Les glycosides totaux de Cistanche Deserticola favorisent la récupération de la fonction neurologique en induisant une régénération neurovasculaire via la voie Nrf- 2/Keap-1 chez les rats MCAO/R

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Fujiang Wang, Ruiyan Li, Pengfei Tu, Jianping Chen, Kewu Zeng et Yong Jiang

Arrière plan:La médecine traditionnelle chinoise Cistanche deserticola a été signalée comme étant valable pour les maladies cardiovasculaires et cérébrovasculaires. Cependant, ses composants actifs pour la protection de l'AVC ischémique ne sont pas clairs. Nous avons cherché à explorer les composants actifs deC. deserticolacontre l'AVC ischémique ainsi que ses mécanismes potentiels.Méthodes :Nous avons étudié les effets protecteurs du cerveau des extraits deC. deserticola, glycosides totaux (TG), polysaccharides (PS) et oligosaccharides (OS) dans un modèle de rat d'occlusion-reperfusion de l'artère cérébrale moyenne (MCAO/R). 2, 3, 5-La coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC) a été utilisée pour évaluer le volume de l'infarctus cérébral, et le test au bleu d'Evans a été adopté pour évaluer la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BBB). Ensuite, les expressions CD31, a-SMA, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, ZO-1, claudin-5, occludin, Keap-1 et Nrf{{ 12}} ont été analysés par western blot ou immunofluorescence, et les activités MDA, SOD, CAT et GSH-Px ont été analysées à l'aide de kits.Résultats:Le traitement aux TG a remarquablement diminué les scores de déficit neurologique et les volumes d'infarctus, favorisé l'angiogenèse et le remodelage neuronal, et maintenu efficacement l'intégrité de la barrière hémato-encéphalique par rapport au groupe modèle. De plus, les TG ont considérablement réduit les niveaux de MDA et augmenté les activités antioxydantes (SOD, CAT et GSH-Px) dans le cerveau. Pendant ce temps, les TG ont remarquablement régulé à la baisse l'expression de Keap-1 et facilité la translocation nucléaire de Nrf-2. Au contraire, aucun effet protecteur n'a été observé pour les groupes PS et OS.Conclusion:Les TG sont les principaux composants actifs deC. deserticolacontre les lésions cérébrales induites par MCAO/R, et la protection se fait principalement via la voie Nrf-2/Keap-1.

Mots-clés : Cistanche deserticola, lésion cérébrale, glycosides totaux, polysaccharides, oligosaccharides, voie Nrf-2/Keap- 1

INTRODUCTION

Les accidents vasculaires cérébraux sont considérés comme une cause majeure de décès et d'invalidité dans le monde (Donnan et al., 2008). Près de 87 % de tous les cas d'AVC sont déclenchés par un AVC ischémique (Ovbiagele et Nguyen-Huynh, 2011). Actuellement, l'agent le plus efficace et le seul médicament approuvé par la FDA utilisé pour le traitement de l'AVC ischémique est l'activateur tissulaire recombinant du plasminogène. Cependant, un grand nombre de patients victimes d'AVC ne répondent pas à ce médicament, en raison de sa fenêtre thérapeutique étroite et d'un risque sérieux de complications hémorragiques (Lee et al., 2012 ; Schellinger et Kohrmann, 2014). Un défi majeur du traitement thrombolytique est la lésion d'ischémie/reperfusion (I/R), qui est considérée comme la principale cause de lésion cérébrale et de destruction fonctionnelle. La reperfusion après ischémie cérébrale augmente le risque d'hémorragie cérébrale tout en entraînant des lésions neurovasculaires et en produisant un excès d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui endommagent la barrière hémato-encéphalique (Alluri et al., 2015). Plusieurs études ont confirmé que la perturbation de la BHE est une cause majeure de la pathogenèse de l'AVC ischémique (Cao et al., 2016b).

La BHE se compose principalement de cellules endothéliales, de péricytes, d'astrocytes, de neurones et de membranes basales. Les composants centraux de la BHE sont des cellules endothéliales microvasculaires cérébrales qui sont reliées par des jonctions serrées, limitant ainsi les molécules exogènes dans le cerveau. Les altérations pathologiques des jonctions serrées - en particulier l'occludine, la claudine -5 et la zonula occludens -1 (ZO -1) - affectent de manière significative la fonction de la BHE lors d'un AVC ischémique, en particulier la perméabilité de la barrière (Liu et al., 2014 ; Hu et al., 2018 ; Liu et al., 2019). Pendant les périodes d'I/R, un ROS excessif est l'un des principaux facteurs conduisant à l'endommagement direct des neurones cérébraux (Ding et al., 2014). La surproduction de ROS entraîne la dégradation de certaines jonctions et la perturbation de la BHE, ce qui entraîne l'entrée de molécules exogènes dans le cerveau par la BHE, entraînant une aggravation des lésions cérébrales (Cheon et al., 2016 ; Zhang QY et al., 2017). Par conséquent, la protection de la BHE par des antioxydants a été considérée comme un moyen potentiel de prévenir les lésions de reperfusion.

