Prédire le rôle du LncRNA dans le vieillissement rénal sur la base du séquençage de l'ARN Ⅱ

Corrélation de l'ARNnc Gm43360 et de ses ARNm cibles potentiels

LncRNA Gm43360 a été sélectionné pour l’étude car il connectait deux réseaux de coexpression lncRNA-ARNm. Le niveau d'expression d'Adra1a était positivement corrélé (rho=0.8650, p=0.026) avec celui de Gm43360, Csnk1a1 (caséine kinase 1A1) était négativement corrélé (rho{{12 }}.8084, p=0.0084) (Fig. 5a). Pour vérifier davantage la corrélation entre l'ARNnc Gm43360 et ses ARNm cibles potentiels Adra1a et Csnk1a1, un plasmide de surexpression de l'ARNnc Gm43360 a été conçu dans cette étude. L'expression de Csnk1a1 a diminué comme prévu et l'expression d'Adra1a a également diminué, mais pas de manière significative. Ensuite, nous avons renversé lncRNA Gm43360 par siRNA pour détecter si l’expression de ses ARNm cibles était affectée. Comme prévu, Csnk1a1 a augmenté dans les cellules knockdown lncRNA Gm43360 par rapport au groupe témoin négatif siRNA (Fig. 5b). Dix, nous avons détecté le rôle de lncRNA Gm43360 dans le cycle cellulaire. Les résultats du kit de comptage cellulaire -8 (CCK-8) ont montré que lncRNA Gm43360 favorisait la viabilité cellulaire (Fig. 5c). Les résultats ont montré que l'ARNnc Gm43360 augmentait le pourcentage de cellules en phase S et diminuait le pourcentage de cellules en phase G1 par rapport au contrôle négatif (figure 5d). Les protéines p53 et p21 étaient impliquées dans la régulation du cycle cellulaire et étaient ainsi les marques du vieillissement cellulaire. Les niveaux d'expression de p53 et p21 étaient significativement diminués dans le groupe de surexpression par rapport au groupe témoin. Les niveaux d'expression de p53 et p21 étaient significativement augmentés dans le groupe siARN par rapport au groupe témoin siARN (Fig. 5e). La surexpression de l'ARNnc Gm43360 a diminué le nombre de cellules SA- -gal-positives, et les cellules -gal-positives ont augmenté dans le groupe de transfect Gm43360 (Fig. 5f). Pris ensemble, ces résultats indiquent que lncRNA Gm43360 inhibe la sénescence des cellules épithéliales des tubes rénaux eninhiber l'expression de Csnk1a1.

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Discussion

Dans cette étude, nous avons évalué les données d’expression de l’ARNm de reins de souris jeunes et âgées et effectué des analyses de bio-informations révélant les fonctions des ARNm exprimés de manière aberrante. Nous avons observé 347 ARNm régulés positivement et 355 ARNm régulés négativement ainsi que 130 ARNnc régulés positivement et 91 ARNnc régulés négativement dansvieux reins de souris comparés aux reins de jeunes souris. De plus, il a été démontré que ces ARNm sont impliqués dans des voies liées au vieillissement, telles quela phosphorylation oxydative, la voie de signalisation AMPK, la voie de signalisation Wnt, la voie de signalisation Rap1 et les maladies liées à l'âge, qui ont démontré les fonctions des ARNm différentiellement exprimés dans la pathogenèse du vieillissement rénal.

