Glycosides Phényléthanoïdes De Cistanche Deserticola: Mécanisme De L'effet Neuroprotecteur

Maiquan Li, et al

Résumé:Le facteur 2 lié au facteur nucléaire érythroïde 2- (Nrf2) est un facteur de transcription clé contre le stress oxydatif et les troubles neurodégénératifs.Glycosides phényléthanoïdes(PhG; salidroside,actéoside, isoacteoside etéchinacoside) présentent des propriétés antioxydantes etneuroprotecteurbioactivités. Cette étude a été réalisée pour étudier laneuroprotecteureffet et mécanisme moléculaire dePhG. PhGle prétraitement a supprimé de manière significative la cytotoxicité induite par H2O2- dans les cellules PC12 en déclenchant la translocation nucléaire de Nrf2 et en inversant l'expression protéique régulée à la baisse de l'hème oxygénase 1 (HO-1), NAD(P)H quinone oxydoréductase 1 (NQO1 ), la sous-unité catalytique de la glutamate-cystéine ligase (GCLC) et la sous-unité modificatrice de la glutamate-cystéine ligase (GCLM). Nrf2 siRNA ou HO -1 inhibiteur de protoporphyrine de zinc (ZnPP) a réduit laneuroprotecteureffet. Les PhG ont montré une interaction potentielle avec le site de liaison Nrf2 dans la protéine 1 d'association ECH de type Kelch (Keap1). Ce résultat peut soutenir l'hypothèse que les PhG sont des activateurs de Nrf2. Nous avons démontré la liaison potentielle entre les PhG et la voie Nrf2/ARE activée par Keapl, et que les PhG avec plus de glycosides avaient des effets accrus.

Mots clés:Keap1 ; Nrf2 ;Neuroprotecteur; cellules PC12 ;PhG(NQO1), entre autres [5-7]. Ce processus représente une étape clé dans la protection des cellules contre le stress oxydatif et apparaît comme une cible thérapeutique prometteuse pour la neuroprotection [8]. Gaia a rapporté que Nrf2 atténue la neurodégénérescence induite par la LRRK2- et l'a-synucléine en favorisant puissamment l'homéostasie des protéines neuronales de manière autonome et dépendante du temps [9].

Glycosides phényléthanoïdes (PhG) sont caractérisés par des fragments acide cinnamique et hydroxyle phényléthyle attachés à l'ap-glucopyranose par des liaisons ester et glycosidique, respectivement. Ces molécules font partie d'un groupe de produits naturels hydrosolubles largement répandus dans le règne végétal [10]. Des études in vitro et in vivo ont montré que ces composés possèdent des propriétés antioxydantes [11],neuroprotecteur[12], antibactérien,

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1. Introduction

Le stress oxydatif, qui est un déséquilibre de l'homéostasie antioxydante, induit une peroxydation des lipides, des lésions des protéines et de l'ADN, le vieillissement cellulaire et la mort cellulaire. Ce processus contribue probablement à plusieurs troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP) et l'ischémie/reperfusion [1]. Le peroxyde d'hydrogène (H2O2), qui est l'une des principales espèces réactives de l'oxygène (ROS), est connu pour provoquer une peroxydation des lipides et des dommages à l'ADN [2]. De plus, H2O2 est une source endogène de radicaux libres hydroxyle qui contribue au niveau de fond du stress oxydatif cellulaire [3,4]. Par conséquent, les stratégies thérapeutiques pour prévenir l'apoptose induite par le stress oxydatif peuvent avoir un potentiel dans le traitement des maladies neurodégénératives.

Le facteur 2 lié au facteur nucléaire érythroïde 2- (Nrf2) est un facteur de transcription fortement associé au stress oxydatif. L'activation de Nrf2 induit la transcription de nombreux gènes antioxydants et de détoxification, notamment l'hème oxygénase-1 (HO-1), la NAD(P)H quinone oxydoréductase 1

bioactivités anti-inflammatoires [13] et immunomodulatrices [14]. Osmanthusfragrans est un ingrédient commun dans plusieurs aliments asiatiques et est consommé depuis longtemps. Nous avons précédemment montré que les extraits de fleurs d'O.fragrans amélioraient l'apprentissage spatial et la mémoire, inhibaient les dommages oxydatifs et présentaient des activités neuroprotectrices dans le vieillissement induit par le d-galactose dans un modèle de souris ICR [15]. Le salidroside, l'actéoside et l'isoactéoside sont les principales réponses des PhG aux activités antioxydantes des extraits de fleurs d'O.fragrans [16].