Outre la dégradation de la BHE, l'I/R peut entraîner des lésions neurovasculaires et la mort neuronale (Jung et al., 2010). Lors d'un AVC, une augmentation de la mort des cellules neuronales peut résulter du stress oxydatif (Chi et al., 2018), et de nombreuses études ont montré que les ROS aggravent la gravité de l'AVC et les dommages neurologiques (Kondo et al., 1997 ; Crack et al., 2001 ; Crack et al., 2006). Bien que les essais cliniques n'aient pas donné de résultats satisfaisants, la neuroprotection reste une stratégie prometteuse pour le traitement de l'AVC ischémique aigu (Moretti et al., 2015). Ainsi, trouver des médicaments de neuroprotection efficaces pour traiter les AVC est un avantage pour les patients victimes d'AVC.

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) prend des mesures pour intervenir contre le déséquilibre interne de l'organisme (Gaire, 2018). En raison de la pathogenèse complexe des AVC ischémiques, l'effet multifactoriel de la MTC et de ses constituants actifs joue un rôle essentiel dans le traitement des AVC. Cistanche deserticola YC Ma, répandue dans les zones arides ou semi-arides de la Mongolie et du nord-ouest de la Chine, est une herbe de MTC largement utilisée pour le traitement de diverses maladies telles que l'oubli et la dépression depuis plus d'un an000 en Chine . Modernedes études pharmacologiques ont indiqué que les extraits bruts deC. deserticolaont montré de multiples activités pharmacologiques, telles que l'amélioration des fonctions d'apprentissage et de mémoire, la neuroprotection, l'amélioration de l'immunité, les effets antioxydants, anti-âge et anti-fatigue (Ko et Leung, 2007 ; Wang et al., 2012 ; Li et al., 2015). L'analyse chimique de C. deserticola a montré que ses principaux constituants comprennent les glycosides phényléthanoïdes, les glycosides iridoïdes, les polysaccharides et les oligosaccharides (Jiang et Tu, 2009). Cependant, les composants actifs de C. deserticola pour la protection du cerveau ne sont pas très clairs.La propriété neuroprotectrice de C. deserticola implique son potentiel thérapeutique dans les maladies cognitives telles que les accidents vasculaires cérébraux et la dépression, ainsi que la maladie d'Alzheimer (Wang et al., 2017). Cependant, la recherche sur l'impact deC. deserticolasur les accidents vasculaires cérébraux, y compris ses composants actifs et ses mécanismes d'action, est très limitée. Dans les travaux en cours, nous avons exploré l'effet protecteur de trois extraits de C. deserticola, des glycosides totaux (TG, glycosides phényléthanoïdes et autres glycosides), des polysaccharides (PS) et des oligosaccharides (OS) sur les lésions cérébrales I/R. Nos découvertes peuvent contribuer à l'application clinique précise deC. deserticolaet fournir un agent candidat pour la thérapie de l'AVC ischémique.

MATÉRIAUX ET MÉTHODES

Produits chimiques et réactifs

Les tiges de Cistanche deserticola ont été achetées à Alashan, Mongolie Intérieure, et identifiées par l'un des auteurs (P.-F. Tu). Les TG, les PS et les OS ont été préparés selon notre méthode rapportée précédemment (Gao et al., 2015). L'analyse quantitative des TG a été réalisée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) comme décrit précédemment (Li et al, 2019), et son chromatogramme est illustré à la figure 1. Les principaux composants des TG sont l'échinacoside, le tubuloside A, l'actéoside, l'iso- actéoside et 2'-acétylactéoside; leurs teneurs sont respectivement de 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g et 12,045 mg/g. Les teneurs en PS et OS sont de 69,42 % et 65,24 %, respectivement, comme déterminé par HPLC et l'analyse phénol-acide sulfurique, respectivement (Zhang A. et al., 2018 ; Shi et al, 2019).

Les références standard d'échinacoside (A0282), de tubuloside A (A0942), d'actéoside (A0280), d'iso-actéoside (A0281) et de 2'-acétylactéoside (A0943) ont été achetées auprès de Chengdu Must Biotechnology (Sichuan, Chine). Les puretés de toutes les normes sont supérieures à 98 %. Les kits H&E de coloration Nissl ont été achetés chez Boster (Wuhan, Chine). Edaravone (T0407-1) a été acheté auprès de Target Mol (Shanghai, Chine). Lapin anti-rat MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) et souris anti-rat CD31 (ab24590) ont été achetés d'Abcam Inc (Cambridge, MA, États-Unis). Lapin anti-rat Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) et Occludin (BS72035) ont été achetés auprès de Bioworld Technology (Nanjing, Chine). Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, États-Unis) était la source de synapsine -1 de lapin anti-rat (SYN, 5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA, 19245T). GAPDH (HRP-60004) a été acheté auprès de Proteintech Group, Inc. (Chicago, États-Unis). Les anticorps secondaires ont été fournis par Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Pékin, Chine). Hoechst 33258 a été obtenu auprès de Beyotime (Jiangsu, Chine).

