Criblage phytochimique et activité œstrogénique des glycosides totaux de Cistanche Deserticola

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Résumé

Au fil des décennies, des efforts continus ont été déployés pour améliorer la qualité de la vie humaine. Le syndrome post-ménopausique est une grave préoccupation pour le bien-être de la santé des femmes. L'hormonothérapie est actuellement le pilier du traitement de cette affection. Cependant, cette thérapie pourrait entraîner un abus d'œstrogène, entraînant des réactions indésirables et des effets secondaires. En conséquence, la thérapie hormonale n'a pas réussi à améliorer le syndrome post-ménopausique.Cistanche désertiqueest une herbe tonique classique de la médecine traditionnelle chinoise. Il présente une activité œstrogénique importante. Les principaux composés actifs de cette plante sont les glycosides. Dans une expérience précédente, trois facteurs importants contribuant au rendement total de glycoside, au rendement d'actéoside et à l'activité oestrogénique ont été identifiés, à savoir la concentration d'éluant, le pH et le volume d'éluant. Dans cette expérience, un processus de purification optimal a été déterminé à l'aide d'une méthodologie de surface de conception-réponse composite centrale pour obtenir des glycosides à partir de cette herbe. Une concentration d'éluant (éthanol) de 85 % et un volume de 25 BV à un pH de 11 se sont avérés optimaux. Vingt et un composés actifs ont été identifiés par un test de chromatographie liquide haute performance/spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire. Cette étude fournit des informations précieuses pour d'autres recherches approfondies évaluant les activités œstrogéniques des glycosides totaux deCistanche désertique.

Mots-clés : Conception composite centrale ; Glycosides totaux de Cistanche deserticola; LC/Q-TOF-MS ; technologie de purification; test de croissance utérine.

Introduction

Cistanche désertiqueest une herbe tonique comestible classique. Il a été mentionné pour la première fois dans le classique à base de plantes de Shen Nong et s'est enrôlé dans la catégorie supérieure. C'est une herbe chaude et douce. Il possède de nombreuses propriétés médicinales, telles que la nutrition du foie et des reins, le renforcement des muscles et des os et l'amélioration de la régulation immunitaire ainsi que des activités anti-âge et anti-tumorales [1-4]. Certains composés naturels ont été isolés et identifiés à partir des extraits de cette plante, les principaux étant les glycosides phényléthanoïdes, les lignanoïdes, les iridoïdes, les polysaccharides et les alcaloïdes [5-8].

Les médicaments obtenus à partir de plantes médicinales contiennent divers composés actifs, qui sont principalement responsables de leurs actions thérapeutiques. L'efficacité d'un même médicament obtenu à partir de différentes sources végétales peut varier en raison des différences dans le type et la quantité de composés actifs qu'il contient. Ainsi, il est important d'identifier et de quantifier tous les composés actifs présents dans les médicaments obtenus à partir de plantes médicinales. Il en va de même pour C. deserticola. La méthodologie de surface de réponse est une méthode expérimentale pour étudier l'interaction entre différents facteurs simultanément [9-10]. Il peut être utilisé pour l'optimisation des paramètres d'extraction pour les produits phytopharmaceutiques et l'estimation quantitative des composés actifs dans les médicaments. La conception composite centrale (CCD) est l'une des conceptions expérimentales utiles dans la méthodologie de surface de réponse. Comparé aux plans orthogonaux et uniformes, le CCD a une plus grande précision et une meilleure prévisibilité [11].

Le syndrome post-ménopausique peut réduire considérablement la qualité de vie des femmes. Normalement, l'œstrogène est utilisé pour traiter cette condition. Cependant, l'utilisation à long terme d'œstrogènes peut entraîner des abus, provoquant ainsi divers effets indésirables et effets secondaires. Par conséquent, il est impératif de choisir une thérapie alternative, de préférence un médicament à base de plantes contenant des œstrogènes comme ingrédient actif pour le traitement du syndrome post-ménopausique [12-13].

