Partie 2 : La régulation à la baisse de l'Hsa-miR-127-3p rénal contribue à la suractivation de la voie de signalisation de l'interféron de type I dans le rein de la néphrite lupique

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Lasystème immunitaireest le "gardien" de notre corps et est l'arme la plus efficace contre l'invasion d'agents pathogènes. Les personnes ayant une faible immunité innée sont plus susceptibles de tomber malades. Les résultats expérimentaux montrent que les ingrédients actifs de Cistanche peuvent renforcer l'immunité du corps.

Regardons de plus près.

1. Glycosides totaux de Cistanchetubuleux

Les glucosides totaux de Cistanche tubulosa ont considérablement amélioré la production d'anticorps, le nombre de lymphocytes T du sang périphérique, la fonction phagocytaire des macrophages péritonéaux et les réactions d'hypersensibilité de type retardé chez les souris blessées par les rayons Co. L'indice, l'indice de la rate et le taux de survie ont montré que les glucosides totaux de Cistanchetubuleuxavait un fort effet protecteur sur la fonction immunitaire des souris radio-lésées.

2. Polysaccharides cistanches

Cistanchetubuleuxles polysaccharides de Cistanche peuvent réduire la teneur en MDA dans le cerveau, le cœur et le foie de modèles animaux immunodéprimés, augmenter l'activité de la télomérase dans le cœur et les tissus cérébraux, la fonction phagocytaire des macrophages péritonéaux, la prolifération des lymphocytes, les lymphocytes T de la rate Le contenu en IL{ {0}} et la concentration d'ions calcium dans les thymocytes ont montré que le polysaccharide de Cistanche deserticola pouvait renforcer la fonction immunitaire de l'organisme.

3. Verbascum

L'ingrédient actif de Cistanchetubuleux, Xinjiang, a fait en sorte que le D-galactose réduise de manière significative la teneur en MDA dans le cœur, le foie et les tissus cérébraux des souris modèles de vieillissement subaigu, et augmente considérablement l'activité de la télomérase dans les tissus cardiaques et cérébraux. La fonction phagocytaire des phagocytes a été améliorée, et la prolifération des lymphocytes et la teneur en IL-2 dans le sang périphérique ont été significativement augmentées. Il est démontré que Verbascum peut renforcer la fonction immunitaire du corps.

Résumé : Que vous ayez une faible immunité innée ou une faible immunité acquise, vous pouvez manger des aliments liés à la cistanche pour réguler votre propre immunité.

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RÉSULTATS

Hsa-miR-127-3p ls un régulateur négatif de la voie de signalisation IFN-I

Dans notre effort précédent pour étudier les miARN rénaux dans le LN, nous avons comparé les profils de miARN deun reinbiopsies de patients LN et d'un groupe témoin normal (décrit dans MATÉRIELS ET MÉTHODES). Il y avait un modèle d'expression de miARN distinct dans les tissus rénaux des patients LN (Figure S1). Parmi les miARN exprimés de manière différentielle, nous avons sélectionné 9 miARN qui étaient régulés à la baisse (au moins de 50%) et conservés (entre l'homme et la souris) et testé leurs rôles dans la voie de signalisation de l'IFN-I par le dosage du rapporteur ISRE-luciférase. Compte tenu de la source limitée de cellules rénales humaines primaires et de leur capacité de prolifération in vitro limitée, nous avons criblé et vérifié la fonction régulatrice des miARN et étudié les mécanismes moléculaires associés à l'aide de cellules Hela. Par rapport aux 8 autres miARN, la surexpression de hsa-miR-127-3p a inhibé de manière significative l'induction médiée par l'ISRE de l'activité de la luciférase dans les cellules Hela stimulées par l'IFN- (Figures 1A et Figure S2). Ainsi, nous avons choisi d'étudier plus avant hsa-miR-127-3p. En plus de l'IFN-, l'IFN- (un autre membre de l'IFN-I) stimulée par l'induction de l'activité ISRE-luciférase pourrait également être inhibée par hsa-miR -127-3 p (Figure S3). L'IFN-I peut également induire l'expression génique médiée par l'élément GAZ (3). Comme prévu, la surexpression de hsa-miR-127-3p a inhibé l'induction médiée par le GAS de l'activité de la luciférase stimulée par l'IFN- (Figure 1A). Étant donné que les miARN reconnaissent leurs cibles par appariement de bases complémentaires de leurs séquences de graines aux sites cibles sur les ARNm cibles (6). Cette fonction inhibitrice de hsa-miR-127-3p sur la voie de signalisation de l'IFN-I a été éliminée par la mutation de sa séquence de graine (figures 1A). Conformément à ces résultats, la surexpression de hsa-miR-127-3p a inhibé la phosphorylation stimulée par l'IFN de STATl et STAT2, avec un effet beaucoup plus fort sur STAT2, dans les cellules Hela (figures 1B et S4). Pour prouver que cet effet inhibiteur de hsa-miR-127-3p n'était pas limité aux cellules Hela, nous avons en outre vérifié que la surexpression de hsa-miR-127-3p inhibait la phosphorylation stimulée par l'IFN de STAT2 dans deux types de cellules supplémentaires (Figure S5).

