L'AKT activée par le préconditionnement contrôle la tolérance neuronale à l'ischémie par la voie MDM2–p53Ⅰ

Abstrait

L'un des mécanismes les plus importants de la neuroprotection médiée par le préconditionnement est l'atténuation de l'apoptose cellulaire, induisant une tolérance cérébrale après une ischémie préjudiciable ultérieure. Dans ce contexte, la voie de signalisation anti-apoptotique PI3K/AKT joue un rôle clé dans la régulation de la différenciation et de la survie des cellules.

Cliquez pour poudre de cistanche tubulosa pourneuroprotection

L'AKT actif est connu pour augmenter l'expression de la double minute-2 murine (MDM2), une E3-ubiquitine ligase qui déstabilise p53 pour favoriser la survie des cellules cancéreuses. Dans les neurones, nous avons récemment montré que l'interaction MDM2–p53 est potentialisée par un préconditionnement pharmacologique, basé sur une stimulation subtoxique du récepteur NMDA du glutamate, qui empêche l'apoptose neuronale induite par l'ischémie.

Cependant, on ne sait pas si ce mécanisme contribue à la tolérance neuronale pendant le préconditionnement ischémique (IPC). Ici, nous montrons que l'IPC a induit la phosphorylation médiée par PI3K d'AKT à Ser473, qui à son tour a phosphorylé MDM2 à Ser166. Cette phosphorylation a déclenché la stabilisation nucléaire de MDM2, conduisant à la déstabilisation de p53, empêchant ainsi l'apoptose neuronale lors d'une agression ischémique. L'inhibition de la voie PI3K/AKT avec la wortmannine ou par le silençage de l'AKT a induit l'accumulation de MDM2 cytosolique, abrogeant la neuroprotection induite par l'IPC.

Ainsi, l'IPC améliore l'activation de la voie de signalisation PI3K/AKT et favorise la tolérance neuronale en contrôlant l'interaction MDM2-p53. Nos résultats fournissent une nouvelle voie mécaniste impliquée dans la neuroprotection induite par l'IPC via la modulation de la signalisation AKT, suggérant que l'AKT est une cible thérapeutique potentielle contre les lésions ischémiques. Mots clés : AKT ; MDM2 ; p53; PI3K ; tolérance ischémique; préconditionnement

1. Introduction

Chez l'homme, l'existence d'un accident ischémique transitoire (AIT) a été révélée comme un état préconditionné endogène avec les avantages des résultats fonctionnels chez les patients victimes d'AVC [1–3]. La neuroprotection endogène induite par un bref stimulus ischémique subtoxique, connu sous le nom de préconditionnement ischémique (IPC), est considérée comme une stratégie dans le domaine émergent de la neuroprotection contre les lésions ischémiques [4–6].

Les preuves montrent que la neuroprotection promue par l'IPC dépend des mécanismes de transcription, de traduction et de post-traduction, ce qui altère la fonction des protéines clés après l'ischémie [6-11]. Cependant, le mécanisme impliqué dans la tolérance ischémique (TI) induite par la CPI n'a pas été entièrement élucidé dans le cerveau humain [12,13].

Le développement de nouvelles approches expérimentales pour comprendre la neuroprotection médiée par l'IPC représente un outil puissant pour déchiffrer les mécanismes endogènes sous-jacents à l'informatique cérébrale [6], qui ont le potentiel de dévoiler de nouvelles cibles thérapeutiques visant à minimiser les lésions cérébrales chez les patients victimes d'AVC. Au cours des deux dernières décennies, la mort cellulaire neuronale apoptotique s'est positionnée comme un mécanisme essentiel impliqué dans les lésions ischémiques cérébrales [14-16]. En ce sens, la protéine kinase B ou AKT, une sérine/thréonine kinase qui nécessite l'activation d'une phosphoinositide kinase fonctionnelle (PI3K), a été considérée comme une cible essentielle des thérapies neuroprotectrices après ischémie [17,18].

Récemment, nous avons démontré que l'inhibition de la voie de signalisation PI3K/AKT augmente la susceptibilité neuronale à l'excitotoxicité [19]. AKT est impliqué dans un réseau de signalisation anti-apoptotique complexe [20], dont les composants peuvent être présents à différents endroits subcellulaires en fonction du type de tissu [21,22]. Dans le cœur, l'AKT a été impliquée dans la cardioprotection favorisée par le préconditionnement [23].