Dans une expérience préliminaire, les structures de divers composés naturels obtenus à partir de C. deserticola ont été identifiées par spectrométrie de masse (MS) [14]. Il a été confirmé que les glycosides sont les principaux composés actifs ayant une activité oestrogénique significative [14-15]. Pour développer un principe actif œstrogénique sûr et efficace dans un nouveau médicament, une enquête approfondie sur le TGCD après purification est nécessaire. Dans cette étude, le CCD a d'abord été utilisé pour optimiser la purification des glycosides totaux de C. deserticola (TGCD). Par la suite, le test de croissance utérine a été utilisé pour évaluer les activités oestrogéniques du même glycoside. La chromatographie liquide à haute performance/spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire (HPLC/Q-TOF-MS) a été utilisée pour l'analyse qualitative des composés de TGCD après purification. Ce processus a été appliqué pour démontrer explicitement la présence de divers composés actifs ayant une activité oestrogénique dans le TGCD. Cela peut simultanément fournir la base de son utilisation clinique dans le syndrome post-ménopausique remplaçant les œstrogènes.

Procédure expérimentale

Instruments

Système HPLC Agilent 1290 (Agilent Technologies, Palo Alto, Californie, États-Unis), système LC/MS à temps de vol quadripolaire série Agilent 6530 (Q-TOF) (Agilent Technologies, Palo Alto, Californie, États-Unis) et HPLC chimique{ {5}}Des postes de travail D ont été utilisés comme instruments chromatographiques pour le traitement des données. L'eau ultrapure Milli-Q a été utilisée pour toute l'étude. balance analytique électronique AR1140 (Ohaus International Ltd.); lecteur de microplaques 680 (Bio-Rad Corporation); et une centrifugeuse à grande vitesse 64R (Beckman Coulter Allegra) ont été utilisées pour la préparation des échantillons.

Médicaments et produits chimiques

C. deserticola a été achetée sur le marché de la drogue et identifiée par le professeur Zhang Delian (Harbin University of Commerce, Chine). Le diéthylstilbestrol standard (pur à 99 %, lot n° 60518) a été acheté auprès du Dr Ehrenstorfer (Allemagne). D'autres étalons actéoside (111530-200505) et échinacoside (111670-200503) ont été obtenus auprès de l'Institut national pour le contrôle des produits pharmaceutiques et biologiques, Pékin, Chine. La pureté de chaque étalon était > 98 % . L'acétonitrile (ACN), le méthanol et l'acide formique (qualité MS) ont été achetés auprès de Thermo Scientific Pierce (Rockford, IL, USA). L'eau ultra pure a été obtenue auprès de Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd. (Hangzhou, Chine). Tous les réactifs disponibles dans le commerce étaient de qualité analytique.

Préparation des glycosides totaux de la solution de purification de C. deserticola

Après immersion dans de l'éthanol à 75 % pendant 12 h, la poudre brute de C. deserticola (100 g) a été extraite avec 800 ml d'éthanol à 75 % (v/v) à 80 degrés pendant 150 min au reflux. Il a ensuite été filtré à travers un filtre à double pont et ensuite extrait avec 800 ml d'éthanol à 75 % deux fois pendant 150 minutes supplémentaires. Ensuite, les filtrats ont été combinés et concentrés sous vide à 45 degrés. L'extrait a été obtenu en éliminant le solvant. Une certaine quantité d'eau distillée a été ajoutée à l'extrait pour obtenir une concentration de 0,5 g/mL, qui a été utilisée pour filtrer le processus de purification.

Pour l'adsorption à l'aide de résine macroporeuse AB-8, le pH de la solution d'échantillon de test a été ajusté à 11. Tout d'abord, de l'eau distillée à 2 BV a été utilisée pour laver les impuretés. Ensuite, l'éluant à une concentration de 25 BV d'éthanol à 85 % a été élué et recueilli. Enfin, l'éluant purifié collecté a été fusionné. Une certaine quantité d'eau distillée a été ajoutée à l'extrait pour obtenir une concentration de 1,5 g/mL, qui a été utilisée pour l'administration intragastrique. Pour le contrôle positif, une solution de diéthylstilbestrol (20 ug/mL) a été préparée avec de la poudre de diéthylstilbestrol.

