'administration de cisplatine, sondés avec un anticorps anti-2- microglobuline ou NGAL. Les marqueurs de poids moléculaire sont affichés à gauche. (B) Déterminations urinaires de NAG à plusieurs jours après l'administration de cisplatine (n 4). Les valeurs sont la moyenne plus -SD. *P 0.05 contre le jour 0.

Discussion

Nous avons utilisé une stratégie d'interrogation à l'échelle du transcriptome pour identifier les gènes rénaux qui sont induits tôt après l'ischémie rénale, dont les produits protéiques pourraient servir de nouveaux biomarqueurs pour l'ARF. Nous avons identifié sept gènes qui sont régulés à la hausse 10- fois, dont l'un (Cyr61) a récemment été signalé comme étant induit après une ischémie rénale (8). Inattendue, l'induction des six autres transcrits était nouvelle dans le domaine de l'ARF. Dans cette étude, nous avons choisi de caractériser davantage l'un de ces gènes jusque-là non reconnus, à savoir NGAL.

NGAL appartient à la superfamille des lipocalines de - 20 protéines sécrétées structurellement apparentées qui sont supposées transporter une variété de ligands dans un calice à canon (23). La NGAL humaine a été identifiée à l'origine comme une protéine 25-kD liée de manière covalente à la gélatinase des neutrophiles humains, où elle représente l'une des protéines granulaires secondaires des neutrophiles (24,25). Des études de clonage moléculaire ont révélé que la NGAL humaine est similaire au gène 24p3 ​​de souris identifié pour la première fois dans des cultures primaires de reins de souris qui ont été induites à proliférer (26). La NGAL est exprimée à de très faibles niveaux dans d'autres tissus humains, notamment les reins, la trachée, les poumons, l'estomac et le côlon (27). L'expression de NGAL est nettement induite dans les épithéliums stimulés. Par exemple, il est régulé à la hausse dans les cellules épithéliales du côlon dans les zones d'inflammation ou de néoplasie, mais est absent des zones intermédiaires non impliquées ou dans les lésions métastatiques (28). Les concentrations de NGAL sont élevées dans le sérum des patients atteints d'infections bactériennes aiguës (29), les expectorations des sujets souffrant d'asthme ou de maladie pulmonaire obstructive chronique (30) et le liquide bronchique du poumon emphysémateux (31). Dans tous ces cas, l'induction de NGAL est supposée être le résultat d'interactions entre les cellules inflammatoires et la muqueuse épithéliale, la régulation à la hausse de l'expression de NGAL étant évidente à la fois dans les neutrophiles et dans l'épithélium (28–32).

La régulation positive de la NGAL dans le rein mature n'a jusqu'à présent pas été décrite. Plusieurs éléments de preuve tirés de notre étude suggèrent que l'induction détectée de la NGAL représente une nouvelle réponse intrinsèque des cellules du tubule proximal du rein à une lésion ischémique et ne dérive pas simplement des neutrophiles activés. Premièrement, la réponse est extrêmement rapide, la NGAL apparaissant dans l'urine dans les 2 h suivant la blessure (dans la toute première production d'urine après l'occlusion de l'artère rénale), et l'accumulation de neutrophiles rénaux dans ce modèle d'ARF ischémique est généralement notée pour la première fois à 4 h après une blessure (33–35). Deuxièmement, les modèles temporels d'induction de NGAL et d'accumulation de neutrophiles sont divergents. L'expression de l'ARNm et des protéines de NGAL a été notée au maximum à 12 h de refusion, tandis que l'accumulation de neutrophiles culmine à 24 h (33–35), moment auquel l'expression de NGAL a considérablement diminué. Troisièmement, aucun neutrophile exprimant NGAL n'était détectable par immunofluorescence dans les échantillons de rein examinés (figure 4). Quatrièmement et le plus convaincant, il a été documenté que l'induction de l'ARNm et des protéines de la NGAL se produisait dans des cellules du tubule proximal humain en culture après une ischémie in vitro, la NGAL étant sécrétée dans le milieu de culture dans l'heure suivant l'épuisement de l'ATP, dans un système dans lequel les neutrophiles sont absolument absents. Cependant, nos études in vivo ne nous permettent pas d'exclure complètement une contribution de l'infiltration des neutrophiles activés à la régulation positive de la NGAL observée. En effet, il est possible qu'une régulation à la hausse de NGAL dans les cellules du tubule rénal puisse être induite par la libération locale de cytokines à partir de neutrophiles piégés dans la microcirculation tôt après une lésion ischémique.

