Partie 2 : Interactions de l'acide ascorbique, de l'5-acide caféoylquinique et de la quercétine-3-rutinoside en présence et en l'absence de fer pendant le traitement thermique et influence sur l'activité antioxydante

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3. Débat

3.1.Relation structure-activité de l'acide ascorbique, de l'5-acide caféoylquinique et de la quercétine-3-rutinoside

Un premier indicateur de l'AOA, mesuré pour différentes substances en fonction de la relation structure-activité, résulte du nombre de groupements fonctionnels. En comparant les trois substances analysées, l'acide ascorbique avait l'AOA le plus bas, suivi de l'acide 5-caféoylquinique, tandis quequercétine-3-rutinosideatteint l'angle d'attaque le plus élevé. Csepregi et al. [14] ont trouvé le même ordre en comparant l'AOA de ces trois composés. Ce classement peut s'expliquer par la quantité totale de groupes hydroxy : quercétine-3-rutinoside en a dix, 5-acide caféoylquinique en a cinq, etacide ascorbiquea quatre. Pourflavonoïdes, la quantité totale de groupes hydroxy et leur impact sur les mécanismes de l'AOA ont été précédemment démontrés par Burda et Oleszek [15]. Les groupes hydroxy sont particulièrement précieux dans les structures enediol, car ils peuvent facilement s'oxyder en dicétones [8]. Dans les substances analysées, la structure endiol est également importante pour la capacité à former des complexes avec des ions métalliques [16-18]. La structure endiol se produit dans les molécules de quercétine-3-rutinoside et d'acide 5-caféoylquinique dans le cycle phényle, ce qui peut également influencer l'AOA plus fort de ces composés. D'autres études ont montré que l'AOA peut également être influencée par d'autres structures moléculaires. Les acides phénoliques sont peut-être affectés par les groupes acides carboxyliques, par exemple, l'acide hydroxyphénylacétique (R-CH=CH-COOH) est un groupe attracteur d'électrons plus faible que l'acide hydroxycinnamique (R-CH,-COOH) tel sous forme d'acide caféique dans l'acide 5-caféoylquinique [19]. Dans les flavonoïdes, les aglycones avaient une AOA plus élevée que les glycosides correspondants [20,21], dans le cas de la quercétine-3-rutinoside, un glycoside, l'AOA de l'aglyconequercétineest par conséquent plus élevé [14]. Il existe de nombreux groupes fonctionnels différents qui peuvent influencer l'AOA et, par conséquent, il est important d'utiliser différents tests de test avec différents mécanismes, tels que le transfert d'électron unique (SET), le transfert d'atome d'hydrogène (HAT) et l'électron séquentiel à perte de protons. transfert (SPLET) pour la détection. Chaque mécanisme et même le réactif de dosage utilisé peuvent détecter différentes structures de composés bioactifs [22].

3.2.Influence du traitement thermique et de l'interaction d'antioxydants structurellement différents sur l'activité antioxydante en l'absence de fer minéral