Les preuves montrent également que l'AKT phosphorylé favorise la survie neuronale au début de l'ischémie cérébrale [24]. Bien que l'activation de l'AKT puisse contribuer à l'induction de l'informatique dans le cerveau [25], le mécanisme exact impliquant son activation médiée par l'IPC reste insaisissable. Dans les cellules tumorales, l'activation de la voie de signalisation PI3K/AKT conduit à la phosphorylation de MDM2 au niveau de Ser166/186, ce qui favorise la translocation nucléaire de MDM2 [26,27] et améliore son activité d'ubiquitination [28].

Dans le noyau, MDM2 se lie à p53 et favorise son ubiquitination et la dégradation subséquente du protéasome, qui inhibe la fonction de p53 [29]. Dans des conditions de stress, p53 pourrait également déclencher une surexpression de MDM2, qui à l'inverse supprime l'activation de p53 dans une boucle de rétroaction négative [30]. L'inhibition de PI3K empêche l'activation d'AKT [31] et la phosphorylation de MDM2 dans le cœur préconditionné [32].

Dans ce contexte, nous avons précédemment constaté que le préconditionnement cérébral in vivo réduisait le volume de l'infarctus après une occlusion transitoire de l'artère cérébrale moyenne (tMCAO) en augmentant l'expression du niveau de protéine MDM2. Par conséquent, le complexe MDM2–p53 a atténué l'activation induite par l'ischémie de la voie de signalisation p53/PUMA/caspase-3 dans les neurones corticaux primaires [33].

Ici, nous explorons le rôle de la voie de signalisation PI3K/AKT dans la tolérance neuronale médiée par l'IPC contre une lésion ischémique ultérieure, ainsi que le mécanisme sous-jacent, et nous nous concentrons principalement sur le lien potentiel entre l'activation de l'AKT et le complexe MDM2-p53. .

2. Résultats

2.1. Neuroprotection promue par l'IPC

Est médiée par la phosphorylation de l'AKT au niveau de Ser473, la phosphorylation de MDM2 au niveau de Ser166 et la déstabilisation de p53 Ici, nous avons exploré le rôle potentiel de l'AKT sur la neuroprotection médiée par l'IPC en tant que candidat à être impliqué dans la voie MDM2-p53.

Premièrement, nous avons confirmé que l'ischémie favorisait l'activation de l'AKT dans les neurones, comme en témoigne la phosphorylation de l'AKT au niveau de Ser473. Comme le montre la figure 1A, une OGD courte (20 min) a induit de manière significative l'expression de p(Ser473)AKT et MDM2, tandis que les niveaux de protéine AKT sont restés inchangés (figure S1A). Cependant, la phosphorylation de l'AKT n'a pas été observée lorsque les neurones ont été soumis à une OGD prolongée (90 min). De plus, les niveaux de protéine MDM2 étaient plus faibles, ce qui est cohérent avec l'expression plus élevée de la protéine p53, comme le montre la figure 1A.

La régulation à la hausse en fonction du temps de l'expression de Mdm2 après un OGD (Figure 1B) confirme que l'ischémie subaiguë peut être importante pour induire des mécanismes qui empêchent la stabilisation de p53 après un OGD, comme décrit précédemment [33]. Nous avons utilisé une OGD courte (20 min) suivie de 2 h de réoxygénation comme modèle d'IPC (Figure S1B) [33] ; ainsi, nous avons analysé des extraits neuronaux collectés à 4h de réoxygénation après OGD (OGD/R) ou après OGD précédé du protocole IPC (IPC plus OGD/R). En parallèle, les neurones ont été incubés dans des paramètres de normoxie (Nx) ou de préconditionnement (IPC) (Figure S1B).

Comme le montrent la figure 1C et la figure S1C, l'IPC a induit l'activation précoce de l'AKT, comme l'a révélé la phosphorylation au niveau de Ser473 [35], suivie de la stabilisation de la protéine MDM2 et de la phosphorylation au niveau de Ser166. L'IPC a également empêché la stabilisation de p53 induite par OGD/R (figure 1C). Fait intéressant, les images d'immunofluorescence présentées à la figure 1D ont révélé que l'IPC favorisait la phosphorylation de l'AKT au niveau de Ser473 dans les neurones, qui s'accumulait principalement dans le noyau, et diminuait la stabilisation de p53 après OGD/R (IPC plus OGD/R) par rapport aux neurones non préconditionnés (OGD /R).