Animaux

Des rats Sprague-Dawley (mâles, pesant 250 à 300 g) ont été obtenus auprès de Vital River Laboratory Animal Technology (Beijing, Chine) et logés dans une pièce climatisée maintenue sur un cycle lumière / obscurité de 12 h. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément aux directives ARRIVE sur la recherche animale (Kilkenny et al., 2010; McGrath et al., 2010) et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l'Université de Pékin (LA2019123).

Protocoles d'expérimentation animale

Les rats ont été soumis à MCAO/R, comme décrit précédemment (Wang et al., 2018). En bref, l'artère carotide commune gauche (CCA), l'artère carotide externe (ECA) et l'artère carotide interne (ICA) ont été exposées, et une suture en monofilament de nylon 3-0 a été insérée de l'ECA dans l'ICA jusqu'à atteindre le milieu artère cérébrale (MCA). Après 1,5 h d'occlusion MCA, la reperfusion a été simulée en retirant le filament. Au cours de l'intervention chirurgicale, la température corporelle de tous les rats a été maintenue à 37,0 degrés.

Administration des médicaments

Les rats ont été séparés au hasard en six groupes à l'aide du logiciel SPSS version 22.0 comme décrit (Jiang et al., 2014) : groupe normal (NOR) ; groupe de modèles (MOD); groupe edaravone (médicament positif, 6 mL/kg, EDI); groupe TG (280 mg/kg, TG); Groupe PSs (280 mg/kg, PSs) et groupe OSs (280 mg/kg, OSs). Les TG, PS et OS ont été administrés une fois par jour après MCAO/R pendant 14 jours. Les groupes NOR et MOD ont été traités avec une solution saline normale. Les nombres d'animaux sont présentés dans le tableau 1.

Mesure du poids et scores de déficit neurologique modifiés (mNSS)

Le poids corporel a été contrôlé le 14e jour à l'aide d'une balance numérique ADVENTURE ™ (OHAUS, New Jersey, États-Unis). Le mNSS a été évalué selon la méthode décrite par FJ Wang (Wang et al., 2018), avec des révisions mineures.

2, 3, 5- Coloration au chlorure de triphényltétrazolium (TTC)

Le volume de l'infarctus a été mesuré comme décrit précédemment (Wang et al., 2015). En bref, les cerveaux ont été sectionnés en sept blocs coronaux équidistants (2 mm). Ces sections ont été colorées avec 2% de TTC (Coolaber, Pékin, Chine) à 37 degrés pendant 15 min. Volume de l'infarctus (pourcentage)=(volume de l'hémisphère ischémique ipsilatéral - volume de l'hémisphère ischémique controlatéral)/volume de l'hémisphère ischémique controlatéral × 100.

Coloration Nissl et H&E

Les rats ont été profondément anesthésiés, et le cerveau entier a ensuite été rapidement retiré du crâne et fixé à l'aide de paraformaldéhyde à 4% et inclus dans de la cire de paraffine, et sectionné en tranches de 7 µm d'épaisseur. Les sections ont été colorées avec Nissl et H&E. Dans cette étude, six champs aléatoires de 200 × 200 µm ont été capturés dans chaque échantillon de tissu avec un microscope optique. Le nombre de corps de Nissl a été compté avec la version 6.0 du logiciel IPP (Media Cybernetics, Bethesda, USA).

Dosage du bleu d'Evans

Les rats ont reçu une injection d'EB à 2 % (Coolaber Science & Technology Co., LTD) après MCAO/R. Deux heures plus tard, les rats ont été anesthésiés puis le cerveau entier a été rapidement prélevé et homogénéisé dans l'acétone. Les surnageants ont été analysés à 620 nm par un lecteur d'absorbance 800 TS (BioTek, USA).

Mesure des activités de la catalase (CAT), de la superoxyde dismutase (SOD), du malondialdéhyde (MDA) et de la glutathion peroxydase (GSH-Px)

Tous les échantillons de sérum ont été centrifugés à 4,000 × rpm pendant 15 min à 4 degrés, puis analysés pour détecter les activités de MDA, CAT, SOD et GSH-Px en suivant les instructions du fabricant (Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd, Chine).