Une AOA stable sur une durée prolongée de 40 min de traitement thermique indique que la dégradation thermique est moins importante que prévu initialement. De plus, les données HPLC ont montré que l'acide 5-caféoylquinique pur et la quercétine-3-rutinoside étaient stables, avec une dégradation maximale de 20 %, pendant le traitement thermique. Des études antérieures ont prouvé la stabilité de l'acide 5-caféoylquinique jusqu'au point d'ébullition normal de l'eau [23], tandis que Dawidowicz et Typek[24] ont trouvé neuf composés dérivés, après avoir chauffé l'acide 5-caféoylquinique pendant 5 h sous reflux. Pour la concentration en acide ascorbique, une dégradation après 40 min de cuisson a été constatée. Les facteurs d'influence, entraînant la dégradation de l'acide ascorbique sans fer dans une solution aqueuse, pourraient être les valeurs de pH, l'exposition à la lumière, l'oxydation, la température et différentes concentrations [25,26]. Dans cette étude, les facteurs température et concentration ont très probablement joué le rôle principal, car les processus oxydatifs ont été réduits au minimum en raison de l'espace gazeux minimal dans les microtubes. Il est possible que la phase gazeuse restante soit encore suffisante pour la dégradation dans des conditions aérobies. Les différentes conditions donnent des produits différents [27,28], donc dans cette étude, après 40 min de cuisson, des produits des deux conditions ont pu être trouvés. Yuan et Chen [28] ont rapporté que le furfural, l'2-acide furoïque, l'3-hydroxy-2-pyrrone et une substance inconnue sont les principaux produits de dégradation de l'acide ascorbique dans une solution aqueuse en fonction de la valeur du pH. . Shinoda et al. [29,30] ont trouvé dans le jus d'orange les produits de dégradation furfural, 2-acide furoïque, 5-hydroxymaltol, 3-hydroxy-2-pyrrone et 5-(hydroxyméthyl )furfural. Hsu et al. [31] ont analysé l'acide ascorbique dans des solutions éthanoliques et ont détecté de l'acide 2-furoïque et de l'3-hydroxy-2-pyrrone. Selon les conditions aérobies ou anaérobies, les dérivés d'acide ascorbique détectés (pics 3 et 4) peuvent être du furfural, de l'acide 2-furoïque ou de l'3-hydroxy-2-pyrrone ou des intermédiaires. L'acide ascorbique a diminué dans une relation dose-réponse, et des concentrations plus élevées d'acide ascorbique ont montré des taux de dégradation plus faibles pendant la cuisson. L'acide ascorbique semble se stabiliser à des concentrations plus élevées, probablement en raison des liaisons hydrogène et de l'énergie de van de Waals [32].

Dans les mélanges binaires et ternaires, on a trouvé principalement des effets supplémentaires sur l'AOA. Dans les mélanges binaires, si la substance avec un AOA plus élevé augmentait en concentration, l'AOA de leur combinaison augmentait également. D'autres études ont également trouvé des effets additifs entre la (plus)-catéchine (200 um) et l'acide ascorbique (50-200 mg/L)[33], et entre des mélanges binaires de différents monoterpènes[34]. Uniquement dans le test DPPH, des effets antagonistes ont été trouvés dans l'acide 5-caféoylquinique combiné à la quercétine-3-rutinoside et dans des mélanges ternaires avec des concentrations doublées de quercétine-3-rutinoside. Cela pourrait être causé par l'orientation des molécules dans l'espace, en particulier la quercétine-3-rutinoside, en tant que molécule assez grande, et l'accessibilité stérique de la molécule radicalaire DPPH [35]. Dans le test TPC, la combinaison d'acide ascorbique et d'acide 5-caféoylquinique a entraîné de forts effets antagonistes dans un rapport 1:2, tandis que des mélanges inversés avec un rapport 2:1 ont entraîné de forts effets synergiques, dépassant la somme des AOA respectifs. L'acide ascorbique à double concentration peut donner, dans ces conditions, un coup de pouce supplémentaire à l'AOA, en raison de l'auto-stabilisation suivie de la stabilisation d'autres molécules, démontrée par l'acide 5-caféoylquinique dans cette expérience. Dans le jus de grenade-nectarine, entre les phénols naturels et l'acide ascorbique, la même interaction a été trouvée, tandis que dans le jus de raisin, des effets antagonistes croissants en augmentant la concentration en acide ascorbique ont été observés [36]. Ces résultats suggèrent que les mélanges d'acide ascorbique, de 5-caféoylquinique et de quercétine-3-rutinoside atteignent le potentiel d'AOA le plus élevé lorsque le plus puissantantioxydantssont abondamment disponibles.