Des études sur l'effet neuroprotecteur des PhG ont obtenu des résultats souhaitables. Le salidroside a significativement réduit l'apoptose cellulaire des cellules PC12 qui ont été exposées dans le MPP plus [17,18]. L'actéoside a également atténué l'apoptose et le stress oxydatif induits par le MPP plus dans les cellules PC12 [19] et les lésions cellulaires SH-SY5Y induites par A p 25-35- [20].Échinacosidea été étudiée sur l'apoptose induite par le facteur de nécrose tumorale-a (TNFa) dans les cellules SH-SY5Y [21], la toxicité dopaminergique induite par le MPTP chez la souris [22], les cultures primaires de cellules corticales de rat lésées par le glutamate [23] et {{ 9}} Dommages induits par l'OHDA dans les cellules PC12 [24]. Les résultats ont indiqué que les PhG présentaient un effet cytoprotecteur et sont des agents potentiels pour traiter les maladies neurodégénératives. Des études ont montré que les propriétés antioxydantes des PhG sous-tendent de nombreuses autres bioactivités pour ces composés [25]. Cependant, peu d'études ont étudié le mécanisme moléculaire des PhG contre la toxicité oxydative.

Dans notre étude, nous avons sélectionné quatre PhG typiques comme suit : salidroside (monosaccharides phényléthanoïdes), actéoside (disaccharides phényléthanoïdes), isoacteoside (disaccharides phényléthanoïdes) etéchinacoside(trisaccharides phényléthanoïdes). Nous avons utilisé un modèle de mort neuronale utilisant des cellules PC12 différenciées [26] pour étudier l'effet protecteur et le mécanisme moléculaire des PhG sur le modèle cellulaire PC12 induit par H2O2-. Nous avons démontré que les PhG activaient la voie Nrf2/ARE en se liant à la protéine 1 associée à l'ECH de type Kelch (Keap1). Ce processus a régulé positivement les enzymes antioxydantes et augmenté la résistance des cellules PC12 au stress oxydatif.

2. Résultats

2.1. PhGs Suppressed H2O2-Cytotoxicité induite dans les cellules PC12

Les effets cytotoxiques du H2O2 et des PhG (0.1,1,5 et 10 卩g/mL) sur les cellules PC12 ont été testés. Les résultats ont montré que H2O2 induisait une perte de viabilité des cellules PC12 de manière dépendante de la concentration et dépendante du temps (figure 1A). L'exposition des cellules PC12 à 200 H2O2 pendant 2 h a entraîné une viabilité cellulaire de 57,4 %. Le prétraitement des cellules avec des PhG à 0,1, 1, 5 et 10 -/mL n'a eu aucun effet sur la viabilité cellulaire (Figure 1B) et a nettement protégé les cellules PC12 des dommages induits par H2O 2- en améliorant la viabilité cellulaire comme 9.549-22.141 %, 12.092-25.289 %, 1.470-9.289 % et 3.411-11.441 %, respectivement (Figure 1C) . Cependant, le salidroside (0,1 ^g/mL), l'isoacteoside (0,1, 1, 5 et 10 ^g/mL),échinacoside(0.1,1 et 5 ^g/mL) le prétraitement n'a montré aucune différence significative sur les lésions cellulaires induites par HzOz. Le prétraitement des cellules avec des PhG a également amélioré la caractéristique morphologique induite par H2O2 (figure 1D).

Figure 1. Les PhG ont supprimé la cytotoxicité induite par H2O2- dans les cellules PC12. La viabilité cellulaire a été détectée par le test MTT. Effet cytotoxique de H2O2 (A) et PhGs (B) à différentes concentrations sur les cellules PC12. (C) Les PhG ont atténué la diminution induite par H2O2- de la viabilité cellulaire. Les cellules PC12 ont été incubées avec des PhG ({{10}.1 et 10 wg/mL) pendant 24 h, puis incubées avec 200 pM de H2O2 pendant une autre 2 h après le retrait des PhG. (D) Observation morphologique. Les cellules après traitement ont été observées au microscope à contraste de phase (x100), CK : groupe normal, H2O2 : groupe traité H2O2, HL : groupe traité à faible dose de salidroside, HH : groupe traité à forte dose de salidroside, ML : groupe traité à faible dose d'actéoside, MH : groupe traité à forte dose d'actéoside, IL : groupe traité à faible dose d'isoactéoside, IH : groupe traité à forte dose d'isoactéoside, SL : groupe traité à faible dose d'échinacoside, SH : groupe traité à forte dose d'échinacoside. ** p < 0,01="" versus="" groupe="" non="" traité ;="" #="" p="">< 0,05,="" par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" avec="" h2o2 ;="" ##="" p="">< 0,01,="" par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" par="">

2.2. Les PhG ont supprimé l'H2O2-l'accumulation intracellulaire induite de ROS, la peroxydation lipidique (MDA) et l'augmentation des activités de la superoxyde dismutase (SOD) dans les cellules PC12