Analyse Western Blot

Les tissus cérébraux (100 mg) prélevés sur chaque rat ont été homogénéisés et lysés dans un tampon de lyse RIPA, puis analysés pour détecter la concentration en protéines à l'aide d'un kit BCA (Beijing TransGen Biotech Co., Ltd.). Les protéines totales des tissus ont été chargées sur des gels SDS-PAGE à 10 % et transférées sur une membrane de nitrocellulose. La membrane a été bloquée avec du lait écrémé à 5%, puis incubée pendant une nuit avec des anticorps primaires à 4 degrés. La membrane a ensuite été incubée avec un anticorps secondaire. L'analyse Western blot a été analysée à l'aide du système d'imagerie numérique Kodak (5200 Multi, Tanon, Chine).

Analyse immunofluorescente

Des colorations par immunofluorescence pour CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 et Keap-1 ont été réalisées. Les anticorps primaires dirigés contre Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 et Keap-1 ont été dilués pour 1:200 et 1:100, respectivement. L'anticorps secondaire de l'IgG anti-lapin de souris Alexa Flur 488 et l'IgG anti-lapin de chèvre rhodamine (TRITC) ont tous deux été dilués au 1:200. Les noyaux ont été colorés par Hoechst 33258. Les images ont été capturées à l'aide du système d'imagerie de pathologie quantitative automatisé Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, USA). L'expression de la protéine a été analysée à l'aide du logiciel IPP version 6.0.

Analyses statistiques

Toutes les données ont été décrites comme moyenne ± SD. La version 22.0 du logiciel SPSS a été effectuée pour l'analyse statistique. Une ANOVA unidirectionnelle a été utilisée lors de la comparaison de différents groupes. P <0.05 a="" été="" considéré="" comme="" la="" différence="">

RÉSULTATS

Les TG augmentent le poids corporel et réduisent les dommages cérébraux chez les rats MCAO/R

Après 14 jours de guérison avec les TG, les PS, l'Oss et l'EDI, les poids corporels, les déficits neurologiques et les volumes d'infarctus des rats I/R ont été évalués. Les résultats ont montré que les poids corporels dans le groupe MOD étaient fortement diminués, tandis que les poids diminués dans les groupes TG, PS et EDI étaient augmentés (figure 2A). Les scores de déficit neurologique ont été considérablement réduits par l'EDI et les TG (figure 2B). Les tranches de cerveau chez les rats du groupe NOR étaient rouge foncé et il n'y avait pas d'infarctus, tandis que les rats du groupe MOD présentaient un grand infarctus cérébral ipsilatéral. Après le traitement des TG, les volumes d'infarctus ont été considérablement réduits (figures 2C, D). Le traitement PSs et OSs n'a montré aucun effet évident sur les indices ci-dessus. Les données ci-dessus ont montré que les TG pouvaient nettement atténuer les lésions cérébrales induites par l'I/R, mais pas les PS et les OS.

Les TG améliorent les dommages histopathologiques chez les rats MCAO/R

Pour déterminer certains des effets du traitement aux TG, PS et OS sur les dommages histopathologiques, une coloration H&E a été effectuée pour révéler les dommages pathologiques. Les structures histomorphologiques des cerveaux du groupe NOR ont été disposées régulièrement. Les changements de morphologie dans les groupes TGs étaient plus légers que ceux du groupe MOD. Cependant, les groupes de traitement PS et OS n'ont montré aucune amélioration significative des changements de morphologie (Figure 3).

Les TG atténuent les lésions neuronales après des rats induits par I/R

La coloration de Nissl a montré les changements histopathologiques des neurones dans la pénombre de la zone ischémique. Comme le montre la figure 4, les neurones normaux avaient un nucléole clair et une structure intacte. Dans le groupe MOD, les neurones avaient des espaces intercellulaires élargis. Les corps nissl avaient disparu, rétrécis et profondément souillés. Cependant, ces changements ont rarement été observés dans les groupes EDI, TG et PS. Ces résultats ont illustré que les TG et les PS pourraient atténuer de manière significative les lésions neuronales induites par l'ischémie/la reperfusion.

Les TG atténuent la perturbation de la BBB après des rats traités par I/R

Le test au bleu d'Evans est une méthode classique pour rechercher le changement de perméabilité à la BBB. Les résultats de l'expérience ont montré qu'une augmentation du bleu Evans a été observée dans le groupe MOD, alors qu'il y avait une diminution significative du bleu Evans chez les rats traités aux TG et à l'EDI. De plus, il n'y avait pas de différence significative entre les groupes de traitement PS et OS (Figure 5). Ces résultats suggèrent que les TG pourraient atténuer considérablement la perturbation de la BHE.