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3.3. Influence du fer minéral

The addition of iron to the samples had the most influence on changes in their AOA. Contrary to the hypothesis, based on the pro-oxidative activity of iron, the AOA increased, compared to the same substance or substance mixture without iron. Iron may act like a catalyst itself or forms metal chelates, which are effective catalysts. The changed stoichiometry of the chelates can form additional radical-scavenging metal centers [18], which explains the increased AOA. Further tests showed that reduced ferrous iron (50-100%,v/o)itself interacts with the TEAC(0.266-0.538 mol TE/mol iron), DPPH(0.210-0.495 mol TE/mol iron), and TPC(16.65-31.82g GAE/mol iron) assay reagents, while oxidized ferric iron does not (data not shown). In the presence of iron, 5-caffeoylquinic acid had the highest AOA, followed by quercetin-3-rutinoside and ascorbic acid in TEAC and DPPH assays. This may be due to the changed stoichiometry by metal chelation. The AOA ranking detected by the TPCassay stayed the same, as in the absence of iron: quercetin-3-rutinoside >5-caffeoylquinic acid>acide ascorbique. Cependant, l'ajout de fer aux mélanges a eu une influence sur les résultats des tests TEAC et DPPH, tandis que les tests TPC n'ont pratiquement pas été affectés. Pour cette raison, il est important d'utiliser différents tests de test avec différents mécanismes de travail lorsque vous travaillez avec des échantillons riches en fer.

Ce n'est que dans le test DPPH que l'AOA de la quercétine-3-rutinoside pure, et en combinaison avec l'acide ascorbique, équimolaire ou non équimolaire avec des concentrations doublées de quercétine-3-rutinoside, avait des valeurs inférieures en présence de fer. Boligon et al. [351 ont expliqué que le test DPPH détecte mieux les antioxydants plus petits, en raison de l'accessibilité stérique de ces radicaux. Vraisemblablement, la quercétine-3-rutinoside avec les deux côtés de liaison peut construire des complexes assez grands avec le fer, et donc être inaccessible pour le dosage. Comme mentionné par Kejic et al. [8], cela pourrait s'expliquer par la formation de complexes supramoléculaires via la coordination d'ions métalliques. En combinaison avec l'acide ascorbique, qui est capable de construire des complexes à valence mixte dans un rapport 1: 2 [12], on peut supposer que ces complexes mixtes plus grands ne peuvent pas interagir avec le radical DPPH. Contrairement aux résultats de cette étude, d'autres études [18,37,38] ont trouvé, en utilisant le test DPPH, que les complexes de quercétine-3-rutinoside sont des antioxydants plus efficaces que la quercétine-3-rutinoside pure. Il est connu que les complexes chélates de flavonoïdes et d'ions métalliques peuvent annuler l'activité radicalaire des ions métalliques complexés [39]. La seule différence était que dans cette étude, le sulfate de fer (II) d'ammonium a été utilisé, au lieu du chlorure ou du sulfate de fer (ⅡI), utilisé dans les travaux de Symonowics et Kolandek [39].

Des effets synergiques entre l'acide ascorbique et l'acide 5-caféoylquinique en présence de fer dans le rapport 2:1, et des effets antagonistes dans le rapport 1:2, ont été trouvés. L'association d'acide 5-caféoylquinique avec du fer n'était pas recommandée in vivo [6]. Cependant, cette étude a montré que, in vitro, la quantité doublée d'acide ascorbique par rapport à l'acide 5-caféoylquinique peut même avoir des effets synergiques sur l'AOA. D'autres recherches sur les ratios pourraient montrer si des effets positifs peuvent également être obtenus in vivo.