L’ARN long non codant NEAT1 est un facteur protecteur dans la progression de la fibrose rénale dans les cellules épithéliales des tubes rénaux [21]. Par coïncidence, dans nos résultats de séquençage, lncRNA NEAT1 était exprimé à des niveaux inférieurs dans les reins de souris âgées que chez les jeunes souris, ce qui concorde avec les découvertes précédentes. LincRNA-Gm4419 accélère l'inflammation et la fibrose par les mécanismes médiés par l'inflammasome NF-kB/NLRP3 dans la néphropathie diabétique (22). Dans nos résultats de séquençage, nous avons également constaté que l’expression de Gm4419 était plus élevée dans les reins des souris âgées que chez les jeunes souris, mais il n’y avait pas de différence significative. LncRNA Gm43360 est situé sur le chromosome 5 (Chr5 : 122494022–122 494 908, 2 887 pb). Selon l'UCSC Genome Browser, Gm43360 est situé dans l'intron du gène codant pour la protéine Atp2a2. Cependant, aucun rapport n’a été publié à ce jour sur l’implication de l’ARNnc Gm43360 dans des maladies. Dans cette étude, l’inactivation de l’ARNnc Gm43360 a favorisé la sénescence des cellules épithéliales des tubes rénaux. De plus, nous avons identifié de nombreux ARNnc différentiellement exprimés dans les résultats de séquençage et les avons étudiés.

Les ARNlnc ont été classés en régulation cis ou trans-régulation en fonction des mécanismes de régulation des ARNlnc. Les ARNnc agissant en cis pourraient influencer l'expression de gènes voisins en dépendant d'éléments agissant en cis, tels que des promoteurs, des amplificateurs et des séquences régulatrices, qui sont des distances entre les ARNnc et les ARNm inférieures à 100 kb. Les ARNnc agissant en trans font référence aux ARNnc quittant le site de transfection et opérant sur des sites distants (c'est-à-dire que la distance entre les ARNnc et les ARNm est supérieure à 100 kb) [23]. Le lncRNA MAAT augmente l'expression du gène voisin Mbnl1 via un module cis-régulateur (24). Le lncRNA Pnky joue un rôle de régulateur agissant en trans dans le développement cortical (25). Dans cette étude, il existait une relation transrégulatrice entre lncRNA Gm43360 et Csnk1a1. Csnk1a1 est un gène suppresseur de tumeur [26] qui code pour une protéine participant au cycle cellulaire et au processus de division cellulaire [27]. La régulation négative de Csnk1a1 induitinflammatoire associée à la sénescenceréponse avec arrêt de croissance dans les tumeurs colorectales [26]. Csnk1a1 a été régulé négativement lorsque Gm43360 a été régulé positivement ; ainsi, il est probable que lncRNA Gm43360 participe àvieillissement rénalparréguler l'expression de Csnk1a1.

Conclusions

Notre enquête sur le réseau de coexpression lncRNA-ARNm dansvieillissement rénala révélé qu'un lncRNA, lncRNA Gm43360, pourrait jouer un rôle protecteur dans le vieillissement rénal et a élargi notre compréhension des mécanismes impliqués dansvieillissement rénal

Matériels et méthodes

Des échantillons de souris mâles C57BL/6J jeunes (3- mois) et âgées (24- mois) ont été achetés au Centre animalier expérimental de l'Université de Xiamen et ont été élevés dans un environnement standard. Toutes les souris avaient libre accès à la nourriture et à l’eau. Les souris ont été acclimatées à la nouvelle installation pendant un mois avant d'être sacrifiées. Les souris ont été anesthésiées à l'uréthane par injection intrapéritonéale à la dose de 750 mg/kg avant le prélèvement des échantillons. Des souris jeunes et âgées étaient sacrifiées le même jour.Rein résiduel de sourisle tissu a été utilisé pour le séquençage dans chaque test. Le séquençage de l'ARN et l'histopathologie ont été réalisés surreins séparésde la même souris. Le tissu rénal a été prélevé sur des souris. Un rein a été immédiatement immergé dans du formol tamponné neutre à 10 % pour l'inclusion ultérieure des sections, et l'autre rein a été divisé en plusieurs tissus et immédiatement placé dans de l'azote liquide, puis stocké à -80 degré. L'étude a été soutenue par le comité d'éthique du premier hôpital affilié de l'université Xi'an Jiaotong (Shaanxi, Chine) (n° 2018-G-164). Toutes les méthodes ont été appliquées conformément aux directives et réglementations en matière d'éthique animale. Cette étude a été réalisée conformément aux directives ARRIVE.

