L'AKT activé par le préconditionnement contrôle la tolérance neuronale à l'ischémie par la voie MDM2–p53Ⅱ

3. Débat

Nos résultats révèlent que l'activation médiée par l'IPC de la voie de signalisation PI3K/AKT déclenche l'informatique neuronale en contrôlant le complexe MDM2-p53 dans les neurones corticaux primaires. Nous avons d'abord confirmé l'efficacité du préconditionnement en termes de neuroprotection [33,39–41] à l'aide d'un modèle expérimental IPC validé.

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Nous avons constaté que la CPI expérimentale induite par une courte (20 min) de privation d'oxygène et de glucose (OGD) suivie de 2 h de réoxygénation entraînait une neuroprotection, comme le montre la prévention de l'apoptose neuronale et de l'activation de la caspase-3 induite par une OGD (90 min) suivi de 4 h de réoxygénation (OGD/R). Nous montrons que l'IPC réduit l'activation de la caspase -3 dans les neurones corticaux, ce qui est en corrélation avec moins d'apoptose après une insulte ischémique ultérieure et plus grave.

L'équilibre entre les signaux pro- et anti-apoptotiques est fondamental pour assurer la survie neuronale après ischémie [3,33,38,42–44]. Bien que la pertinence de tels événements ait été démontrée dans des modèles d'AVC in vivo hémorragiques et ischémiques [43,45], les mécanismes qui régulent ces voies de signalisation ne sont pas encore entièrement compris dans le contexte de la tolérance ischémique. Le rôle de l'AKT anti-apoptotique et ses voies associées ont été largement étudiés dans les cellules cancéreuses [46,47] et les tissus cérébraux [38,48] ; Cependant, jusqu'à présent, le rôle de la voie de signalisation AKT/MDM2-p53 dans la tolérance neuronale médiée par l'IPC contre les lésions ischémiques reste insaisissable.

Ici, nous avons constaté que l'activation de la voie de signalisation PI3K/AKT causée par l'IPC favorise la phosphorylation de MDM2 au niveau de Ser166, ce qui déclenche sa translocation nucléaire et la stabilisation des protéines, empêchant l'apoptose induite par p53- via l'activation de la caspase-3 après ischémie. L'activation de l'AKT via la phosphorylation favorise la survie neuronale [24,49] et peut contribuer à l'induction de l'IT [25,50]. Nos résultats montrent que l'abondance relative de la protéine AKT est inchangée sous des stimuli ischémiques ou de préconditionnement. Fait intéressant, nous avons constaté que la phosphorylation précoce de l'AKT médiée par PI3K au niveau de Ser473 empêche la stabilisation de p53 induite par l'ischémie dans les neurones préconditionnés.

L'effet n'était pas dû à des modifications des niveaux d'ARNm de p53 [33, 34, 44] mais à une diminution des niveaux de protéine p53 due à l'IPC avant l'OGD/R. Puisque MDM2 est le principal régulateur de la stabilisation de p53 et est également une cible directe de l'AKT, nos résultats soulignent le rôle de la voie de signalisation AKT/MDM2–p53 dans la tolérance neuronale à l'ischémie. L'ARNm de MDM2 augmente rapidement après OGD [34], mais l'activité de MDM2 est principalement contrôlée par des modifications post-traductionnelles, en particulier la phosphorylation [51]. En bon accord avec cela, nous avons constaté qu'une fois activé par phosphorylation après IPC, AKT, à son tour, phosphoryle MDM2 au résidu Ser166, qui est situé près du signal de localisation nucléaire [52], et cet effet est maintenu après une lésion OGD/R.

Nos résultats montrent que la phosphorylation de MDM2 au niveau de Ser166 est suffisante pour exercer l'effet neuroprotecteur médié par l'IPC via la déstabilisation de p53. Ainsi, ici, nous avons identifié une activation dépendante du temps de la voie AKT/MDM2–p53 après une lésion ischémique et, en effet, nous démontrons que l'AKT activé par l'IPC a déclenché la translocation nucléaire de MDM2 ectopique, ainsi que la stabilisation des protéines endogènes.