L'exposition des cellules PC12 à 200 pM H2O2 pendant 2 h a augmenté les niveaux de ROS, la teneur en MDA et a diminué l'activité de SOD (Figure 2). Le prétraitement aux PhG a atténué le niveau de ROS, le salidroside et l'actéoside, et la forte dose de prétraitement à l'isoacteoside et à l'échinacoside a significativement atténué le niveau de ROS (p < 0,01).="" le="" prétraitement="" au="" salidroside="" n'a="" montré="" aucun="" effet="" sur="" la="" teneur="" en="" mda,="">actéosidele prétraitement a significativement atténué la teneur en MDA (p < 0.05).="" le="" prétraitement="" à="" l'isoacteoside="" et="" à="" l'échinacoside="" a="" considérablement="" atténué="" la="" teneur="" en="" mda="" à="" une="" plus="">

Figure 2. Les PhG ont bloqué l'accumulation de ROS et de MDA et ont augmenté les activités de SOD dans les cellules PC12. Les cellules PC12 ont été incubées avec des PhG (0.1 et 10 4g/mL) pendant 24 h, puis incubées avec 200 |^M H2O2 pendant une autre 2 h après le retrait des PhG. (A) Les PhG ont bloqué l'accumulation de ROS et de MDA. (B) Les PhG ont bloqué l'accumulation de MDA. (C) Les PhG ont augmenté les activités de la SOD. CK : groupe normal, Modèle : groupe traité avec H2O2, Salidroside : groupe traité avec salidroside, Acteoside : groupe traité avec actéoside, Isoacteoside : groupe traité avec isoacteoside, Echinacoside : groupe traité avec échinacoside. ** p < 0.01="" versus="" groupe="" non="" traité ;="" #="" p="">< 0,05,="" par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" par="" h2o2,="" ##="" p="">< 0,01,="" par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" par="">

2.3.PhGs a inversé l'apoptose induite par H2O2- dans les cellules PC12

Le traitement à l'H2O2 (200 |1M) pendant 2 h a augmenté de manière significative l'apoptose dans les cellules PC12, avec un taux d'apoptose total pouvant atteindre 16,02 % (Figure 3). Cependant, un prétraitement avec des PhG (0,1 et 10 µg/mL) pendant 24 h a diminué le taux d'apoptose de manière concentration-dépendante (p < 0,01).="">actéoside, isoacteoside etéchinacosidea nettement diminué le pourcentage d'apoptose cellulaire de 4,750-6,627 %, 4,413-5,800 %, 6,593-10,047 % et 1,530-7. 510 pour cent, respectivement.

Figure 3. Les PhG ont inversé l'apoptose induite par H2O2- dans les cellules PC12. Les cellules PC12 ont été incubées avec des PhG (0.1 et 10 卩g/mL) pendant 24 h, puis incubées avec 200 pM de H2O2 pendant encore 2 h après le retrait des PhG. Ensuite, l'apoptose a été mesurée par une cytométrie en flux à l'aide d'une sonde fluorescente PI/FITC.

CK : groupe normal, Modèle : groupe traité H2O2, Salidroside : groupe traité par salidroside, Acteoside : groupe traité par actéoside, Isoacteoside : groupe traité par isoacteoside,Échinacoside: échinacosidegroupe traité. ** p < {{0}}.01="" versus="" groupe="" non="" traité ;="" ##="" p="">< 0,01,="" par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" par="">

2.4. Les PhG soulagent H2O2-la dérégulation induite des voies Nrf2-ARE dans les cellules PC12

La voie Nrf{{0}}ARE, en tant que l'une des principales voies antioxydantes dans la plupart des types de cellules, est importante dans la régulation de la croissance et de la mort cellulaires. Par conséquent, nous avons recherché si la voie Nrf2-ARE est impliquée dans l'apoptose induite par H2O2-par immunofluorescence et analyse Western blot à l'aide d'anticorps spécifiques. Le test d'immunofluorescence a montré que les PhG (0,1 et 10 pg/mL) induisaient la translocation nucléaire de Nrf2 (Figure 4). Après traitement des PhGs, isoacteoside, etéchinacosidea entraîné la récupération partielle de la morphologie normale de la cellule. Les résultats des analyses de Western blot et de densité grise ont montré que les PhG ({{0}}.1 et 10 pg/mL) n'avaient aucune influence significative sur l'expression de Nrf2 dans le cytoplasme (figure 5A, B) (p > {{20}}.05) mais expression Nrf2 régulée positivement dans le noyau (Figure 5C,D) (p < 0,01).="" ensuite,="" nous="" avons="" étudié="" le="" rôle="" de="" nrf2="" dans="" l'apoptose="" induite="" par="" h2o2-="" en="" important="" le="" sirna="" nrf2.="" l'expression="" de="" la="" protéine="" et="" de="" l'arnm="" de="" nrf2="" a="" été="" significativement="" régulée="" à="" la="" baisse="" dans="" tous="" les="" groupes="" traités="" par="" sirna="" nrf2="" (figure="" 5e-h).="" les="" phg="" (0,1="" et="" 10 pg/ml)="" ont="" empêché="" la="" cytotoxicité="" induite="" par="" h2o2-dans="" les="" groupes="" sans="" traitement="" par="" sirna="" nrf2="" (p="">< 0,01), mais="" cette="" protection="" a="" été="" inversée="" par="" le="" sirna="" nrf2.="" après="" le="" traitement="" par="" sirna="" nrf2,="" la="" viabilité="" cellulaire="" a="" diminué="" de="" manière="" significative="" même="" avec="" un="" traitement="" phgs="" (figure="">