Qu'est-ce qu'une cistanche ? Cistanchepeut traiterrénalblessure

Une explication adéquate de l'induction de NGAL par des épithéliums stimulés fait défaut, et si NGAL est protecteur ou proche d'une blessure ou même un spectateur innocent reste incertain. Des preuves récentes suggèrent que, au moins dans un sous-ensemble de types de cellules, NGAL peut représenter une molécule pro-apoptotique (36-38). Dans la lignée cellulaire lymphocytaire pro-B de souris, le retrait des cytokines a entraîné une induction marquée de la NGAL ainsi que le début de l'apoptose (36, 37). La NGAL a également été liée à l'apoptose dans les tissus reproducteurs. Les cellules épithéliales de la glande mammaire involutive et de l'utérus expriment des niveaux élevés de NGAL, coïncidant temporellement avec une période d'apoptose maximale (38). Il est probable que la NGAL régule un sous-ensemble de populations cellulaires en induisant l'apoptose. Les épithéliums stimulés peuvent réguler à la hausse la NGAL pour induire l'apoptose des neutrophiles infiltrants, permettant ainsi aux cellules résidentes de survivre aux ravages de la réponse inflammatoire. Alternativement, les cellules épithéliales peuvent utiliser ce mécanisme pour réguler leur propre disparition. Cependant, il est intéressant de noter dans nos études que l'induction de NGAL après la lésion d'ischémie-reperfusion rénale précoce se produit principalement dans les cellules du tubule proximal qui ne présentaient pas de noyaux TUNEL-positifs.

D'autres études récentes ont révélé que NGAL améliore le phénotype épithélial. La NGAL est exprimée par le bourgeon urétéral pénétrant et déclenche la néphrogenèse en stimulant la conversion des cellules mésenchymateuses en épithéliums rénaux (21). Une autre lipocaline, la glycodéline, s'est avérée induire un phénotype épithélial lorsqu'elle est exprimée dans des cellules de carcinome mammaire humain (40). Ces résultats sont particulièrement pertinents pour le rein mature, dans lequel l'une des réponses bien documentées aux lésions ischémiques est l'apparition remarquable de cellules épithéliales dédifférenciées tapissant les tubules proximaux (41). Un aspect important de la régénération et de la réparation rénale après une lésion ischémique implique la réacquisition du phénotype épithélial, un processus qui récapitule plusieurs aspects du développement normal (42). Cela suggère que la NGAL peut être exprimée par le tubule endommagé pour induire une réépithélialisation. Le soutien de cette notion provient de l'identification récente de NGAL en tant que protéine de transport du fer complémentaire de la transferrine au cours de la néphrogénèse (21). Il est bien connu que l'apport de fer dans les cellules est crucial pour la croissance et le développement cellulaires, et cela est probablement essentiel à la régénération rénale post-ischémique, tout comme c'est le cas lors de l'ontogénie. Étant donné que la NGAL semble lier et transporter le fer (21), il est également probable que la NGAL puisse servir de puits pour le fer qui est éliminé par les cellules épithéliales endommagées du tubule proximal. Étant donné que la NGAL peut être endocytosée par le tubule proximal (K. Mori et J. Barasch, observations non publiées), la protéine pourrait potentiellement recycler le fer en cellules viables. Cela pourrait stimuler la croissance et le développement, ainsi que retirer le fer, une molécule réactive, du site de la lésion tissulaire, limitant ainsi la cytotoxicité induite par le fer. Nos résultats montrant la co-localisation de NGAL dans les cellules tubulaires régénérantes et proliférantes PCNA-positives appuient davantage cette hypothèse.