Par conséquent, l'IPC a empêché l'apoptose neuronale et l'activation de la caspase -3 causées par OGD/R, telles que mesurées par cytométrie en flux (Figure S1D) et dosages de fluorimétrie (Figure S1E), respectivement. Pour confirmer le rôle de p53 dans la neuroprotection médiée par l'IPC, nous avons utilisé des neurones exprimant (de type sauvage ; wt) ou non (knockout ; ko) la protéine p53. Nos résultats montrent que les neurones dépourvus de p53 (Figure S1F) étaient plus résistants à l'apoptose induite par les OGD que les neurones p53 wt.

De plus, les niveaux d'apoptose dans les neurones p53KO étaient similaires à ceux observés dans les neurones wt préconditionnés (IPC plus OGD/R) (Figure S1G), confirmant ainsi le rôle clé de la déstabilisation de p53 dans la neuroprotection médiée par l'IPC [33]. Nos résultats montrent que l'IPC induit une neuroprotection contre une insulte ischémique par un mécanisme qui implique la phosphorylation de l'AKT à Ser473, la stabilisation et la phosphorylation de MDM2 à Ser166 et la déstabilisation de p53.

2.2. IPC déclenche la phosphorylation de MDM2 à Ser166 via la voie PI3K/AKT

La voie de signalisation PI3K/AKT est impliquée dans l'IT neuronale à la fois in vitro [36] et in vivo [37]. Cependant, le rôle de l'activation médiée par l'IPC de la voie PI3K/AKT dans la régulation du complexe MDM2-p53 reste inexploré. Pour clarifier cela, des neurones ont été incubés avec l'inhibiteur irréversible et spécifique de la voie PI3K/AKT, la wortmannine [19].

Comme le montre la figure 2A, la wortmannine a abrogé la phosphorylation IPC-améliorée (Ser473)AKT et la déstabilisation de p53, comme le montre la figure 1D. Ces résultats suggèrent un lien direct entre l'activation de l'AKT et l'inhibition de l'apoptose neuronale médiée par p53- (Figure S1D) et l'activation de la caspase-3 (Figure S1E) induite après OGD/R. Le principal régulateur de la stabilisation de p53, MDM2, est une cible de l'AKT [26], qui phosphoryle MDM2 en Ser166 et Ser186 [26]. L'inhibition de PI3K avec la wortmannine a empêché la phosphorylation de (Ser473)AKT et (Ser166)MDM2 induite par IPC (Figure 2B).

La phosphorylation spécifique médiée par Akt de MDM2 au niveau de Ser166 induite par IPC a été confirmée en utilisant un petit ARN interférent (siRNA) spécifiquement conçu contre la protéine AKT1 (siAkt), hautement exprimée dans les neurones corticaux, et dont l'activité est essentielle à la survie neuronale après ischémie [ 38]. Comme le montre la figure 3, siAkt a réduit les taux totaux de protéines AKT et p(Ser473)AKT au jour 3 après la transfection, à la fois dans les cellules HEK-293T (figure 3A) et dans les neurones corticaux (figure 3B).

De plus, l'inactivation de l'AKT (siAkt) a empêché la phosphorylation de (Ser166) MDM2 (figure 3B). Ces résultats démontrent que la voie de signalisation PI3K/AKT activée par l'IPC favorise la phosphorylation de MDM2 au niveau de Ser166, ce qui peut être responsable de la stabilisation de MDM2 et de la déstabilisation de p53 qui en résulte après une lésion ischémique.

2.3. L'AKT activé par l'IPC déclenche la stabilisation de la protéine nucléaire MDM2 après une ischémie

L'activation de l'AKT a été impliquée dans la translocation nucléaire de MDM2 dans les cellules tumorales [26]. Considérant la pertinence de la stabilisation nucléaire de MDM2 pour la survie neuronale après ischémie [34] et, plus spécifiquement, son rôle neuroprotecteur dans l'IPC [33], nous avons décidé d'étudier plus avant la pertinence de la voie de signalisation PI3K/AKT dans la régulation de la localisation subcellulaire de MDM2. protéine.

Ainsi, des neurones ou des cellules HEK-293T ont été transfectées avec la protéine étiquetée MDM2-humaine (MDM2-GFP). Des transferts représentatifs de cellules HEK -293 T transfectées et des images de neurones exprimant de manière ectopique la protéine MDM2 humaine après quatre conditions expérimentales différentes (Nx, IPC, OGD/R et IPC plus OGD/R) sont illustrés à la figure 4A et à la figure S1H , respectivement.