Selon les données HPLC, l'ajout de fer à l'échantillon aura un effet minimal sur son activité catalytique, car seule la concentration d'acide ascorbique dans 0 minutes d'échantillons cuits a diminué. Dans les échantillons d'acide ascorbique cuit, contrairement aux échantillons sans fer, des concentrations plus élevées d'acide ascorbique ont entraîné un taux de dégradation plus élevé.5-L'acide caféovlquinique et la quercétine-3-le rutinoside nécessitent les facteurs supplémentaires température et temps, ainsi que interactions dans les mélanges, pour que l'activité catalytique du fer fonctionne. La quercétine-3-rutinoside, en présence de fer, n'a diminué que dans des mélanges binaires avec de l'acide ascorbique après traitement thermique. Cela pourrait être dû au fait que le flavonoïde agit comme un antioxydant primaire, puis que le radical composé résultant réagit avec l'acide ascorbique, régénérant le composé d'origine [18]. 5-L'acide caféoylquinique semble être spécial, car il protège la quercétine-3-rutinoside, tandis que l'acide ascorbique n'est pas capable de protéger la quercétine-3-rutinoside. Par conséquent, l'acide 5-caféoylquinique peut être la molécule clé pour stabiliser le système en combinaison avec le fer et le traitement thermique. Cette hypothèse de l'acide 5-caféoylquinique en tant que molécule stabilisante a été confirmée dans les mélanges ternaires. Ici, la quercétine-3-rutinoside a toujours été stabilisée par l'acide 5-caféoylquinique, de sorte que même en présence d'acide ascorbique, aucune réduction de la concentration de quercétine-3-rutinoside n'a été observée. Dans une autre étude, l'acide 5-caféoylquinique a démontré des propriétés protectrices contre la dégradation des anthocyanes par un mécanisme de co-pigmentation [40]. De nouveaux produits de dégradation, avec un AOA peut-être plus élevé, sont apparus à partir des trois substances en présence de fer. L'acide caféique (pic 6) a été identifié comme un 5-produit de dégradation de l'acide caféoylquinique (données non présentées). Cela a conduit à l'hypothèse que l'autre substance pourrait être l'acide quinique ou l'un des neuf dérivés possibles décrits par Dawidowicz et Typek [24] : acide quinique ; (1S,3R,4R,5R)-5-[{{24 }}(3,4-dihydroxyphényl)-2-hydroxypropanoyl]-1,4,5-acide trihydroxy-cyclohexanecarboxylique ;(1S3R,4R,5R)-5- acide [3-(3,4-dihydroxyphényl)-3-hydroxypropanoyl]-1,4,5 trihydroxycyclohex-anecarboxylique ; l'acide trans 3-O-caféoylquinique ; l'acide trans 5-O-caféoylquinique ; l'acide trans 4-O-caféoylquinique ; acide caféique; acide cis-5-O-caféoylquinique ; acide 4,5-dicaféoylquinique. Pour la quercétine-3-rutinoside, un produit de dégradation apparaît dans le chromatogramme, qui n'a pas pu être identifié.

3.4. Capacité à former des chélates avec du fer ferrique (Fe3 plus) et du fer ferreux (Fe2 plus)

Dans tous les échantillons contenant de l'acide ascorbique, le fer ferrique a été réduit en fer ferreux. Dans ce processus,acide ascorbiqueprend un électron du fer ferrique et le réduit en fer ferreux, et devient lui-même un radical. Le radical instable se transforme rapidement en acide déhydroascorbique et en d'autres produits de dégradation [12]. En raison de l'absence de peroxyde d'hydroxy, une réaction de retour au fer ferrique via le cycle de Fenton n'est pas possible. Dans 0 minutes de mélanges binaires cuits, plus de 20 % du fer était lié en présence d'acide ascorbique. On sait que l'acide ascorbique forme des complexes avec des espèces de fer et d'autres ions métalliques par chélation via les noyaux 3-O et 2-O suite au déplacement d'hydrogène des 3-OH et 2- Groupes OH [16,17,41. Il peut également former des complexes fer-ascorbate à valence mixte [42]. Cependant, l'acide ascorbique est un agent chélateur faible et, après cuisson, seules des traces de fer lié ont été détectées dans les échantillons purs et mélangés lorsque l'acide ascorbique était présent. De plus, en raison du processus de cuisson, l'acide ascorbique se décompose en produits de dégradation, qui semblent incapables de se chélater avec le fer.