Une implication majeure de nos découvertes concerne la possibilité que la NGAL soit un nouveau biomarqueur urinaire pour une ischémie.rénalblessurequi se compare favorablement avec d'autres biomarqueurs qui ont été décrits. L'exemple le mieux étudié est peut-être la molécule de lésion rénale-1 (KIM-1), une molécule d'adhésion putative impliquée dans la régénération rénale (43,44). Dans un modèle de rat de lésion d'ischémie-reperfusion, KIM -1 s'est avéré être régulé positivement 24 à 48 h après l'insulte initiale, ce qui en fait un marqueur fiable mais quelque peu tardif des dommages aux cellules tubulaires. Des études élégantes récentes ont montré que KIM -1 peut être détecté dans la biopsie rénale et l'urine de patients atteints de nécrose tubulaire aiguë ischémique (45). Cependant, cette détection a été documentée chez des patients présentant des lésions rénales ischémiques établies, et l'utilité de la mesure urinaire du KIM-1 pour la détection des lésions subcliniques précoces n'a pas encore été validée. Dans un autre exemple récent, la Cyr61 s'est avérée être une protéine sécrétée riche en cystéine qui est détectable dans l'urine 3 à 6 h après une lésion rénale ischémique (8). Cependant, cette détection a nécessité une étape de purification de bioaffinité avec des billes d'héparine-Sepharose, et même après une telle purification, plusieurs peptides à réaction croisée étaient apparents. En revanche, notre étude démontre que la NGAL a été facilement et rapidement détectée sous forme de peptides immunoréactifs relativement propres dans les Western blots avec aussi peu que 1 l de la toute première urine non traitée après ischémie rénale chez les souris et les rats. De plus, la NGAL urinaire était évidente même après une ischémie rénale "subclinique" très légère, malgré des taux de créatinine sérique normaux. De plus, la détection de la NGAL urinaire a précédé de loin l'apparition des marqueurs traditionnels dans l'urine, notamment la 2- microglobuline et la NAG.

Enfin, il convient de noter que la NGAL était également détectable dans les urines peu après l'administration de cisplatine, à un moment où d'autres indicateurs morphologiques et biochimiques derénalblessureétaient absents. Ainsi, la régulation à la hausse et l'excrétion urinaire de NGAL peuvent représenter une réponse rapide des cellules des tubules rénaux à une variété d'insultes, et la détection de NGAL dans l'urine peut représenter un outil clinique non invasif largement applicable pour le diagnostic précoce des lésions cellulaires des tubules.

En résumé, nos données indiquent que la NGAL représente un nouveau biomarqueur urinaire sensible et non invasif pour l'ischémie rénale. Il sera important dans les futurs travaux de traduction d'examiner l'expression de NGAL dans l'urine de patients atteints de formes légères et précoces d'ischémie.rénalblessure. On espère qu'une telle détection précoce permettra aux cliniciens d'instituer des efforts d'intervention en temps opportun dans l'ARF, une condition toujours associée à un pronostic sombre pour laquelle de nouvelles thérapies sont désespérément nécessaires. En outre, on espère qu'une détection aussi rapide et simple de la NGAL urinaire chez les patients présentant une ischémie subclinique subtilerénalblessure(par exemple, greffes de rein liées à la vie, chirurgie vasculaire, événements cardiovasculaires) ou des dommages néphrotoxiques subcliniques (par exemple, l'utilisation d'agents de contraste et d'aminoglycosides) alerteront le clinicien pour qu'il institue des manœuvres visant à prévenir la progression vers une IRA manifeste.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health/National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases à PD (DK53289, DK52612) et JB (DK55388 et DK58872).

Cistanche tubulosapeut traiterlésion rénale

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