Histopathologie rénale

Des échantillons de tissus rénaux de souris jeunes et âgées ont été fixés dans une solution à 1 0 % de paraformaldéhyde pendant la nuit. Dix des coupes ont été déshydratées, incluses en paraffine et sectionnées à une épaisseur de 4- µm. Les colorations trichromatiques PAS et Masson ont été réalisées en utilisant des protocoles standards. Les images ont été capturées par la caméra et la zone de coloration positive a été mesurée. La zone des images de la caméra d'histopathologie a été calculée avec Image-Pro Plus 6.0.

Coloration SA‑‑gal

L'activité SA{{0}}gal a été analysée à l'aide d'un kit de coloration SA- -gal (Cell Signaling Technology #9860) selon le protocole du fabricant. La zone de coloration positive a été mesurée et les cellules SA- -gal-positives ont été calculées à l'aide d'Image-Pro Plus 6.0.

Construction et séquençage d'une bibliothèque d'extraction d'ARN

Samples (each 5 mice in young and old mice) were used for lncRNA and mRNA expression analyses. Young mice were numbered 3M1, 3M2, 3M3, 3M4, and 3M5, and old mice were numbered 24M1, 24M2, 24M3, 24M4, and 24M5. Total RNA was extracted using Trizol reagent (thermofsher, 15,596,018) following the manufacturer's instruction. The total RNA quantity and purity were analyzed of Bioanalyzer 2100 and RNA 6000 Nano LabChip Kit (Agilent, CA, USA, 5067−1511), and high-quality RNA samples with RIN number>7.0 ont été utilisés pour construire une bibliothèque de séquençage. Après extraction de l'ARN total, l'ARNm a été purifié à partir de l'ARN total (5 µg) en utilisant Dynabeads Oligo (dT) (Thermo Fisher, CA, USA) avec deux cycles de purification. Après purification, l'ARNm a été divisé en fragments courts à l'aide de cations divalents à haute température (module de fragmentation d'ARN en magnésium (NEB, cat. e6150, USA) à 94 degrés 5-7 min). Ensuite, les fragments d'ARN clivés ont été soumis à une transcription inverse pour obtenir l'ADNc par la SuperScript™ II Reverse Transcriptase (Invitrogen, cat. 1 896 649, USA), qui ont ensuite été utilisés pour synthétiser des ADN deuxième brin marqués à l'U avec l'ADN polymérase I d'E. coli ( NEB, cat.m0209, USA), RNase H (NEB, cat.m0297, USA) et solution dUTP (Termo Fisher, cat.R0133, USA). Une base A a ensuite été ajoutée aux extrémités émoussées de chaque brin, les préparant à la ligature aux adaptateurs indexés. Chaque adaptateur contenait un surplomb de base T permettant de ligaturer l'adaptateur à l'ADN fragmenté à queue A. Des adaptateurs à double indice ont été ligaturés aux fragments et la sélection de la taille a été effectuée avec des billes AMPureXP. Après le traitement par l'enzyme UDG thermolabile (NEB, cat.m0280, USA) des ADN deuxième brin marqués à l'U, les produits ligaturés ont été amplifiés par PCR dans les conditions suivantes : dénaturation initiale à 95 degrés pendant 3 min ; 8 cycles de dénaturation à 98 degrés pendant 15 s, recuit à 60 degrés pendant 15 s et extension à 72 degrés pendant 30 s ; puis extension finale à 72 degrés pendant 5 min. La longueur moyenne d'insertion pour les bibliothèques d'ADNc finales était de 300 ± 50 pb. Enfin, nous avons effectué le séquençage à extrémités appariées de 2 × 150 pb (PE150) sur un Illumina Novaseq™ 6000 (LC-Bio Technology CO., Ltd., Hangzhou, Chine) selon le protocole du fabricant (28).