5-L'acide caféoylquinique est un réducteur relativement médiocre. Le fer ferrique a été réduit par l'5-acide caféoylquinique, et avec une cuisson prolongée, la réduction a augmenté.5-Chélates d'acide caféoylquinique avec du fer ferrique dans un transfert de charge ligand-métal [17].5-Acide caféoylquinique porte un côté de liaison possible à la structure 3,4 endiol de l'acide caféique. Cela pourrait être un indicateur de la raison pour laquelle l'acide caféique est la partie bioactive de l'acide 5-caféoylquinique, alors que l'acide quinique n'a presque pas d'AOA [43]. Les endiols ont inhibé la formation d'OH en raison de la formation d'un complexe de fer [41] dans un rapport de un à un [44,45]. Lamy et al.[46]concluent que l'acide 5-caféoylquinique forme des complexes monomères, alors que Kiss et al. [47] ont trouvé des espèces oligomériques. Contrairement aux études précédentes [17,48], seules des traces de fer lié ont été trouvées en présence d'acide 5-caféoylquinique avant et après le traitement thermique. Cela peut s'expliquer par les conditions de pH neutre dans cette étude, alors que d'autres études ont travaillé en milieu acide, en se basant sur une valeur de pH de 1-2.5 dans l'estomac humain [48]. Un précipité noir a été trouvé dans les échantillons stockés après plusieurs heures, ce qui est un indicateur de complexes 5-acide caféoylicquinique-fer ferrique. Des échantillons récemment mélangés ont été utilisés pour l'analyse, de sorte que la formation de ces complexes à un pH neutre nécessite une période de temps plus longue. Les complexes de fer avec l'acide caféique ont montré une faible activité de piégeage [49]. De plus, il n'existe aucune preuve spectrophotométrique d'une réaction entre l'acide quinique et le fer ferrique [48]. Contrairement à l'acide 5-caféoylquinique, dans l'échantillon de quercétine-3-rutinoside, du fer lié a été trouvé, même après traitement thermique.

La quercétine-3-rutinoside réduit le fer ferrique en fer ferreux avec une augmentation minimale par un temps de cuisson prolongé. Cette activité réductrice modérée de la quercétine-3-rutinoside a déjà été décrite par Mira et al. [50]. L'activité réductrice ferrique de la quercétine-3-rutinoside a été détectée dans le 3-rutinoside, 5,7,3',4'-OH [50]. L'interaction modérée avec le fer ferrique peut s'expliquer par un nombre inférieur de groupes -OH, ce qui a entraîné une densité de charge négative plus faible du côté de la chélation [50]. Les flavonoïdes peuvent chélater avec des ions métalliques sur trois côtés de coordination potentiels : (i) entre les groupes 5-hydroxy et 4-carbonyle, (ii) entre les groupes 3-hydroxy et 4-carbonyle, et (ii) entre les groupes 3', A'-hydroxy dans Bring [39]. La quercétine-3-rutinoside utilise les côtés de liaison (i) et (i)[9], et au niveau du groupe 3-hydroxy, le rutinoside est attaché. Les données spectrales ont même montré que les ions métalliques ne sont liés qu'au groupe 3', A'-hydroxy [18]. Les chélates sont plus efficaces avec le fer sous sa forme bivalente [50]. Dans les mélanges binaires, la quercétine-3-rutinoside n'est pas capable de former des complexes lorsque l'acide ascorbique est présent, contrairement aux mélanges ternaires. Si l'acide 5-caféoylquinique est présent, de petites quantités de fer lié sont trouvées. Cela indique que le 5-caféoylquinique protège les molécules de quercétine-3-rutinoside en présence d'acide ascorbique, de sorte que la quercétine-3-rutinoside peut former des complexes avec le fer.