Pour validerhsa-miR-127-3p fonctionne comme un régulateur négatif intrinsèque à la cellule de la voie de signalisation IFN-I dans les cellules résidentes rénales, nous avons effectué des dosages de rapporteur ISRE et GAS-luciférase à l'aide de CMRH primaires, qui peuvent répondre aux stimuli immunitaires innés et participer à la pathogenèse de LN comme indiqué dans des études antérieures(12-15). Nous avons trouvé hsa-miR-127-3p antagomir amélioré ISREorGAS induit par l'induction de l'activité de la luciférase stimulée par l'IFN- dans les CMRH primaires (Figure 1C). En outre, l'antagomir hsa-miR-127-3p a amélioré la phosphorylation de STAT2 stimulée par l'IFN- dans les CMRH primaires (figures 1D et S6).

Ensuite, nous avons réalisé un microarray pour analyser l'effet inhibiteur de hsa-miR-127-3p sur l'expression des gènes à l'aide d'échantillons d'ARN

à partir de cellules Hela traitées à l'IFN qui ont été préalablement transfectées avec hsa-miR-127-3p ou divers contrôles (simulation de transfection, mimiques de contrôle négatif, mimiques de mutants hsa-miR-127-3p). Nous avons calculé les gènes exprimés différentiellement qui se chevauchent dans les cellules Hela traitées à l'IFN-o (exprimées à la hausse ou à la baisse de 1,5- fois) entre différentes paires de comparaison (hsa-miR-127-3p imite vs mock, hsa-miR{ {11}}imitateurs p vs imitateurs témoins négatifs, et hsa-miR-127-3imitateurs p vs hsa-miR-127-3imitateurs mutants p), ont récupéré tous les gènes inhibés par hsa-miR{{17 }}p et effectué une analyse pour identifier les motifs cis-régulateurs enrichis des gènes inhibés hsa-miR-127-3p à l'aide du plug-in iRegulon sur la plate-forme Cytoscape (10). Nous avons constaté que le motif cis-régulateur utilisé par les TF en aval de l'IFN-I (tels que STAT-1, STAT-2 et les protéines IRF) dominait les motifs les plus enrichis (9 sur les 10 principaux motifs) (Figure 2A). Cela prouve en outre que hsa-miR-127-3p inhibe principalement la signalisation IFN-I en aval. De plus, à partir des données du microréseau, nous avons constaté que la surexpression de hsa-miR-127-3p inhibait l'induction de nombreux ISG, y compris ceux qui constituent la signature 21-gène IFN utilisée pour évaluer l'efficacité de l'anifrolumab dans le blocage de l'IFN -I signalisation(8)(Figure 2B). Conformément aux résultats précédents, les mimiques mutantes hsa-miR-127-3p ne pouvaient pas inhiber ces ISG (figure 2B). Nous avons vérifié l'inhibition de hsa-miR-127-3p sur deux ISG représentatifs (IFIT3 et CXCL10) par des expériences indépendantes supplémentaires (figure 2C). Tandis que l'antagomir hsa-miR-127-3p améliorait l'induction d'IFIT3 et de CXCL10 par l'IFN- dans les CMRH primaires (Figure 2D). Par conséquent, hsa-miR-127-3p fonctionne comme un régulateur négatif de la voie de signalisation IFN-I.

JAK1 est un véritable gène cible de Hsa-miR-127-3p

Étant donné que hsa-miR-127-3p inhibe la phosphorylation de la tyrosine de STAT1 et STAT2 et l'induction de la plupart des ISG stimulés par l'IFN-I, nous avons émis l'hypothèse que hsa-miR-127-3p pourrait cibler des molécules clés de transduction du signal en amont de Voie de signalisation IFN-I, telle que JAK1 et TYK2. Par conséquent, nous avons examiné les niveaux de protéines de JAK1 et TYK2 dans les cellules transfectées avec hsa-miR-127-3p ou mimic control. Nous avons constaté que la surexpression de hsa-miR-127-3p réduisait l'expression de JAK1 au niveau des protéines et au niveau de l'ARNm, mais pas de TYK2 (figures 3A et S7, S8). Ainsi, nous avons décidé de tester si JAK1 était une cible de hsa-miR-127-3p.