Les TG favorisent l'angiogenèse chez les rats blessés par I/R

Des études plus récentes montrent que l'angiogenèse joue un rôle essentiel dans la récupération fonctionnelle neurologique et les résultats pronostiques après un AVC ischémique aigu (Yuen et al., 2015). Pour évaluer les effets des TG, des PS et des OS sur l'angiogenèse, le CD31 et l'a-SMA ont été utilisés pour quantifier les nombres capillaires. La coloration par immunofluorescence a montré que le groupe MOD provoquait une diminution remarquable des expressions de CD31 (figures 6A, B) et a-SMA (figures 6C, D) dans la pénombre des zones ischémiques des rats I/R, par rapport aux rats normaux . Ce résultat illustre que l'I/R peut causer des dommages vasculaires dans la pénombre du cortex des hémisphères ischémiques. Cependant, le traitement aux TG et à l'EDI a remarquablement augmenté la densité capillaire, l'angiogenèse et l'artériogenèse, comme l'indiquent les expressions accrues de CD31 et d'a-SMA. Ces résultats suggèrent que les TG pourraient favoriser l'angiogenèse dans la pénombre ischémique des rats I/R, mais pas les PS et les OS.

Les TG augmentent l'expression des protéines de la jonction serrée chez les rats blessés par I/R

La perturbation de la BBB peut augmenter la teneur en eau du cerveau et le gonflement des tissus, entraînant des lésions cérébrales. Les protéines des jonctions serrées sont des composants structurels importants de la BHE (Tenreiro et al., 2016 ; Jiang et al., 2018). Pour tester si le traitement par les TG, les PS et les OS après un AVC pouvait influencer l'intégrité de la BHE, les expressions de ZO-1, de claudine-5 et d'occludine ont été réalisées par analyse d'immunofluorescence. Les résultats ont indiqué que les expressions de claudine-5, occludine et ZO-1 étaient visiblement diminuées dans le groupe MOD. Cependant, ils ont été considérablement augmentés après 14 jours d'administration de TG. Les groupes PS et OS n'ont montré aucun changement significatif dans l'expression de ces protéines (Figure 7). Ces données ont indiqué que les TG peuvent réguler l'expression des protéines de jonction serrée et probablement maintenir l'intégrité de la BHE après une lésion I/R. Les TG augmentent la couverture des péricytes sur les capillaires chez les rats blessés par I/R La couverture des péricytes sur les capillaires joue un rôle essentiel dans le maintien de l'intégrité de la BHE (Armulik et al., 2010 ; Daneman et al., 2010). Ainsi, nous avons testé si la couverture des péricytes pouvait être augmentée par le traitement aux TG, PS et OS. Les résultats de l'analyse de l'intensité de l'immunofluorescence ont montré que les expressions de PDGFRb et de CD31 étaient considérablement réduites dans le groupe MOD. L'administration de TG aux rats I/R a significativement récupéré ou même augmenté les intensités d'expression du PDGFRb et du CD31, mais aucune différence n'a été observée dans les groupes de traitement PS et OS (Figure 8). Ainsi, le traitement des TG pourrait augmenter de manière significative la couverture des péricytes. Ces découvertes ont en outre confirmé que les TG peuvent maintenir l'intégrité de BBB après I/R.

Les TG favorisent le remodelage neuronal chez les rats blessés par I/R

Selon de nombreuses études, la neurogenèse après un AVC peut améliorer significativement la récupération fonctionnelle (Grefkes et Ward, 2014 ; Zhang et al., 2019). La synaptophysine (SYN), les protéines de densité postsynaptique 95 (PSD-95) et la protéine 2 associée aux microtubules (MAP-2) ont été utilisées comme marqueurs pour examiner la plasticité neuronale dans la pénombre ischémique du cortex. Pour évaluer les effets du traitement des TG, des PS et des OS sur la neurogenèse chez les rats blessés par I/R, l'immunofluorescence et le Western blot pour les expressions SYN, PSD95 et MAP-2 ont été réalisés. Comme le montrent les figures 9 et 10, les niveaux d'expression de SYN, PSD95 et MAP-2 chez les rats I/R après 14 jours de reperfusion ont diminué par rapport aux rats NOR, tandis que la guérison des TG et des PS pourrait significativement augmenter. réguler leur niveau d'expression. Le groupe OSs n'a pas eu de changement significatif par rapport au groupe MOD. Les données ont indiqué que la guérison des TG et des PS était capable de promouvoir considérablement le remodelage neuronal après une lésion I/R.

Les TG modifient les expressions Nrf-2 et Keap-1 chez les rats blessés par I/R

Le stress oxydatif est un mécanisme pathogène principal dans les lésions I/R (Ya et al., 2018 ; Yu et al., 2018). Les études ont vérifié que Nrf-2 est un régulateur principal des réponses antioxydantes (Thompson et al., 2015). Pour étudier les réponses oxydatives médiées par Nrf-2 et Keap-1 après une lésion I/R, nous avons évalué l'expression cytoplasmique ainsi que la translocation nucléaire de Keap-1. Pendant ce temps, l'expression de Nrf-2 dans les tissus cérébraux de rats blessés par I/R a également été analysée (figures 10 et 11). Selon l'analyse par immunofluorescence, Nrf-2 s'est avéré être principalement situé au niveau du cytoplasme dans le groupe NOR. Dans le groupe TG, l'expression de Nrf-2 dans la localisation cytoplasmique était régulée à la baisse, mais régulée à la hausse dans le noyau, et une diminution de l'expression de Keap-1 a également été observée. Les données ont montré que la protection cérébrale des TG pourrait être associée à la modulation de Nrf-2 et Keap-1