Selon le ratio de purification ({{0}}.6), une certaine quantité de l'extrait (équivalent à 1 g de C. deserticola) a été transférée dans une fiole jaugée de 10 mL, dissous dans une solution de méthanol à 50 % (v/v) dans un bain à ultrasons pendant 5 min et dilué à 10 mL. La solution médicamenteuse a été obtenue après filtration du surnageant à travers une membrane filtrante de 0,45 µm. L'actéoside et l'échinacoside (1 mg chacun) ont été mélangés et dissous complètement dans une solution de 10 ml de méthanol à 50 % (v/v). Enfin, la solution standard a été filtrée sur un filtre Millipore de 0,45 μm avant analyse.

Conditions LC-MS

La séparation par chromatographie a été effectuée dans un système HPLC (Agilent 129{{10}}), équipé d'un système de distribution de solvant quaternaire, d'un dégazeur sous vide et d'un détecteur à barrette de photodiodes. L'analyse MS/MS a été effectuée dans un instrument Agilent-1290 HPLC/6530 système Q-TOF-MS, équipé d'une source d'ionisation par électrospray en modes ions positifs et négatifs. Une colonne Waters Symmetry shield RP C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm) (Waters Corporation, Milford, MA, USA) a été utilisée pour la séparation. La phase mobile comprenait une solution aqueuse d'acide formique à 0,2 % (v/v) (A) et de l'ACN (B), et elle a été pompée à un débit de 0,5 mL/min. Le volume d'injection de chaque échantillon était de 10 μL. Le programme d'élution par gradient était le suivant : 5 à 23 % de B pendant 0 à 35 min, 23 à 25 % de B pendant 35 à 65 min et 25 à 5 % de B pendant 65 à 70 min. La température de la colonne a été maintenue à 30 degrés. Les chromatogrammes ont été contrôlés et enregistrés à 330 nm. La pression du gaz d'atomisation a été fixée à 30 Psi et la tension capillaire était de 3,5 kV. Le débit de gaz sec était de 8 L/min à une température de 30 degrés. La température du gaz gaine a été fixée à 400 degrés à un débit de 12 L/min. L'énergie de collision a été fixée à 10–20 eV pour les balayages à basse énergie et à 30–50 eV pour les balayages à haute énergie. Les données des spectres de masse ont été enregistrées dans la plage de balayage de 50 à 1000 Da en modes de balayage d'ions positifs et négatifs. Dans cette étude, une comparaison rapide et efficace entre le TGCD et les standards a été réalisée dans les mêmes conditions LC-MS.

Test de croissance de l'utérus

Cela a été effectué en stricte conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Toutes les procédures expérimentales ont été examinées et approuvées par le comité d'éthique animale de l'Université de commerce de Harbin, en Chine.

Des souris Kunming femelles immatures (environ 21 jours après la naissance, sevrées) pesant 12 ± 2 g ont été achetées au Changchun National Biological Industry Base Laboratory Animal Center (Changchun, Chine). Les souris ont été logées dans une pièce à température régulée (22 ± 2 degrés) avec de la nourriture et de l'eau à volonté. L'expérimentation animale a été initiée après cinq jours d'acclimatation. Les souris ont jeûné pendant une nuit avec de l'eau ad libitum avant l'administration intragastrique de la solution à tester.

Les souris ont été réparties au hasard en 22 groupes, avec 10 animaux dans chaque groupe. Ils ont reçu des médicaments expérimentaux du même volume deux fois par jour (matin et soir) pendant quatre jours comme suit :

Groupe 1 : Glycosides totaux intragastriques de la solution de purification de C. deserticola (20 mL/kg), (volume de la solution/poids de la souris),

Groupe II : eau distillée intragastrique (groupe témoin négatif) et

Groupe III : diéthylstilbestrol intragastrique (20 ug/mL) (groupe témoin positif).