De plus, l'AKT reste actif dans le noyau, où PI3K pourrait également migrer en réponse au stress oxydatif et alors expliquer la phosphorylation de l'AKT [53]. L'inhibition de la phosphorylation médiée par PI3K de l'AKT ou de l'inactivation de l'AKT favorise la rétention de la protéine MDM2 dans le cytoplasme et empêche la phosphorylation Ser166 de MDM2, ainsi que la neuroprotection médiée par l'IPC contre l'apoptose neuronale induite par l'ischémie. Au contraire, nous avons montré que l'AKT actif se lie à la protéine nucléaire MDM2.

En conséquence, l'AKT actif favorise à la fois les phosphorylations de MDM2 et sa stabilisation nucléaire, qui contribuent à la neuroprotection médiée par l'IPC. Nos résultats révèlent que la neuroprotection favorisée par l'IPC dépendait de l'activation de l'AKT médiée par PI3K, qui phosphorylait MDM2 à Ser166, favorisant l'accumulation nucléaire de MDM2 après une agression ischémique.

En conséquence, l'inhibition de PI3K/AKT par la wortmannine ou la déplétion d'AKT par l'ARNsi a aboli la neuroprotection favorisée par l'IPC, conduisant à la stabilisation de p53 et à l'apoptose neuronale subséquente après l'ischémie. Par conséquent, nos résultats aident à clarifier le rôle essentiel de l'activation IPC-dépendante de la voie AKT – MDM2 dans la survie neuronale contre les lésions ischémiques.

La protéine p53 est impliquée dans le contrôle du pronostic déterminant la mort/survie neuronale chez les patients victimes d'AVC [34,42,54], ainsi que chez les patients AIT [3]. La stabilisation de P53 compromet la neuroprotection médiée par le préconditionnement contre les lésions d'ischémie/reperfusion [33]. L'interaction MDM2-p53 sera donc critique pour la survie neuronale dans ce contexte [34] et pour la tolérance médiée par l'IPC contre les lésions ischémiques [33].

Thus, the control of such interaction will also have an impact on stroke outcomes. In this context, we recently found that a single-nucleotide polymorphism (SNP) 309T>G dans le promoteur MDM2 détermine l'expression de MDM2 et, à son tour, module la récupération des patients souffrant d'AVC [34].

De plus, nous avons observé qu'un SNP du gène Tp53 (rs1042522) module la stabilisation mitochondriale de p53 et la tolérance neuronale à l'ischémie tout en prédisant la récupération fonctionnelle des patients qui subissent un AIT avant un AVC [3]. Par conséquent, le contrôle des voies apoptotiques de p53 sera essentiel pour assurer l'effet neuroprotecteur de l'IPC.

Ces résultats fournissent une approche translationnelle de l'étude qui pourrait être mise en œuvre à l'avenir au profit des patients, et ils posent la voie de signalisation PI3K/AKT-MDM2-p53 comme une cible essentielle pour les stratégies informatiques favorisées par le préconditionnement dans l'AVC ischémique. En résumé, nous démontrons que la voie de signalisation PI3K/AKT améliorée par l'IPC favorise la phosphorylation de MDM2 au niveau de Ser166, conduisant à la translocation nucléaire de MDM2 et à sa stabilisation, ce qui déclenche l'informatique neuronale en favorisant la déstabilisation de p53 et l'inactivation ultérieure de la mort apoptotique induite après insulte ischémique.

Nos résultats mettent en évidence les avantages potentiels de l'activation précoce de l'AKT dans la tolérance neuronale médiée par l'IPC, qui régule la voie apoptotique MDM2 – p53 sous lésion ischémique. Ces résultats mettent en évidence une opportunité de comprendre les mécanismes qui régulent la voie de signalisation neuronale AKT – MDM2 – p53 afin de développer de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour les troubles liés à l'informatique.

4. Matériels et méthodes

4.1. Cultures primaires de neurones corticaux

Des cultures neuronales ont été préparées à partir de cortex d'embryons de souris C57Bl/6J ou p53-null (Tp53−/−, B6.129S2, The Jackson Laboratory) (14.5E). Les neurones ont été ensemencés à 1,8 × 105 cellules/cm2 dans un milieu Neurobasal complété par 2 % de B27 et 2 mM de glutamine (Invitrogen, Madrid, Espagne) et incubés à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2- [ 55].