Par 2 algorithmes différents (16,17), nous avons prédit 3 sites de liaison potentiels hsa-miR-127-3p sur l'ARNm de JAK1, avec un site de liaison en 3'UTR et les deux autres dans la séquence codante (CDS) (Figure S9) . Bien que faibles, les mimiques hsa-miR-127-3p inhibent l'expression du gène de la luciférase fusionné avec JAK13'UTR de type sauvage, tandis que la mutation de la séquence cible dans JAK1 3'UTR supprime l'inhibition (Figure 3B). De plus, nous avons cloné une région codante JAK1 tronquée contenant les 2 sites cibles hsa-miR-127-3p dans le vecteur pCDNA3.1. Ensuite, nous avons créé une forme mutante du plasmide d'expression de troncature JAK1 en perturbant les 2 sites cibles hsa-miR-127-3p. Nous avons constaté que hsa-miR-127-3p pouvait également inhiber l'expression de JAK1 tronqué à partir du plasmide de type sauvage, mais pas celui du mutant (figures 3C et S10). Considérant que l'effet inhibiteur indépendant de hsa-miR-127-3p sur JAK1-3'UTR ou JAK1-CDS était faible, nous proposons que hsa-miR-127-3p agisse sur ces sites de liaison ensemble pour obtenir une inhibition significative de l'expression de JAK1. Pour vérifier davantage cette relation de ciblage entre hsa-miR-127-3p et JAK1, nous montrons que l'ARNm de JAK1 était enrichi dans le complexe Ago2 dans les cellules où hsa-miR-127-3p était surexprimé, mais pas dans les cellules surexprimant la forme mutante de hsa-miR-127-3p (Figure 3D).

En outre, nous avons constaté que les niveaux de hsa-miR -127-3 p dans les biopsies rénales de patients LN étaient significativement inférieurs à ceux des témoins normaux (Figure 4A), tandis que les niveaux de JAK1 et IFIT3 dans les biopsies rénales de patients LN étaient significativement plus élevés que ceux des témoins normaux (figures 4B, C). De plus, il y avait une corrélation négative entre les niveaux de hsa-miR -127-3 p et JAK1 (ou IFIT3) dans les biopsies rénales de patients LN (figures 4D, E). Par conséquent, JAK1 est un véritable gène cible de hsa-miR-127-3p.

DISCUSSION

Dans la présente étude, nous avons poursuivi nos efforts précédents pour explorer les fonctions des miARN rénaux dérégulés dans le LN. Ici, nous nous sommes concentrés sur les miARN régulés négativement dans les biopsies rénales de patients LN. Nous en avons retenu 9 pour l'analyse basée sur 2 critères : la conservation et le degré de régulation négative (détaillé dans RÉSULTATS). Étant donné que l'IFN-I est essentiel au développement de SLE et LN (3), nous avons criblé les 9 miARN pour les régulateurs potentiels de la voie de signalisation de l'IFN-I. Nous avons identifié hsa-miR-127-3p comme un régulateur négatif de la voie de signalisation IFN-I en montrant qu'il pouvait inhiber la phosphorylation des protéines STAT et l'induction médiée par ISRE (ou GAS) de l'expression génique stimulée par l'IFN- . Nous avons découvert que cet effet inhibiteur existait dans plusieurs types cellulaires distincts. De plus, la surexpression de hsa-miR-127-3p pourrait réduire considérablement l'induction des ISG. De plus, il existe un chevauchement considérable entre les ISG inhibés par hsa-miR-127-3p et la signature IFN supprimée par l'anifrolumab - 17 des 21 gènes de signature IFN pourraient être inhibés par hsa-miR-127-3p - qui est utilisé pour évaluer l'efficacité inhibitrice de l'anifrolumab (18). Il convient de noter qu'un récent essai clinique de phase 3 a suggéré que l'administration mensuelle de nivolumab profite aux patients atteints de LES par rapport au placebo(2). Ainsi, nos résultats indiquent que hsa-miR-127-3p peut servir de maladie bloquant l'IFN-I (20). Cela renforce encore le potentiel thérapeutique de hsa-miR-127-3p dans le traitement des maladies auto-immunes.

Il y a des questions non résolues pour de futures études. La première est que nous ne connaissons toujours pas le mécanisme exact de la régulation négative de hsa-miR-127-3p dans le rein du LN, ce qui nous aidera à comprendre la pathogenèse du LN. Nos données préliminaires non publiées indiquent que l'activation à long terme de la voie de signalisation IFN-I a supprimé l'expression de hsa-miR-127-3p. Ainsi, il peut y avoir une boucle d'action directe formée par l'IFN-I excessif et la diminution du hsa-miR-127-3p intracellulaire, qui amplifie la signalisation IFN-I. L'autre est que, jusqu'à présent, nous ne pouvions pas examiner les effets inhibiteurs in vivo de hsa-miR-127-3p sur JAK1 car les séquences de liaison hsa-miR-127-3p du gène JAK1 humain n'existent pas chez la souris . À l'avenir, des souris modifiées exprimant le gène JAK1 humain pourraient aider à clarifier l'efficacité in vivo de hsa-miR-127-3p dans l'inhibition de JAK1 et de la signalisation des cytokines associées.

Pour résumer, nous montrons que JAK1 est une cible authentique de hsa-miR-127-3p et une régulation négative anormale de hsa-miR-127-3p rénal contribue à la pathogenèse du LN en améliorant l'expression de JAK1 et l'activation ultérieure de la voie de signalisation IFN-I dans le rein. Étant donné que les voies de signalisation des cytokines inflammatoires associées à JAK1-sont essentielles au développement de nombreuses maladies auto-immunes(4), de futures études sont justifiées pour explorer les effets thérapeutiques de hsa-miR-127-3p sur la LN ou d'autres maladies auto-immunes liées dommages aux organes avec régulation anormale de JAK1.