Le cinquième jour, toutes les souris ont été sacrifiées. Les utérus ont été immédiatement prélevés et pesés et les coefficients utérins ont été calculés.

analyses statistiques

Un test t bilatéral pour échantillons appariés a été utilisé pour identifier les différences statistiquement significatives dans les divers paramètres dans les différents groupes expérimentaux. L'analyse a été réalisée à l'aide du logiciel statistique SPSS (SPSS for Windows v21.0, SPSS Inc., USA). Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à un niveau de confiance de 95 % (p <>

résultats et discussion

Linéarité et corrélation des rendements en actéoside et glycosides totaux

L'équation de régression linéaire du rendement de l'actéoside était y {{0}}x - 14,75 (où x est la concentration d'actéoside et y est sa surface de pic correspondante) avec un coefficient de corrélation de r=1 dans la plage de concentration de 0.12−{{10}}.72 mg/mL. Cela indiquait une courbe d'étalonnage linéaire. L'équation de régression linéaire du rendement total des glycosides était y=26.074x plus 0,0866 (où x est la concentration des glycosides totaux et y est sa surface de pic correspondante) avec un coefficient de corrélation de r { {12}}.9982 dans la plage de concentration de 0,013 à 0,065 mg/mL. Cela indiquait également une courbe d'étalonnage linéaire.

Enquête méthodologique

La précision, la reproductibilité, la stabilité et la récupération des échantillons ont été étudiées dans l'étude méthodologique. Dans l'expérience de précision, l'écart type relatif (RSD) de l'actéoside et des glycosides totaux était de 1,43 % et 0.05 % respectivement. Dans l'expérience de reproductibilité, le RSD de l'actéoside et des glycosides totaux était de 0,10 % et 1,44 % respectivement. Dans l'expérience de stabilité de 24 h, le RSD de l'actéoside et des glycosides totaux était de 0,14 % et de 0,90 % respectivement. Dans l'expérience de récupération, la récupération de l'actéoside était de 100,50 % avec un RSD de 2,08 %, tandis que la récupération des glycosides totaux était de 99,12 % avec un RSD de 1,65 %. Toutes les valeurs RSD étaient inférieures à 3 %. Ces résultats ont démontré une bonne précision et reproductibilité. De plus, l'échantillon était stable pendant 24 h. Les résultats de la récupération se situent également dans la plage autorisée (95 à 105 %). Par conséquent, cette méthode peut être utilisée pour la détermination du rendement en actéoside et en glycosides totaux après purification.

Enquête à facteur unique de TGCD

La purification du TGCD à l'aide de résine macroporeuse peut être affectée par de nombreux facteurs, tels que le type de résine, les facteurs d'adsorption statique (temps d'adsorption, concentration de fuite et pH de la solution d'échantillon) et les conditions d'élution (vitesse d'écoulement, volume et concentration). En utilisant la capacité d'adsorption et les taux de désorption et d'élution du TGCD comme indices, la condition expérimentale a été déterminée sur la base des résultats d'expériences à facteur unique. En utilisant une résine d'adsorption macroporeuse de type AB-8, les conditions optimales suivantes ont été déterminées : 0.5 mg/mL de solution d'échantillon, pH de 10, temps d'adsorption statique de 8 h, 2 BV de l'eau distillée pour laver les impuretés, 20 BV d'éthanol à 80 % comme éluant et une vitesse d'écoulement de 0,5 BV/min. Les résultats spécifiques sont présentés dans les figures 1 à 7.

CCD pour l'optimisation de la technologie de purification du TGCD

Sur la base des résultats de l'enquête à facteur unique, trois facteurs influençant de manière significative la méthode de purification ont été sélectionnés comme indices, à savoir le pH de la solution d'échantillon (x1), la concentration d'éluant (x2) et le volume d'éluant (x3). Selon le principe du CCD, chaque facteur a cinq niveaux. Les niveaux maximum et minimum de ces différents facteurs ont été fixés en fonction des résultats de l'expérimentation préliminaire. Les niveaux de facteurs sont présentés dans le tableau 1 et les résultats expérimentaux sont présentés dans le tableau 2.