Figure 5. Effet protecteur des PhG sur Nrf2 dans les cellules PC12 traitées à l'H2O2-. (A) L'expression de la protéine Nrf2 dans le cytoplasme a été détectée par immunotransfert à l'aide d'un anticorps spécifique. La p-actine a été utilisée comme contrôle de charge. (B) L'analyse densitométrique quantitative de la protéine Nrf2 dans le cytoplasme. (C) L'expression de la protéine Nrf2 dans le noyau a été détectée par immunotransfert à l'aide d'un anticorps spécifique. Les histones H3 ont été utilisées comme témoin de chargement. (D) L'analyse densitométrique quantitative de la protéine Nrf2 dans le noyau. (E, F) Les cellules PC12 ont été préincubées sans (E) ou avec (F) siARN Nrf2 pendant 24 h, puis incubées avec ou sans PhG (0.1, et 10 昭/mL) pendant 24 h et incubé avec H2O2 pendant 2 h supplémentaires après le retrait des PhG. L'expression totale de la protéine Nrf2 a été détectée par immunotransfert à l'aide d'un anticorps spécifique, et la p-actine a été utilisée comme contrôle de charge. (G) L'analyse densitométrique quantitative de la protéine Nrf2 totale. (H) L'analyse quantitative de l'ARNm Nrf2. (I) Les cellules PC12 ont été préincubées avec ou sans siRNA pendant 24 h, puis incubées avec ou sans PhG (0,1 et 10 -/mL) pendant 24 h, et incubées avec H2O2 pendant encore 2 h après le retrait des PhG. Après traitement, les cellules survivantes ont été déterminées par dosage MTT. CK : groupe normal, Modèle : groupe traité par H2O2, Contrôle Si : groupe traité par siRNA contrôle, SiRNA négatif : groupe traité par siRNA, SiRNA positif : groupe traité par siRNA, Salidroside : groupe traité par salidroside, Acteoside : groupe traité par actéoside, Isoacteoside : traité par isoacteoside groupe,Échinacoside: groupe traité par l'échinacoside. ** p < {{0}}.01="" versus="" groupe="" non="" traité ;="" #="" p=""><0.05, par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" par="" h2o2="" (sans="" sirna="" nrf2="" traité),="" ##="" p="">< 0,01,="" par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" par="" h2o2="" (sans="" sirna="" nrf2="" traité) ;="" &="" p="">< 0,05="" par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" par="" h2o2="" (avec="" traitement="" de="" siarn="" nrf2)="" et="" p="">< 0,01="" par="" rapport="" au="" groupe="" traité="" par="" h2o2="" (avec="" traitement="" de="" siarn="">

2.4. Les PhG ont inversé la régulation négative induite par H2O2- de l'expression protéique de HO-1, NQO1, GCLC et GCLM

HO{{0}}, NQO1 et la glutamate-cystéine ligase (GCL) sont des enzymes antioxydantes cellulaires importantes, et HO-1, NQO1 et les sous-unités catalytiques ou modifiées de GCL (GCLC ou GCLM) sont Nrf2-gènes en aval régulés [27]. L'expression protéique de HO-1, NQO1, GCLC et GCLM a été observée après le traitement. Une différence évidente a été trouvée entre l'expression protéique de HO-1 et NQO1 avec ou sans H2O2 (Figure 6A-C) (p <0.01). les="" phg="" (0.1="" et="" 10="" p^g/ml)="" ont="" inversé="" la="" régulation="" à="" la="" baisse="" induite="" par="" h2o2-="" de="" l'expression="" protéique="" de="" ho-1="" (sauf="" le="" salidroside="" à="" {{32}="" }.1 pg/ml),="" nqo1="" (sauf="" actéoside="" à="" 0.1 pg/ml)="" (p="">< 0,01). h2o2="" a="" également="" régulé="" à="" la="" baisse="" l'expression="" des="" protéines="" gclc="" et="" gclm="" (p=""><0,05) (figure="" 6a,="" d,="" e).="" les="" phg="" (0,1="" et="" 10 pg/ml)="" ont="" inversé="" la="" régulation="" à="" la="" baisse="" induite="" par="" h2o2-="" de="" l'expression="" protéique="" du="" gclc="">échinacosideà {{0}}.1 pg/mL) (p < 0.01)="" et="" gclm="" (sauf="" salidroside="" à="" 0.1 pg/ml)="" (="" p="">< 0.01).="" ensuite,="" les="" inhibiteurs="" chimiques="" de="" ho-1="" ont="" été="" utilisés="" pour="" évaluer="" plus="" en="" détail="" les="" rôles="" des="" enzymes="" antioxydantes="" dans="" la="" régulation="" de="" la="" protection="" des="" phg="" contre="" la="" cytotoxicité="" induite="" par="" h2o2-.="" les="" phg="" (0,1="" et="" 10 pg/ml)="" ont="" empêché="" la="" cytotoxicité="" induite="" par="" h2o2-,="" mais="" cet="" effet="" protecteur="" a="" été="" inversé="" par="" l'inhibiteur="" de="" ho-1="" znpp=""><0,01) à="" 20 h="" (figure="" 6f,="" p=""><0,01)>