Les TG atténuent le stress oxydatif du tissu cérébral chez les rats blessés par I/R

Pour confirmer les effets antioxydants des TG, les activités de SOD, CAT, GSH-Px et MDA ont été évaluées chez des rats blessés par I/R. Dans la figure 12, la teneur en MDA a été nettement augmentée dans le groupe MOD, et en même temps, les activités de SOD, CAT et GSH-Px ont été diminuées, par rapport aux rats normaux. À l'inverse, le traitement aux TG a entraîné une diminution significative de la teneur en MDA et une augmentation des activités de SOD, CAT et GSH-Px. Ces résultats ont en outre confirmé l'activité antioxydante des TG.

DISCUSSION

De nombreuses études suggèrent que la MTCC. deserticolaa des activités biologiques étendues, par exemple en améliorant la capacité d'apprentissage, la mémoire et l'immunité (Dong et al., 2007 ; Jiang et Tu, 2009 ; Wang et al., 2017 ; Xia et al., 2018). Cependant, les composants actifs de C. deserticola pour la neuroprotection restent flous. Les travaux en cours visent à cribler les composants actifs deC. deserticolacontre l'AVC ischémique sur le modèle MCAO/R. Trois extraits de C. deserticola (TG, PS et OS) ont été utilisés pour évaluer leurs effets sur les rats MCAO/R, ainsi que les mécanismes possibles.

L'AVC est une maladie cérébrovasculaire aiguë courante. Des études épidémiologiques montrent que les AVC sont plus fréquents chez les hommes que chez les femmes (Sealy-Jefferson et al., 2012 ; Guzik et Bushnell, 2017). Ainsi, dans notre expérience, des rats mâles ont été adoptés pour les tests. Nos résultats ont prouvé que l'induction I/R accélérait le stress oxydatif et le volume de l'infarctus, brisant la BHE et entraînant des lésions nerveuses et cérébrovasculaires. Après dépistage, il a été constaté que les TG diminuent le volume de l'infarctus et favorisent le remodelage neuronal et l'angiogenèse. De plus, il a été observé que les TG maintenaient l'intégrité de la BHE après une lésion I/R. Au contraire, les PS et les OS n'apportent aucun soulagement significatif aux blessures I/R. Ainsi, les TG sont considérés comme la principale fraction active deC. deserticolapour la neuroprotection, potentiellement en favorisant le remodelage neuronal, l'angiogenèse et l'intégrité de la BHE via l'activation de la voie Nrf- 2/Keap-1.

De plus en plus de preuves indiquent que l'établissement d'une circulation collatérale efficace est très important pour éviter la formation d'infarctus et de pénombre ischémique, et constitue un traitement essentiel à un stade précoce de l'AVC ischémique (ElAli, 2016 ; Iwasawa et al., 2016). La prolifération des cellules endothéliales vasculaires et des cellules musculaires lisses après infarctus ischémique détermine l'établissement de la circulation collatérale. Cependant, les modèles d'ischémie ont un phénomène commun, c'est-à-dire que le stress oxydatif existait largement dans la microvasculature cérébrale. Les données d'études ont montré qu'un grand nombre d'antioxydants peuvent perturber la fonction de la BHE et les propriétés de l'angiogenèse (Mentor et Fisher, 2017). CD31 et a-SMA sont les marqueurs des cellules endothéliales vasculaires ainsi que des cellules musculaires lisses, respectivement (Saboor et al., 2016). Pour étudier l'effet sur la prolifération cellulaire mentionnée ci-dessus des extraits deC. deserticola, nous avons examiné les expressions de CD31 et d'a-SMA dans l'homogénat de pénombre ischémique cérébrale. Nos données ont montré que les TG ont considérablement amélioré les expressions de CD31 et d'a-SMA. Cependant, il n'y avait pas de différences significatives pour les groupes PS et OS. Par conséquent, nous en avons déduit que les TG peuvent réduire les lésions cérébrales en favorisant l'angiogenèse en augmentant les expressions de CD31 et d'a-SMA, alors que les PS et les OS ne fournissent pas une telle protection contre les lésions cérébrales. Ces résultats ont en outre confirmé que seuls les TG pouvaient prévenir les lésions cérébrales d'I/R.