Les rendements totaux en glycosides et en actéosides ont été déterminés pour optimiser la méthode de purification du TGCD. Premièrement, les rendements totaux en glycosides et en actéosides ont été fixés aux critères numériques de désirabilité (d) entre {{0}}-1. Ensuite, la désirabilité globale (OD) [OD=(d1, d2, d3,....,dn)1/n, où n est l'indice] a été calculée. Le logiciel SPSS21.{{10}} et un logiciel expert en conception ont été utilisés pour la régression linéaire multiple et l'ajustement binomial des variables indépendantes et de la DO, avec p <0.05 a="" été="" pris="" en="" compte="" une="" norme="" statistiquement="" significative="" de="" l'équation.="" l'équation="" avec="" une="" plus="" grande="" valeur="" r="" (coefficient="" de="" corrélation="" multiple)="" a="" été="" sélectionnée="" comme="" modèle="" le="" mieux="" ajusté.="" l'équation="" linéaire="" multivariée="" est="" représentée="" par="" y="–" 1.02="" –="" 0.131x1="" plus="" 0.034x2="" plus="" 0,012x3="" (r="" {{="" 25}}.55,="" p="0.004)." l'équation="" binomiale="" est="" y="–" 21,92173="" –="" 0,74079x1="" plus="" 0,62914x2="" plus="" 0,041161x3="" plus="" 0,014972x1x2="" plus="" 2,06050*10-4x1x3="" plus="" 1,05698="" ×="" 10-3x2x3="" -="" 0.029589x{="" {56}}.78730="" ×="" 10-3x22="" -="" 2.89446="" ×="" 10-3x32="" (r="0.91," p="0.012)." on="" peut="" voir="" à="" partir="" des="" équations="" ci-dessus="" que="" le="" coefficient="" de="" corrélation="" de="" l'équation="" de="" régression="" linéaire="" multivariée="" est="" plus="" faible.="" la="" corrélation="" entre="" les="" variables="" indépendantes="" et="" dépendantes="" est="" très="" faible,="" et="" elle="" a="" été="" jugée="" défavorable="" à="" utiliser="" dans="" le="" modèle="">

Mais, le coefficient de corrélation de l'équation binomiale était élevé et il en résultait un bon ajustement. C'est donc le modèle binomial qui a été retenu. Sur la base d'une analyse complète de la figure de surface et de la carte de contour combinées aux données expérimentales (valeur de DO proche de {{0}}.6), la plage optimale de la méthode de purification a été obtenue. À partir de la figure 8, on peut voir que la valeur maximale de DO a été générée lorsque le pH de la solution d'échantillon (A) était compris entre 9 et 10 et que la concentration d'éluant (B) était comprise entre 79 et 85 %. . La figure 9 montre que la valeur maximale de la DO a été obtenue lorsque la valeur du pH de la solution d'échantillon (A) était comprise entre 9 et 10 et que le volume d'éluant (C) était compris entre 20 et 25 BV. La figure 10 montre que la valeur OD maximale a été obtenue lorsque la concentration d'éluant (B) était comprise entre 80 et 85 % et que le volume d'éluant (C) était compris entre 20 et 25 BV. À partir d'une analyse complète de ces données, le pH de la solution d'échantillon, la concentration d'éluant et le volume d'éluant ont été déterminés comme étant respectivement dans la plage de 9 à 10, 80 à 85 % et 20 à 25 BV. Sur la base de l'équation binomiale multivariée pour les résultats dérivés variables et le schéma optimal, la meilleure méthode de purification du TGCD s'est avérée être à une concentration d'éluant (éthanol) de 85 % et un volume de 25 BV à un pH de 11. La valeur de DO correspondante était de 0,8332. , et le rendement total en glycosides était de 73,0339 pour cent . L'impression visuelle des figures 8-10 identifie la meilleure méthode comme étant celle dans laquelle les interactions entre les deux facteurs ont été prises en compte, bien que la meilleure méthode déduite de la formule reconnaisse celle dans laquelle les interactions entre les trois facteurs ont été incluses. Les deux résultats différaient et la méthode de purification optimale était considérée comme une concentration d'éluant (éthanol) de 85 % et un volume de 25 BV à un pH de 11.

Mesure de la croissance de l'utérus

Le coefficient utérin de chaque groupe est présenté dans le tableau 3. Par rapport au groupe témoin négatif, les résultats des autres groupes étaient significativement différents. Il a été constaté que le TGCD obtenu à partir de 20 méthodes de purification différentes exerçait tous des actions oestrogéniques.