2.5. Expression Keap1 et analyse d'amarrage moléculaire

Dans des conditions physiologiques, Keap1 agit comme une protéine répressive de Nrf2 en se liant au domaine Neh2 de Nrf2 et en ciblant Nrf2 vers une ligase d'ubiquitine E3 à base de Cul3- pour l'ubiquitination et la dégradation ultérieure par le protéasome 26S [28]. La capacité de liaison à Keap1 des PhG a été évaluée par analyse d'amarrage moléculaire pour étudier le mécanisme sous leur effet antioxydant.

3. Débat

Nous avons étudié la neuroprotection des PhG sur la cytotoxicité induite par H2O2 dans les cellules PC12. Les résultats montrent que le prétraitement aux PhGs supprime de manière significative la cytotoxicité induite par HzOz, atténue le niveau de ROS intracellulaire, améliore le niveau d'enzymes antioxydantes intracellulaires et finalement inverse la cytotoxicité induite par H2O2- dans les cellules PC12. De plus, les PhG ont augmenté l'activation transcriptionnelle de Nrf2, inversé la régulation à la baisse induite par HzOz de l'expression protéique de HO-1, NQO1, GCLC et GCLM. De plus, les PhG ont montré une interaction potentielle avec le site de liaison Nrf2 dans la protéine Keap1.

Dans la lésion cellulaire PC12 induite par H2O2-, la peroxydation lipidique, qui fait référence à la dégradation oxydative des lipides, a augmenté la perméabilité des membranes, entraînant des dommages cellulaires [29]. La formation de MDA est largement utilisée comme indice de peroxydation lipidique [30]. H2O2 a amélioré la production de ROS et épuisé les enzymes de défense antioxydantes, telles que la SOD, la catalase et la GPx. Ce processus conduit au stress oxydatif [31], qui joue un rôle clé dans la causalité et la progression de la majorité des maladies neurodégénératives. Conformément aux études précédentes, nous avons observé une augmentation du niveau de ROS, une réduction des enzymes antioxydantes intracellulaires et une apoptose accrue des cellules PC12 après un traitement au H2O2. Le prétraitement aux PhG a considérablement atténué l'augmentation induite par HzOz des ROS intracellulaires, amélioré les enzymes antioxydantes intracellulaires et finalement inversé la cytotoxicité induite par HzOz dans les cellules PC12.

Kuang et al. [32] rapportent queéchinacosideont montré un effet neuroprotecteur significatif sur la cytotoxicité induite par H2O2- dans les cellules PC12 par la voie apoptotique mitochondriale. Dans cette étude, nous avons découvert que l'échinacoside, le salidroside, l'actéoside et l'isoactéoside présentaient des effets neuroprotecteurs en améliorant l'activité antioxydante des cellules PC12, car ils augmentaient l'activation transcriptionnelle de Nrf2 et régulaient à la hausse l'expression protéique en aval de HO-1, NQO1, GCLC et GCLM. De nombreuses études ont clairement démontré que l'activation des gènes cibles de Nrf2, en particulier HO-1, dans les astrocytes et les neurones protège fortement contre l'inflammation, les dommages oxydatifs et la mort cellulaire. Le système HO-1 a été rapporté comme étant très actif dans le système nerveux central, et sa modulation joue apparemment un rôle crucial dans la pathogenèse des maladies neurodégénératives [33]. Des études récentes ont également clarifié le rôle de Nrf2 dans la progression et le risque de MP [9] et Keap1 comme cible efficace pour la réactivation de Nrf2 dans la MA [34]. Les résultats appuient de nouvelles preuves de Nrf2 en tant que cible thérapeutique dans les maladies neurodégénératives.