4. Matériels et méthodes

4.1.Produits chimiques

ABTS(2,2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt)(≥98%)was obtained from Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany), DPPH*(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) radical (95%) and Trolox(97%)were obtained from Thermo Fisher (Kandel, Germany). Folin-Ciocalteu phenol reagent was purchased from Merck(Darmstadt, Germany). HPLC grade methanol, acetonitrile(HPLC grade), glacial acetic acid (100%, p.a.), sodium acetate trihydrate (≥99.5% p.a.), potassium thiocyanate (≥98.5%, p.a., ACS),2,2'-dipyridyl (≥95%), hydrochloric acid (≥25%, p.a., ISO), gallic acid monohydrate (≥99%), potassium persulfate (≥99%), rutin trihydrate (working standard), chlorogenic acid (working standard), L-(+)-ascorbic acid (working standard), sodium carbonate(>99 pour cent), le sulfate ferrique d'ammonium dodécahydraté et le sulfate ferreux d'ammonium hexahydraté ont été achetés auprès de Carl Roth (Karlsruhe, Allemagne).

4.2.Échantillons

Des solutions aqueuses et des mélanges d'étalons authentiques d'acide ascorbique, d'acide {{0}}caféoylquinique et de quercétine-3-rutinoside ont été préparés sous forme de solutions pures et de mélanges dans différents rapports. Tous les mélanges binaires possibles ont été réalisés dans des rapports équimolaires et les rapports non équimolaires avec un composé ont doublé. Des mélanges ternaires ont également été préparés dans des rapports équimolaires, ainsi que dans des rapports non équimolaires avec un ou deux composés doublés, respectivement. Les concentrations finales des antioxydants étaient 0.3 mM pour chaque solution test. De plus, toutes les expériences ont été répétées après l'ajout de 0.3 mM de fer ({{10}}.15 mM de fer ferreux et 0,15 mM de fer ferrique) au total par mélange. Les quantités choisies d'antioxydants et de fer ne sont pas basées sur des niveaux physiologiques ou alimentaires, elles sont basées sur des masses molaires pour étudier l'effet de l'interaction moléculaire. Par conséquent, un rapport équimolaire entre les antioxydants totaux et le fer a été établi. Tous les mélanges ont été cuits pendant 0, 10, 20 et 40 min dans de l'eau bouillante, puis refroidis sur de la glace pour arrêter le processus de chauffage. Cela a été fait pour trois répétitions indépendantes.

4.3.Mesures photométriques

Antioxydants(purs ou mélangés) en l'absence et en présence de fer ont été mesurés pour leur activité réductrice totale et leur activité antioxydante dans trois réplicats techniques indépendants en utilisant une méthode à haut débit dans des plaques 96-puits (SynergyTM HTX Multi-Mode Microplate Reader, BioTek Instruments, Winooski, VT, États-Unis). Différents essais de test ont été utilisés, en raison des différents mécanismes de réaction : transfert d'électron unique (SET) et transfert d'atome d'hydrogène (HAT). Alors que le test TEAC et TPC est basé sur SET [17,18], pour le test de test DPPH, la littérature n'est pas tout à fait claire s'il est basé sur SET, HAT, ou même une combinaison de ces deux mécanismes [{{6} }]. Une étude récente de Foti [51] a découvert que les phénols peuvent réagir avec le DPPH via le transfert séquentiel d'électrons par perte de protons (SPLET), une combinaison des deux mécanismes. Des facteurs, tels que la polarité moyenne et le potentiel d'ionisation, influencent le mécanisme prédominant.

4.3.1. Contenu phénolique total (TPC)

La teneur totale en phénol (TPC) a été déterminée à l'aide de la méthode Folin-Ciocalteu dans une plaque à puits 96-, décrite précédemment par Bobo-Garcia et al.[52] avec quelques modifications.