Expérience de confirmation

Les résultats complets du CCD et du test de croissance de l'utérus ont montré que la méthode de purification optimale était considérée comme une concentration d'éluant (éthanol) de 85 % et un volume de 25 BV à un pH de 11. Au cours de la

processus de validation, le rendement moyen des glycosides totaux était de 70,9150 pour cent . L'écart moyen entre les valeurs prédites et réelles était de 2,1180 %. Par conséquent, on peut suggérer que la prévisibilité et la crédibilité expérimentale de ce modèle sont bonnes.

Identification du TGCD après purification

Sur la base du temps de rétention et des données MS, 21 constituants naturels ont été spéculés, y compris le campnéoside 1, le 2′-acétylactéoside, le cistanoside A, le cistanoside B, le syringalide A 3'- - L-rhamnopyranoside, le tubuloside A, le tubuloside B, le salidroside, cistanoside G, acide téniposide, décaféoylactéoside, 8-acide épiloganique, échinacoside, cistanoside F, cistantubuloside B1, isoacteoside, actéoside, cis-actéoside, kankanoside E, osmanthuside B et cistanoside C. Le temps de rétention, MS et MS/ Les informations MS, la formule et les composés supposés sont présentés dans le tableau 4.

Q-TOF-MS est particulièrement adapté à l'identification structurelle de composants moléculaires complexes de médicaments et d'aliments car il peut fournir des compositions élémentaires possibles grâce à la masse moléculaire exacte et aux caractéristiques structurelles des ions fragments. Pour établir une caractérisation structurelle systématique, Q-TOF-MS, les données MS, la recherche de bases de données et la littérature de référence publiée ont également été utilisées pour l'identification. La formule moléculaire de chaque composant cible a été déduite de l'ion parent, et elle a été mise en correspondance avec les composés connus. Cette formule pourrait en outre être déterminée à partir de ses ions fragments apparentés. Par exemple, le pic 5 a montré un ion déprotoné prédominant à m/z 654 (C30H38O16), qui était identique à la composition élémentaire du campnéoside 1. La perte de caffeoyl a été formée à partir d'un ion fragment à m/z 493, et la perte de le fragment rha a été formé à partir d'un ion fragment à m/z 347.

Conclusion

En utilisant une technologie LC-Q-TOF-MS, une méthode d'analyse qualitative simple et robuste pour TGCD a été développée et entièrement validée. Les données de validation pour le dépistage et l'identification des composés naturels du TGCD étaient satisfaisantes. Vingt et un composés bioactifs du TGCD ont été spéculés comme suit : salidroside, cistanoside G, acide géniposidique, décaféoylactéoside, campnéoside 1, 8-acide épiloganique, 2'-acétylactéoside, cistanoside A, cistanoside B, syringalide A3′{{9 }}L-rhamnopyranoside, échinacoside, cistanoside F, cistantubuloside B1, isoacteoside, actéoside, tubuloside A, cis-actéoside, kankanoside E, osmanthuside B, cistanoside C et tubuloside B. La caractérisation structurale de ces composés peut fournir une base expérimentale pour leur contrôle de qualité et leur application clinique ultérieure en raison de leur activité oestrogénique. Cela peut offrir une option thérapeutique nouvelle et améliorée pour le traitement du syndrome post-ménopausique, évitant ainsi les effets secondaires et les réactions indésirables de la thérapie aux œstrogènes.

Abréviations

TGCDCistanche désertiqueglycosides totaux LC/Q-TOF-MS chromatographie liquide/spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire

Méthodologie de la surface de réponse RSM

Conception composite centrale CCD

Spectrométrie de masse MS HPLC/Q-TOF-MS Chromatographie liquide haute performance/spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire

ACN Acétonitrile

Volume du lit BV

Désirabilité globale OD

Chromatographie liquide LC-MS-spectrométrie de masse

Spectrométrie de masse à temps de vol quadripolaire Q-TOF-MS

MTC médecines traditionnelles chinoises

Écart-type relatif RSD

Remerciements

Ce projet a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81073015), la Fondation scientifique de la nature de la province du Heilongjiang (ZD2017014), le plan de formation des jeunes talents innovants du Collège de la province du Heilongjiang (UNPYSCT- 2017209). Les auteurs déclarent qu'il n'y a pas de conflit d'intérêts concernant la publication de cet article.

Conflit d'intérêt

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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