L'AVC ischémique peut être considéré comme le résultat d'une ischémie cérébrale causée par une altération de la plasticité neuronale ou un remodelage des zones cérébrales. La majorité des patients victimes d'AVC souffrent de déficits neurologiques. L'activation de la neurogenèse est une stratégie prometteuse pour les patients victimes d'AVC afin d'améliorer leurs fonctions neurologiques (Cramer et Chopp, 2000). La neurogenèse participe directement à la récupération des fonctions neurologiques après une lésion cérébrale I/R (Zhang et al., 2019). Des recherches antérieures montrent que les TG peuvent améliorer le taux de survie des cellules pyramidales de l'hippocampe et induire la neurogenèse (Lian et al., 2017). Le stress oxydatif provoque la perte de neurones lors de nombreuses maladies, telles que la maladie de Parkinson, les accidents vasculaires cérébraux, etc. (Duan et Si, 2019 ; Singh et al., 2019). Nrf-2 transcrit de nombreux gènes liés à la neuroprotection dans leur région promotrice, notamment SOD, MDA, CAT et g glutamyl cystéine ligases, etc. (Satoh et al., 2006). Les protéines SYN, PSD-95 et MAP-2, qui sont étroitement associées à la formation synaptique et à la neurotransmission, peuvent être considérées comme des marqueurs de la recherche sur la plasticité neuronale dans la région de la pénombre ischémique. Après étude, nous avons découvert que la guérison avec les TG pouvait augmenter de manière significative les expressions de PSD95, SYN et MAP-2, indiquant que la protection cérébrale des TG était corrélée à l'amélioration de la plasticité neuronale pendant l'I/R. Cependant, il est dommage qu'il n'y ait pas de différence évidente pour les groupes PS et OS. Ces résultats ont indiqué que les TG pourraient améliorer la neuroplasticité après une lésion cérébrale I/R.La recherche en imagerie sur les patients victimes d'un AVC a montré que le dysfonctionnement de la BHE peut être considéré comme un attribut frappant du cerveau péri-ischémique (Bang et al., 2007). Les TJ, qui sont composés de protéines cytoplasmiques, de protéines transmembranaires et de molécules d'adhésion de jonction entre les cellules endothéliales capillaires, sont très importants pour maintenir l'intégrité de la BHE (Ye et al., 2019). Parmi elles, ZO-1, la claudine-5 et l'occludine sont les protéines les plus importantes des TJ. De plus en plus de preuves indiquent que l'augmentation de la perméabilité de la BHE induite par l'ischémie est généralement corrélée aux altérations de ZO-1, de la claudine-5 et de l'occludine (Cao et al., 2016a ; Page et al., 2016 ; Yu et al., 2017 ; Liu et al., 2018). Dans ce travail, les résultats ont démontré que bien que les TG puissent augmenter de manière significative les expressions des protéines ZO-1, claudin-5 et occludine dans les tissus cérébraux induits par MCAO, ni les PS ni les OS ne l'ont fait. La BHE est constituée de cellules endothéliales cérébrales et est étroitement associée aux péricytes (Nyul-Toth et al., 2016). Les péricytes sont essentiels à l'intégrité de la BHE (Bell et al., 2010). L'AVC ischémique déclenche la mort des péricytes et le détachement des cellules endothéliales cérébrales dans la phase aiguë, déstabilisant ainsi la microvascularisation et altérant les propriétés de la BHE (Zechariah et al., 2013). Nos données ont montré que les TG pouvaient augmenter la couverture des péricytes sur les capillaires et augmenter les niveaux d'expression de ZO-1, de claudine-5 et d'occludine. Ces phénomènes ont prouvé que les TG pouvaient protéger efficacement l'intégrité de la BHE après une lésion cérébrale I/R. En résumé, les TG peuvent atténuer les lésions cérébrales de plusieurs manières, telles que la promotion de l'angiogenèse, l'amélioration de la plasticité neuronale et le maintien de l'intégrité de la BHE.

Nous avons ensuite étudié la voie de signalisation pour explorer le mécanisme sous-jacent à la protection cérébrale des TG. Le processus de lésion I/R est multifactoriel, et donc de nombreux mécanismes sont impliqués dans la pathogenèse. Le stress oxydatif est un facteur de risque fondamental contribuant aux lésions cérébrales induites par l'I/R (Suda et al., 2013), telles que les dommages à la structure de la BHE, le dysfonctionnement endothélial vasculaire et l'aggravation des lésions neuronales ischémiques (Xiong et al., 2015 ; Caglayan et al., 2019 ; Priestley et al., 2019). Ainsi, le stress oxydatif est devenu une cible thérapeutique intéressante dans les lésions cérébrales induites par l'I/R. Les enzymes de phase 2, qui sont médiées par le facteur lié au facteur nucléaire E2-facteur lié-2 (Nrf-2), ont été considérées comme un moyen important par lequel les neurones se protègent contre le stress oxydatif (Suzuki et Yamamoto, 2015 ; Ya et al., 2018). De plus en plus de preuves indiquent que l'activation de Nrf-2 pendant l'I/R est une cible thérapeutique potentielle pour la neuroprotection (Ding et al., 2015 ; Zhang R. et al., 2017). Nrf-2, en tant que régulateur important de la défense antioxydante endogène, intervient dans le niveau d'hème oxygénase 1 (HO-1) et d'autres enzymes antioxydantes, telles que la NAD(P)H quinone oxydoréductase 1 (NQO1), SOD, CAT, GSH et MDA (Siow et al., 2007 ; Ding et al., 2014). De plus, Nrf-2 joue un rôle régulateur important dans l'angiogenèse. La présente étude montre que Nrf-2 peut être considérablement amélioré et activé dans le processus de développement vasculaire (Wei et al., 2013).