Briefly, 10 μL Folin-Ciocalteu reagents were mixed with a 50 μL sample, and afterward 100 μL Na, CO3 was added. The 96-well plate was incubated at 37 °C（±0.2°C） and with constant orbital shaking at a moderate speed (237 CPM, 4 mm) for 14 min. After a 1 min resting period, the absorbance was measured at 736 nm. Results were expressed as gallic acid equivalents (mg GAE/ mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 5.97 to 59.7 ug gallic acid/mL(R~>0.99). Le nom commun de ce test est trompeur car le réactif de Folin-Ciocalteu réagit également sur les non-phénoliques, comme les vitamines et les minéraux [22]. Il décrit mieux "l'activité réductrice totale" des composés bioactifs.

4.3.2. Capacité antioxydante équivalente Trolox (TEAC)

L'activité antioxydante a été déterminée à l'aide du test TEAC dans une plaque à puits 96- avec quelques modifications. Une solution mère avec 9,6 mg d'ABTS et 1,66 mg de persulfate de potassium remplie de H2O à 25 mL a été préparée et incubée dans l'obscurité à température ambiante pendant 12-16 h. A partir de cette solution mère, une solution de travail TEAC, contenant une solution mère de 5 ml remplie jusqu'à 25 ml avec 100 % de MeOH, a été préparée.

Briefly, 10 μL of the sample was mixed with 150 μL of the TEAC working solution. After a 5 min incubation, the plate was shaken orbitally at a moderate speed for 1 min, followed by a 1 min resting period. The absorbance was measured at a wavelength of 734 nm. The TEAC was expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R->0.98).

4.3.3. DPPH*Élimination des radicaux

Laantioxydantactivity was determined using the modified DPPHmethod for 96-well plates. A DPPHworking solution with 7.88 mg DPPH filled up to 100 mL was prepared. Briefly, 20 μL of the sample was mixed with 180 ul of the DPPH working solution and incubated in the dark for 28 min at room temperature. After 1 min orbital shaking at a moderate speed and a 1 min resting time, the absorbance was measured at a wavelength of 515 nm. Results were expressed as Trolox equivalents (mol TE/mol Antioxidant), using a standard curve ranging from 0.025-0.8 mM Trolox(R2>0.98).

4.4. Synergisme et antagonisme

Pour l'analyse des effets synergiques et antagonistes de l'activité antioxydante, une comparaison des résultats obtenus expérimentalement avec les valeurs théoriques calculées par la somme des effets des composants individuels à la concentration correspondante a été faite [53]. La synergie décrit une interaction de deux substances ou plus de sorte que l'action combinée est supérieure à la somme de chacune agissant séparément. Contrairement à cela, l'antagonisme est un phénomène où l'interaction de deux substances ou plus en combinaison a un effet global inférieur à la somme de leurs effets individuels.

4.5.Détermination du fer ionique

The colorimetric determination of ferrous and ferric iron was modified according to Niedzielski et al. 【54】 for 96-well plates. Briefly, for ferrous iron detection, 20 μL acetate buffer(90 g sodium acetate trihydrate and 48 g acetic acid glacial filled up to 200 mL)and 20 μL 2,2'dipyridyl （0.5%, m/m） and, for ferric iron detection, 20 μL hydrochloric acid （2 M） and 20 μL potassium thiocyanate （5%, m/m）were pipetted into a 200 μL sample in the 96-well plate, incubated there for 10 min at room temperature, and the absorbance was measured for ferrous iron at520nm and for ferric iron at 470nm. Results were expressed in mM ionic iron/mM total iron, using a standard curve ranging for ferrous iron from 0.024-0.214mM(R'>0.99) and for ferric iron from0.005-0.178 mM(R->0.99). La différence entre le fer total et le fer ionique, la somme du fer ferreux et ferrique, est le fer lié.