L'analyse d'amarrage moléculaire a montré que les PhG pouvaient se lier à Keap1, avec les capacités de liaison suivantes :échinacoside>isoacteoside > actéoside > salidroside. Conformément à ces résultats, le prétraitement des PhG a conduit à la translocation nucléaire Nrf2, avec l'expression Nrf2 suivante dans le noyau :échinacoside>isoacteoside * actéoside > salidroside. Nous avons supposé que le nombre de glycosides affectait le mode de liaison possible des PhG et de Keap1, et que le mode de liaison provoquait en outre la libération de Nrf2 à partir de Keap1. Ce processus a entraîné l'activation de Nrf2 et des gènes en aval et protège finalement les cellules PC12 du stress oxydatif induit par H2O2 -.

4. Matériels et méthodes

4.1. Composés chimiques et réactifs

Salidroside (n° CAS 10338-51-9), actéoside (n° CAS 61276-17-3), isoactéoside (n° CAS 61303-13-7) etéchinacoside(N° CAS {{0}}) ont été achetés auprès de YYuanye Biotechnology Company (Shanghai, Chine). Les PhG ont été dissous dans du PBS pour produire une solution mère de 10 mg/mL, qui a été stockée à -20 degré . H2O2 a été acheté chez Aladdin® (Shanghai, Chine). Le milieu RPMI -1640 et le sérum de veau fœtal ont été achetés chez Hyclone (Logan, UT, États-Unis), et 0, 5% de trypsine EDTA, de pénicilline et de streptomycine ont été achetés chez Keyi (Hangzhou, Chine). Les kits de diagnostic MDA, SOD, MTT et DCFH-DA ont été achetés auprès de l'Institut de biotechnologie de Beyotime (Nanjing, Jiangsu, Chine). Le kit de double coloration Annexin V-FITC/PI a été acheté auprès de Solarbio Life Sciences (Beijing, Chine). Les anticorps anti-Nrf2, Histone H3, Keap1, HO-1, NQO1, GCLC, GCLM et p-actine, IgG anti-souris-peroxyde de raifort (HRP) et anti-lapin-HRP-IgG ont été achetés auprès d'Abcam (Londres, Royaume-Uni). Les inhibiteurs de HO -1 et ZnPP ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). RNAiso Plus, le kit de réactifs PrimeScript ™ RT avec gDNA Eraser et SYBR® Premix Ex Taq ™ II ont été achetés auprès de Takara (Shiga, Japon). Le réactif de transfection Lipofectamine® RNAiMAX a été acheté auprès de Thermo Fisher Scientific (Waltham, Royaume-Uni). Les séquences d'ARNsi Nrf2 étaient les suivantes : vers l'avant, CCGAAUUACAGUGUCUUAA ; et inverser, UUAAGACUGUAAUUCGG. Pendant ce temps, les séquences d'ARNsi de contrôle étaient les suivantes : vers l'avant, UUCUCCGAACGUGUCACGU ; et inverser, ACGUGACACGUUCGGAGAA.

4.2. Culture de cellules

La lignée de phéochromocytome surrénalien de souris (cellules PC12) a été obtenue auprès de l'Institut de biochimie et de biologie cellulaire, SIBS, (CAS, Shanghai, Chine). Les cellules ont été maintenues dans du RPMI-1640 (Hyclone) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (Hyclone), 100 U/mL de pénicilline et 0,1 mg/mL de streptomycine à 37 degrés avec 5 % de CO2. Le médium a été changé tous les deux jours.

4.3. Test de viabilité cellulaire

Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des plaques 96-puits à 2 x 104 cellules/puits. Après fixation, les cellules ont été préincubées avec ou sans inhibiteur pendant 20 min, incubées avec ou sans PhG pendant 24 h, puis incubées avec H2O2 pendant 2 h supplémentaires après le retrait des PhG. Après incubation, les cellules ont été traitées avec 5 mg/mL de MTT pendant 4 h à 37 degrés et le milieu a été soigneusement retiré. Les cristaux de formazan formés par les cellules survivantes ont été dissous dans 150 rL de DMSO pour générer une couleur bleue [35], et l'absorbance a été mesurée à 570 nm sur un lecteur de plaques. Les témoins ont utilisé la même concentration de milieu avec du DMSO seul. La viabilité cellulaire a été normalisée en pourcentage de contrôle.

Les concentrations de PhG (0.1,1,5 et 10 Rg/mL) ont été choisies en fonction de l'analyse de cytotoxicité des PhG et de l'effet cytoprotecteur rapporté de l'échinacoside [32]. Selon le rapport, aucun effet de cytotoxicité n'a été observé en dessous de 10 Rg/mL, et l'échinacoside a montré un effet cytoprotecteur dans le modèle cellulaire lésé par HzOz.