4.2. Modèles de privation d'oxygène et de glucose et de préconditionnement

Après 9–1{{10}} jours in vitro (DIV), les neurones ont été exposés à une privation d'oxygène et de glucose (OGD) en incubant les cellules à 37 ◦C pendant 90 min dans un incubateur équipé d'un sas et gazé en continu avec 95 % de N2/5 % de CO2. Le milieu d'incubation (solution tamponnée de Hanks sans glucose : 5,26 mM KCl, 0,43 mM KH2PO4, 132,4 mM NaCl, 4,09 mM NaHCO3, 0,33 mM Na2HPO4, 2 mM CaCl2 et 20 mM HEPES, pH 7,4) a été préalablement gazé avec 95 % de N2 /5 pour cent de CO2 pendant 30 min. Dans ces conditions, les concentrations d'oxygène dans le milieu d'incubation étaient de 6,7 ± 0,5 µM, mesurées avec une électrode à oxygène de type Clark [56, 57].

Lorsque cela est indiqué, les neurones ont été exposés à un préconditionnement ischémique (IPC ; OGD court pendant 20 min suivi de 2 h de réoxygénation) avant une ischémie prolongée ultérieure (OGD, 90 min) et 4 h de réoxygénation (IPC plus OGD/R) (Figure S1B ). En parallèle, les neurones ont été incubés en normoxie (Nx) à 37 ◦C dans une atmosphère humidifiée de 95 % d'air/5 % de CO2 ou de préconditionnement ischémique (IPC). Lorsque cela était indiqué, les neurones étaient incubés 30 min avant l'IPC dans une solution tamponnée de Hanks (pH 7,4), en l'absence ou en présence de wortmannine (100 nmol/L), comme décrit précédemment [19].

4.3. Transfections cellulaires

Des neurones (8 DIV) ou des cellules T HEK -293 ont été transfectées avec un vecteur plasmidique exprimant Mdm2 marqué par YFP à partir du promoteur humain MDM2. MDM2p/Mdm2-YFP était un cadeau de Uri Alon & Galit Lahav (plasmide Addgene # 53962, Watertown, MA, USA) [58]. Lorsque requis, un vecteur vide (pYFP) a été utilisé comme contrôle dans les mêmes conditions. La transfection plasmidique a été réalisée à l'aide de Lipofectamine® LTX (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA), conformément aux instructions du fabricant. Les cellules ont été transfectées avec 1,5 µg/µL des vecteurs plasmidiques et utilisées après 24 h.

L'inactivation de l'AKT dans 6 neurones DIV a été obtenue par transfection avec de petits ribonucléotides interférents double brin (ARNsi). Les séquences ciblées étaient les suivantes : 50–CUCAAGUACUCAUUCCAGAtt–30, antisens : 5 0–UCUGGAAUGAGUACUUGAGgg–30 (souris, s62216, correspondant aux nucléotides 1006–1025, numéro d'accès GenBank NM_009652) [59]. Comme contrôle négatif, nous avons utilisé le siRNA Silencer™ Select Negative Control No. 1 (siControl). Tous les siARN ont été achetés auprès d'Ambion®, Invitrogen® et Thermo Fischer Scientific (Offenbach, Allemagne). Selon le degré d'inactivation des protéines, l'efficacité de la transfection de l'ARNsi a été estimée à 70 à 80 % à 3 jours après la transfection. Pour les expériences de silençage, les neurones ont été transfectés avec de l'ARNsi (10 nM) à l'aide de Lipofectamine® RNAiMAX (Invitrogen), en suivant les instructions du fabricant. Les neurones ont ensuite été incubés dans un milieu Neurobasal pendant 72 h avant leur utilisation.

4.4. Détection par cytométrie en flux de la mort cellulaire apoptotique

Les neurones ont été soigneusement détachés des plaques en utilisant du sel tétrasodique d'EDTA 1 mM dans du PBS (pH 7,4) et ont été colorés avec de l'annexine V/APC et du 7-AAD, effectué exactement comme décrit précédemment [55].