L'expression ectopique de MDM2- GFP a confirmé que l'IPC favorise l'accumulation nucléaire de MDM2 par rapport aux neurones ischémiques non préconditionnés (OGD/R) ou normoxiques (Nx) (Figure 4A, B), comme l'a révélé la quantification du rapport de fluorescence nucléaire/cytosolique (Figure S2B) et intensité de fluorescence nucléaire de MDM2-GFP (Figure S2C).

2.4. L'IPC favorise l'interaction p(Ser473)AKT et MDM2, ce qui améliore la stabilisation de MDM2 dans le noyau et réduit l'apoptose neuronale induite lors de l'ischémie

Suite à la démonstration du rôle de l'activation renforcée par l'IPC de la voie PI3K/AKT dans la stabilisation nucléaire de MDM2, nous avons en outre étudié si p(Ser473)AKT et MDM2 interagissaient dans le noyau (figure 6A). L'immunoprécipitation de MDM2 à partir d'extraits de protéines nucléaires, suivie d'un immunotransfert contre MDM2 et p(Ser473)AKT, a révélé que l'IPC favorisait l'interaction entre p(Ser473)AKT et MDM2, après OGD/R, empêchant ainsi la stabilisation de p53 nucléaire induite par OGD/R, comme indiqué dans l'entrée de noyau (figure 6A).

Enfin, nous avons étudié l'effet néfaste de la perturbation de la voie PI3K/AKT sur l'apoptose neuronale (figure 6B). L'inhibition de l'AKT a contrecarré l'effet protecteur de l'IPC avant l'OGD, ce qui confirme le rôle neuroprotecteur de l'AKT – MDM2 dans le contexte de l'informatique. Nos résultats démontrent donc que l'IPC induit la phosphorylation et l'activation de l'AKT, ce qui favorise la phosphorylation de MDM2 au niveau de Ser166 et la translocation nucléaire, où il interagit avec p(Ser473)AKT. Ce mécanisme peut contribuer à une meilleure stabilisation nucléaire de MDM2, qui joue un rôle essentiel dans la tolérance ischémique induite par l'IPC.

Comment Cistanche protège-t-il les neurones ?

Certaines preuves suggèrent que Cistanche peut protéger les neurones en réduisant l'apoptose (mort cellulaire programmée) et en favorisant la survie neuronale. L'apoptose est un processus naturel qui se produit dans le corps pour éliminer les cellules endommagées ou indésirables, mais elle peut être nocive lorsqu'elle se produit de manière excessive ou inappropriée. Cistanche s'est avéré inhiber l'apoptose dans des études en laboratoire, et cet effet peut aider à protéger les neurones contre les dommages.

En outre, Cistanche contient un certain nombre de composés bioactifs dont il a été démontré qu'ils ont des effets neuroprotecteurs. Par exemple, il contient de l'échinacoside, dont il a été démontré qu'il protège les neurones du stress oxydatif et de l'inflammation. Il contient également de l'actéoside, qui a des propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes.

À suivre...

Emilia Barrio 1,†, Rebeca Vecino 1,2,†, Irene Sánchez-Morán 1 , Cristina Rodríguez 1,2,3, Alberto Suárez-Pindado 1 , Juan P. Bolaños 1,2,3,4, Angeles Almeida 1, 2,3 et Maria Delgado-Esteban 1,2,3,*

1 Institut de biologie fonctionnelle et de génomique, Université de Salamanque, CSIC, 37007 Salamanque, Espagne ; emibg7@gmail.com (EB); rebecavecino@usal.es (VR) ; irene_sm@usal.es (IS-M.) ; c.rodriguez@usal.es (RC) ; Alsuap77@gmail.com (AS-P.); jbolanos@usal.es (JPB ); aaparra@usal.es (AA)

2 Institut de recherche biomédicale de Salamanque, Hôpital universitaire de Salamanque, Université de Salamanque, CSIC, 37007 Salamanque, Espagne

3 Département de biochimie et de biologie moléculaire, Université de Salamanque, 37007 Salamanque, Espagne 4 Centro de Investigación Biomédica en Red de Fragilad y Envejecimiento Saludable (CIBERFES), Instituto de Salud Carlos III, 28029 Madrid, Espagne * Correspondance : mdesteban@usal.es ; Tél. : plus 34-923-29-4908