4.4. Test d'apoptose

L'apoptose a été détectée avec un kit de double coloration Annexin V-FITC/PI (Solarbio). Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des plaques 6-puits à 2 x 105 cellules/puits. Après fixation, les cellules ont été traitées avec des PhG (0,1 et 10 Rg/mL) pendant 24 h et incubées avec H2O2 pendant encore 2 h après le retrait des PhG. Après incubation, les cellules ont été lavées dans du PBS froid, centrifugées deux fois à 1500 tr/min pendant 10 min et remises en suspension dans 500 rL de tampon de liaison. Annexine V marquée au FITC (5 rL) et iodure de propidium.

4.5. Mesure des ROS intracellulaires, de la production de MDA et de la SOD

Le niveau de ROS intracellulaire a été déterminé à l'aide d'une sonde fluorescente sensible aux ROS, à savoir le diacétate de 2,7-dichlorodihydrofluorescent (DCFH-DA). Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des plaques 6-puits à 2 x 105 cellules/puits. Après fixation, les cellules ont été traitées avec des PhG (0,1 et 10 µg/mL) pendant 24 h et incubées avec H2O2 pendant 2 h supplémentaires après le retrait des PhG. Après incubation, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS puis incubées avec 10 uM de DCFH-DA. Après incubation à 37 degrés pendant 20 min, les cellules ont été lavées avec du PBS et recueillies par centrifugation douce. Le ROS intracellulaire a été mesuré à l'aide d'un cytomètre en flux Gallios ™ (Beckman Coulter, Brea, CA, USA).

La MDA et la SOD ont été mesurées par des kits de dosage (Beyotime Biotechnology, Nanjing, Jiangsu, Chine). Toutes les procédures ont été entièrement conformes aux instructions des fabricants. Les teneurs en MDA et SOD ont été normalisées avec la teneur totale en protéines correspondante.

4.6. Immunofluorescence par translocation nucléaire Nrf2

Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des lames de verre 6-puits à une densité de 2 x 105 par puits. Après attachement, les cellules ont été traitées avec des PhG (0.1 et 10 卩g/mL) pendant 24 h et incubées avec H2O2 pendant encore 2 h après le retrait des PhG. Après incubation, les cellules ont été lavées dans du PBS froid et fixées dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à température ambiante, suivies d'une perméabilisation de la membrane à l'aide de 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min. Les cellules ont été incubées avec une IgG de lapin anti-Nrf2 (Abcam) avec 5% de FBS pendant une nuit à 4 degrés. Ensuite, les anticorps secondaires anti-lapin conjugués au FITC ont été appliqués sur les cellules pendant 20 min à température ambiante. Les noyaux ont été colorés avec du 4z,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) lors de la dernière étape de préparation. Les lames ont été rincées brièvement avec du PBS, séchées à l'air et montées dans un milieu anti-fluorescence en fading. Les lames ont été visualisées sous un microscope confocal laser (LMS780, Zeiss, Allemagne).

4.7. Extraction de protéines

Les cellules PC12 ont été ensemencées dans des boîtes de 100 mm à raison de 1 x 107 cellules/boîte. Après fixation, les cellules ont été traitées avec des PhG (0,1 et 10 µg/mL) pendant 24 h, puis incubées avec H2O2 pendant encore 2 h avec élimination des PhG. Après incubation, les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS froid et grattées des boîtes avec 1000 µl de PBS. Les homogénats cellulaires ont été centrifugés à 1500 tr/min pendant 10 min. Après traitement, les protéines cellulaires ont été extraites à l'aide d'un tampon de lyse cellulaire Beyotime RIPA avec 1 mM de PMSF selon les instructions du fabricant. De plus, les protéines cytoplasmiques et nucléaires ont été isolées comme décrit dans le kit d'extraction nucléaire et cytoplasmique Beyotime. La concentration en protéines des échantillons a été détectée par un kit de dosage des protéines Beyotime BCA, et tous les échantillons ont été stockés à -80 degré pour l'analyse Western blot.

4.8. Analyse Western Blot

L'analyse Western blot a été effectuée en utilisant des méthodes standard. Brièvement, des échantillons de protéines (20 ou 30 µg) ont été séparés par SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF. Les membranes ont été bloquées dans 5 % de lait-TBST et incubées pendant une nuit à 4 degrés dans l'anticorps primaire. Les anticorps utilisés comprenaient Nrf2 (Abcam), Keap1 (Abcam), HO-1 (Abcam), NQO-1 (Abcam), GCLC (Abcam), GCLM (Abcam), Histone H3 (Abcam) et p-actine (Abcam). Une IgG anti-souris conjuguée à la peroxydase (Abcam) ou une IgG anti-lapin (Abcam) a été utilisée comme anticorps secondaire. Les bandes de protéines ont été visualisées à l'aide de la série ChemiScope (Clinx Science Instruments, Shanghai, Chine). La valeur grise des bandes de protéines a été quantifiée à l'aide d'ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA).