4.5. Test d'activité Caspase-3

L'activité caspase-3 a été évaluée dans des lysats cellulaires [33] et selon les instructions du fabricant à l'aide du kit Fluorimetric Assay CASP3F de SIGMA et lue à l'émission à une longueur d'onde de 405 nm. La méthode est basée sur la libération de la fraction fluorescente 7-amino4-méthyl coumarine (AMC). La concentration d'AMC est calculée à l'aide d'un étalon d'AMC.

4.6. Immunoblots et test de co-immunoprécipitation

Les neurones ont été lysés dans un tampon contenant 1 % de SDS, 2 mM d'EDTA, 150 mM de NaCl, 12,5 mM de Na2HPO4 et 1 % de Triton X-100 (NP40 : 1 % de NP40, EDTA diK plus 5 mM, Tris pH{{13 }} mM, NaCl 135 mM et 10 pour cent de glycérol) additionnés d'inhibiteurs de la phosphatase (Na3VO4 1 mM et NaF 50 mM) et d'inhibiteurs de la protéase (fluorure de phénylméthylsulfonyle 100 mM, anti-papaïne 50 µg/mL, pepstatine 50 µg/mL, 50 µg/mL d'amastatine, 50 µg/mL de leupeptine, 50 µg/mL de bestatine et 50 µg/mL d'inhibiteur de trypsine de soja), conservés sur de la glace pendant 30 min et bouillis pendant 5 min. Des aliquotes d'extraits lysés ont été soumises à un gel de polyacrylamide SDS (MiniProtean®, Bio-Rad) et buvardées avec des anticorps pendant une nuit à 4 °C. Les anticorps utilisés étaient anti-AKT (9272), anti-p(Ser473)AKT (9271), anti-caspase clivée-3 (Asp175, 9661) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-p53 ( 554157, BD Biosciences), anti-MDM2 (2A10, ab-16895), anti (Ser166)MDM2 (ab131355), anti-GFP (ab290 ; détecte également YFP) (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-LAMIN B (sc-374015, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Allemagne) et antiGAPDH (Ambion, Cambridge, Royaume-Uni) pendant la nuit à 4 °C. Après incubation avec de l'IgG anti-lapin de chèvre conjuguée à la peroxydase de raifort (Pierce, Thermo Scientific) ou de l'IgG anti-souris de chèvre (Bio-Rad), les membranes ont été immédiatement incubées avec une chimiluminescence améliorée SuperSignal West Dura (Pierce) pendant 5 min avant exposition à Kodak Film XAR-5 pendant 1 à 5 min et les autoradiogrammes ont été scannés. Les intensités de bande ont été quantifiées à l'aide du logiciel ImageJ 1.48v, comme décrit précédemment [60].

Pour le test de co-immunoprécipitation, les neurones ont été lysés dans un tampon glacé contenant du Tris 50 mM (pH 7,5), du NaCl 150 mM, de l'EDTA 2 mM, 1% de NP-40) ​​additionné d'inhibiteurs de phosphatase décrits ci-dessus. Après avoir éliminé les débris par centrifugation, les lysats neuronaux (100 mg) ont été incubés avec 1 mg de l'anticorps pendant 24 h à 4 ◦C suivi de l'ajout de 10 mL de protéine A-agarose (GE Healthcare Life Sciences) pendant 2 h à 4 ◦C. Les immunoprécipités ont été lavés abondamment avec un tampon de lyse et résolus par SDS-PAGE et immunoblottés avec les anticorps indiqués [61]. Les abondances relatives de protéines sont présentées dans la figure S1. Les transferts complets et les analyses de gel sont inclus dans la figure S3.

4.7. Immunocytochimie et analyse d'images

Les neurones ont été cultivés sur des lamelles de verre et fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % (p/v, dans du PBS) pendant 30 min et immunocolorés avec de l'anti-phosphoAKT de lapin (Ser473 ; 9271 ; Cell Signaling, MA, USA), de l'anti-MDM2 de souris (2A10, ab-16895), souris anti-MAP2 (1:500 ; M#1406, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) [55], souris anti-p53 (1:200 ; 554157, BD Pharmingen , San Diego, Californie, États-Unis) et anti-GFP (1:1000 ; ab290 ; également validé pour détecter la YFP). L'immunomarquage a été détecté à l'aide d'anticorps secondaires anti-IgG–Cy3 de lapin ou anti-IgG–Cy2 de souris (1:500 ; Jackson ImmunoResearch. Cambridge, Royaume-Uni).