4.6.HPLC-DAD

Pour quantifier les antioxydants acide ascorbique, 5-acide caféoylquinique et quercétine-3-rutinoside et leurs produits de dégradation dans les mêmes extraits utilisés pour la photométrie

measurements, a Shimadzu Prominence 20 high-performance liquid chromatography (HPLC) system equipped with a refrigerated SIL-20AC HT autosampler, CTO-10AS VP column oven, DGU-20A5 degasser, LC-20 AT liquid chromatograph quaternary pump, and an SPD-M20A diode array detector (DAD) was used. As a column for separation, a Supelco Ascentis⑧Express an F5 column (150× 3.0 mm, 5 um)equipped with a Supelco Guard column （5×3.0 mm, 5 μm） and a 0.2 micron SST Frit for UltraLite was used. The column temperature was set to 30°C. UV detection was at 245 nm for ascorbic acid, 320 nm for 5-caffeoylquinic, and 360 nm for quercetin-3-rutinoside. The mobile phase consisted of Eluent A (1% acetic acid (v/o), pH 2.5) and Eluent B(100% ACN). The separation was achieved using the following gradient program: 0-2.5 min.5% B:2.5-15 min.5-20%B:15-20 min,20%B;20-22.5 min, 20-5%B;22.5-30 min,5%B.The flow rate was 0.3 mL/min, and the sample injection volume was 30 μL. Standard calibration curves for the three substances 5-caffeoylquinic （0.5-0.15 μM; R2>0.99）, ascorbic acid （0.35-0.025 uM; R2>0.99）, and quercetin-3-rutinoside（0.35-0.025 μM; R2>0.99） ont été préparés. Les composés dérivés ont été provisoirement identifiés en analysant les étalons purs en présence et en l'absence de traitement pré- et post-thermique du fer. Par conséquent, le nouveau pic doit provenir de l'étalon de l'insert. De plus, des mélanges sélectionnés ont été mesurés par HPLC-MS pour vérifier la structure proposée.

4.7. Analyses statistiques

Microsoft Excel 2016 (Microsoft, Redmond, États-Unis) et R Statistics (version 3.6.3, Hold-ing the Windsock, 2020) ont été utilisés pour les tests biostatistiques et pour présenter et dessiner les résultats des données. Des statistiques inférentielles pour évaluer et relier les traitements ont été réalisées en utilisant une analyse de variance à trois voies (ANOVA), un test HSD de Tukey post hoc et une corrélation de Pearson. Les packages R utilisés étaient ggplot2 [55], mean [56] et multcomp [57].

5. Conclusions

Sur la base des résultats décrits ci-dessus, l'AOA de l'acide ascorbique, de l'5-acide caféoylquinique et de la quercétine-3-rutinoside a été influencé par leur structure moléculaire, leur concentration, leur rapport et leurs interactions avec d'autres antioxydants et le fer. L'interaction semble particulièrement jouer un rôle dans l'AOA lors de la combinaison de l'acide ascorbique et de l'acide 5-caféoylquinique. Ici, des effets synergiques et antagonistes ont été détectés. La température a eu une influence minime sur l'AOA, alors qu'en même temps la température a influencé la stabilité de tous les antioxydants dans certains mélanges, en particulier en présence de fer. Seule la concentration en acide ascorbique a diminué en l'absence de fer avec un temps de cuisson prolongé et la concentration en acide 5-caféoylquinique a diminué uniquement en présence de fer, tandis que la concentration en quercétine-3-rutinoside a diminué uniquement en combinaison avec l'acide ascorbique dans le présence de fer. En combinaison avec le fer, l'acide 5-caféoylquinique a pu empêcher d'autres molécules d'être réduites dans leur concentration par le traitement thermique.

Chez les plantes, les combinaisons d'acide ascorbique, d'5-acide caféoylquinique et de quercétine-3-rutinoside sont non seulement possibles, mais courantes. Par conséquent, ces résultats donnent des connaissances de base sur les processus qui se produisent lors de la cuisson des légumes. Les matrices alimentaires sont plus complexes et contiennent d'innombrables composés bioactifs, y compris des enzymes, d'autres minéraux ou des acides, qui modifient les conditions de réaction ou sont eux-mêmes des réactifs. Ces interactions complexes vont bien au-delà de la portée de cette étude et les concentrations et interactions bénéfiques deantioxydantsdans les légumes cuits doivent être traitées à l'avenir.

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