Comme décrit précédemment (Jiang et Tu, 2009), les TG contiennent de nombreux composés bioactifs, par exemple l'échinacoside, le tubuloside A, l'actéoside, l'iso-actéoside et le 2'-acétylactéoside, et certains d'entre eux ont montré des fonctions neuroprotectrices après une I/R cérébrale. blessure (Peng et al., 2016). L'échinacoside a de nombreux effets pharmacologiques, tels que l'antioxydation, l'anti-sénescence, la neuroprotection, l'anti-inflammation, la promotion de la cicatrisation, l'hépatoprotection, la promotion de la formation osseuse et les activités anti-tumorales (Yu et al., 2016 ; Li et al., 2018 ; Zhang Y. et al., 2018 ; Ji et al., 2019 ; Xu et al., 2019). Récemment, l'échinacoside a été identifié comme un puissant antioxydant dans le système nerveux central (Lu et al., 2016). L'échinacoside peut réduire la teneur en MDA et améliorer les activités de la SOD et du GSH Px dans les lésions cérébrales ischémiques, et l'analyse d'amarrage moléculaire a montré que l'échinacoside peut se lier à Keap-1, conduisant à la translocation nucléaire Nrf-2 (Li et al., 2018). L'étude de Xia a montré que l'actéoside pouvait diminuer le volume de l'infarctus et la teneur en eau du cerveau pour améliorer les déficits neurologiques chez les rats MCAO/R en atténuant le stress oxydatif (Xia et al., 2018). D'autres études ont démontré que l'iso-actéoside pouvait augmenter les activités des enzymes antioxydantes cellulaires, SOD et CAT dans les cellules V79-4 traitées à l'H2O2-traitées à l'H2O79-4 (Chae et al., 2005). Sur la base des rapports ci-dessus sur les composés actifs contenus dans les TG, il est possible de déduire que les TG pourraient protéger contre les accidents vasculaires cérébraux ischémiques via les voies antioxydantes.

Li a rapporté les effets neuroprotecteurs des glycosides phényléthanoïdes (PhG) sur l'apoptose induite par H2O2- sur les cellules PC12 via la voie Nrf2/ARE (Li et al., 2018). Ces PhG ont été significativement supprimés en déclenchant la translocation nucléaire Nrf2 et en augmentant les expressions de HO-1, NQO1, la sous-unité catalytique de la glutamate-cystéine ligase (GCLC) et la sous-unité modificatrice de la glutamate-cystéine ligase (GCLM) (Li et al., 2018 ; Gong et al., 2019). Par conséquent, ces résultats suggèrent que la voie Nrf-2/ARE joue un rôle crucial dans les effets protecteurs induits par les PhG sur les cellules neuronales. De même, dans cette étude, nous avons constaté que les TG pouvaient diminuer le niveau de MDA et augmenter les niveaux de SOD, CAT et GSH-Px chez les rats I/R. Pendant ce temps, les TG pourraient réguler à la hausse l'expression de Nrf2 dans le noyau, réguler à la baisse l'expression correspondante dans le cytoplasme et diminuer de manière significative l'expression de Keap-1. Par conséquent, la voie Nrf-2/Keap-1 peut être impliquée dans les effets neuroprotecteurs médiés par les TG. Une validation plus poussée de cette voie serait effectuée dans une culture cellulaire in vitro avec des modèles de lésions de privation/réoxygénation d'oxygène-glucose à l'avenir. En outre,C. deserticolales extraits ont été administrés dans notre étude pendant 14 jours en continu. Étant donné que la neurogenèse adulte affecterait l'interprétation des effets neuroprotecteurs pendant 14 jours de reperfusion, la neurogenèse ne peut être exclue dans notre conception expérimentale actuelle pour explorer l'effet neuroprotecteur des CT. C'est la limite de notre recherche.

En conclusion, ce sont les TG deC. deserticolaqui peuvent améliorer l'angiogenèse et la neurogenèse ainsi que maintenir l'intégrité de la BHE chez les rats blessés par I/R, mais pas les PS et OS. Les effets pourraient être médiés par l'activation de la voie Nrf-2/Keap-1.