Les noyaux ont été colorés avec du 40,6-diamidino-2 phénylindole (DAPI ; D9542, Sigma-Aldrich). Les lamelles ont été lavées, montées dans du réactif anti-fade lumière SlowFade (Invitrogen) sur des lames de verre et examinées à l'aide d'un microscope (microscope inversé Nikon Eclipse Ti-E, (NY, USA) équipé d'un objectif 40 ×, d'un illuminateur à fibre pré-centrée Nikon Intensilight C-HGFI, et un appareil photo numérique à couplage de charge noir et blanc Hamamatsu ORCAER ou un microscope confocal laser à balayage ("Spinning Disk" Roper Scientific Olympus IX81, Tokyo, Japon) avec trois lasers 405, 491 et 561 nm, équipé d'un objectif à immersion dans l'huile 40 ×, 63 × et 100 × PL Apo pour l'imagerie haute résolution et l'appareil photo numérique Evolve Photometrics.

Tous les paramètres du microscope ont été réglés pour collecter des images fluorescentes en dessous de la saturation et ont été maintenus constants pour toutes les images prises dans l'expérience. Les images ont été analysées avec le logiciel ImageJ 1.48v (National Institutes of Health). Le pourcentage de neurones p(Ser473)AKT plus et p53 plus et la quantification de l'intensité maximale de fluorescence des protéines de p(Ser473)AKT et p53 sont illustrés à la figure S2A. Dans les neurones transfectés par MDM2-GFP, la distribution nucléocytoplasmique de MDM2-GFP a été calculée comme le rapport de la fluorescence moyenne nucléaire à la fluorescence moyenne cytoplasmique de MDM2 endogène, mesurée dans 24 neurones (six neurones par condition dans quatre cultures neuronales différentes) (Figure S2B) [62].

Pour quantifier l'intensité de fluorescence nucléaire maximale de la coloration MDM2 endogène et de pSer473AKT, 40 neurones (10 neurones par condition dans quatre cultures différentes) ont été mesurés (Figure S2C), comme décrit précédemment [44]. Dans les profils d'intensité représentatifs en coupe transversale illustrés à la figure 5B, le pourcentage de p(Ser473)AKT et de MDM2 indiqué sous chaque condition a été quantifié en tant que fluorescence moyenne nucléaire. Dans tous les cas, les noyaux ont été identifiés par coloration au DAPI. L'intensité de fluorescence nucléaire maximale de MDM2 dans les neurones traités avec de la wortmannine ou du siAkt est illustrée à la figure S2D.

4.8. Analyses statistiques

Les résultats expérimentaux ont été évalués par une analyse de variance unidirectionnelle, suivie du test post hoc de Bonferroni, utilisé pour comparer les valeurs entre plusieurs groupes. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM. Le test t de Student a été utilisé pour les comparaisons entre deux groupes de valeurs. Dans tous les cas, p < 0.05 a été considéré comme significatif (* p < 0,05 versus Nx ; # p<0.05 versus OGD). Statistical analyses were performed using SPSS Statistics 24.0 for Macintosh (IBM).

Comment Cistanche protège-t-il les neurones ?

Certaines preuves suggèrent que Cistanche peut protéger les neurones en réduisant l'apoptose (mort cellulaire programmée) et en favorisant la survie neuronale. L'apoptose est un processus naturel qui se produit dans le corps pour éliminer les cellules endommagées ou indésirables, mais elle peut être nocive lorsqu'elle se produit de manière excessive ou inappropriée. Cistanche s'est avéré inhiber l'apoptose dans des études en laboratoire, et cet effet peut aider à protéger les neurones contre les dommages.

De plus, Cistanche contient plusieurs composés bioactifs dont il a été démontré qu'ils ont des effets neuroprotecteurs. Par exemple, il contient de l'échinacoside, dont il a été démontré qu'il protège les neurones du stress oxydatif et de l'inflammation. Il contient également de l'actéoside, qui a des propriétés anti-inflammatoires et antioxydantes.

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