4.9. PCR quantitative en temps réel

L'ARN total a été extrait à l'aide du RNAiso Plus (Takara, Shiga, Japon), en suivant les instructions du fabricant. Les échantillons d'ARN total ont été soumis à une transcription inverse avec le kit de réactifs PrimeScript™RT avec gDNA Eraser (Takara, Shiga, Japon) conformément aux instructions du fabricant. Une PCR quantitative en temps réel a été réalisée à l'aide de SYBR® Premix Ex Taq™ II (Takara, Shiga, Japon) dans le système de PCR en temps réel Applied Biosystems ViiA™ 7. L'expression relative des gènes cibles a été normalisée à la p-actine et analysée par la méthode 2-AACt. Les séquences d'amorce pour Nrf2 étaient les suivantes : avant, ACAGTGCTCCTATGCGTGAA et inverse, TCTGGGCGGCGACTTTAT. Les séquences d'amorces pour la p-actine étaient les suivantes : vers l'avant, GCTGTCCCTGTATGCCTCT ; et inverser, TTGATGTCACGCACGATTT.

4.10. Transfection d'ARNsi

Les cellules PC12 ont été cultivées dans des lames de verre 6-puits à une densité de 2 x 105 par puits (pour l'analyse Western blot) ou dans des lames de verre 96-puits à une densité de 2 x 104 par puits (pour l'analyse de cellules analyse de viabilité). Les siRNA témoins et les siRNA Nrf2 ont été transfectés dans des cellules à l'aide de Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) conformément aux instructions du fabricant. Après 24 h d'incubation, les cellules ont été traitées avec ou sans PhG et H2O2 pendant les durées indiquées, puis utilisées dans l'analyse Western blot, la qRT-PCR ou l'analyse de la viabilité cellulaire comme décrit ci-dessus.

4.11. Analyse d'amarrage moléculaire

Molecular docking analysis was performed to investigate the possible binding mode of PhGs to Keap1. The 3D structure of ligands was obtained from NCBI. The crystallized structure of Keap1 (PDB Code: 4L7B) was prepared using correcting structure issues (such as break bond and miss loop) using SYBYL-X 2.0. In this software simulation, crash represents the inadequate penetration between the protein and the ligand. Polar represents the hydrogen bonding and electrostatic interactions between the protein and the ligand. G-score [36] represents the hydrogen bonding, complex (ligand-protein), and internal (ligand-ligand) energies between the protein and the ligand. PMF-score [37] represents the Helmholtz free energy between the protein and the ligand. D-score [38] represents the charge and van der Waals interactions between the protein and the ligand. Chem-score [39] represents the hydrogen bonding, metal-ligand interaction, lipophilic contact, and rotational entropy, along with an intercept term between the protein and the ligand. C score represents the consensus score between the protein and the ligand, comprehensively reflecting the G, PMF, D, and Chem-scores. Tota-score reflects the binding capacity of the ligand to the protein. The best modes were generated and evaluated using the Total-score (>6) and C-score (>4).

4.12. Analyses statistiques

Les données ont été analysées à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle avec des analyses LSD à l'aide de SPSS. Tous les résultats ont été confirmés par trois expériences indépendantes. Les données ont été exprimées en tant que moyennes 土 SD. Des différences statistiquement significatives ont été considérées à p <>

Remerciements : Cette étude a été soutenue par le programme national majeur de R&D de Chine (n° 2017YFD0400200), la Fondation chinoise des sciences naturelles de la province du Zhejiang (n° R15C200002) et le projet spécial d'évaluation des risques liés à la sécurité des produits agricoles (n° 2017YFD0400200). GJFP2018015), Ministère de l'agriculture et des affaires rurales de Chine.

Les contributions de l'auteur:Baiyi Lu et Maiquan Li ont conçu l'étude. Maiquan Li a effectué le travail de laboratoire, l'analyse des données et a rédigé l'article. Maiquan Li, Tao Xu, Fei Zhou, Mengmeng Wang, Huaxin Song, Xing Xiao et Baiyi Lu ont révisé le manuscrit.

1 Laboratoire national d'ingénierie des technologies et équipements alimentaires intelligents,

Laboratoire clé pour la manipulation post-récolte des produits agricoles du Ministère de l'agriculture et des affaires rurales, Laboratoire clé pour l'évaluation nutritionnelle des produits agricoles du Ministère de l'agriculture et des affaires rurales, Laboratoire clé du Zhejiang pour la transformation agroalimentaire, Institut Fuli des sciences alimentaires, Collège des biosystèmes Ingénierie et sciences alimentaires, Université du Zhejiang, Hangzhou 310058, Chine ;

2 College of The First Clinical Medical, Université de médecine chinoise de Guangzhou,

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