Analyse bioinformatique Séquence et filtrage des lectures propres

Une bibliothèque d'ADNc construite par technologie à partir de l'ARN regroupé deéchantillons de reinde souris a été séquencée et analysée avec la plateforme de séquence Illumina NovaseqTM 6000. En utilisant l'approche RNA-seq à extrémités appariées d'Illumina, nous avons séquencé le transcriptome, générant un total de millions de lectures à extrémités appariées de 2 × 150 pb. Les lectures obtenues à partir des machines de séquençage incluent des lectures brutes contenant des adaptateurs ou des bases de mauvaise qualité qui affecteront l'assemblage et l'analyse suivants. Ainsi, pour obtenir des lectures propres de haute qualité, les lectures ont été filtrées davantage par Cutadapt [29] (https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/, version:cutadapt-1.9). Les paramètres étaient les suivants :

1) supprimer les lectures contenant des adaptateurs ;

2) supprimer les lectures contenant polyA et poly ;

3) supprimer les lectures contenant plus de 5 % de nucléotides inconnus (N) ;

4) supprimer les lectures de mauvaise qualité contenant plus de 20 % de bases de mauvaise qualité (valeur Q inférieure ou égale à 20).

La qualité de dix séquences a été vérifiée à l'aide de FastQC [30] (//www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/ fastqc/, 0.11.9). y compris le contenu Q20, Q30 et GC des données propres. Après cela, un total de G pb de lectures nettoyées et appariées ont été produites. Les données de séquence brutes ont été soumises aux ensembles de données NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) portant le numéro d'accès GSE154223.

Le génome/annotation de référence était Mus_musculus.GRCm38. La source et la version de l'annotation du gène utilisée pour les analyses étaient Ensembl_v88.

Assemblage des transcriptions

Premièrement, Cutadapt [29] a été utilisé pour supprimer les lectures contenant une contamination par l'adaptateur, des bases de mauvaise qualité et des bases indéterminées. La qualité de dix séquences a été très alimentée à l'aide de FastQC (//www.bioinformatics.Babra ham.ac.uk/projects/fastqc/). Nous avons utilisé Bowtie2 [31] et Hisat2 [32] pour cartographier les lectures sur le génome de la souris. Les lectures cartographiées de chaque échantillon ont été assemblées à l'aide de StringTie [33]. Dix, toutes les transcriptions deéchantillons de reinont été fusionnés pour reconstruire un transcriptome complet à l'aide de scripts Perl. Une fois le transcriptome final généré, StringTie [33] et edgeR [34] ont été utilisés pour estimer les niveaux d'expression de tous les transcrits.

Identification de l'ARNlnc

Tout d’abord, les transcrits qui chevauchaient des ARNm connus et les transcrits de moins de 200 pb ont été rejetés. Ensuite, nous avons utilisé CPC [35] et CNCI [36] pour prédire les transcriptions ayant un potentiel de codage. Tous les relevés de notes avec score CPC<-1 and CNCI score<0 were removed. The remaining transcripts were considered as lncRNAs.

Analyse des gènes d'analyse différentiellement exprimés (DGE)

StringTie [33] was used to perform expression levels for mRNAs and lncRNAs by calculating FPKM [37]. Genes differential expression analysis was performed by DESeq2 software between two different groups (and by edgeR between two samples) [34, 38]. The genes with the parameter of q value below 0.6 and absolute fold change>2 étaient considérés comme des gènes différentiellement exprimés.

Prédiction des gènes cibles et analyse fonctionnelle des ARNnc

Pour explorer la fonction des ARNnc, nous avons prédit les gènes cis-cibles des ARNnc. Les LncRNA peuvent jouer un rôle cis en agissant sur les gènes cibles voisins. Dans cette étude, les gènes codants dans 100,000 en amont et en aval ont été sélectionnés par script Perl. Ensuite, nous avons montré une analyse fonctionnelle des gènes cibles des lncRNA en utilisant les scripts BLAST2GO (39). Le lien complet des commandes vers le domaine public était Jie-Li/README.md sur main · dandan-li/Jie-Li (github.com).

Catégories d'ontologie génétique (GO) et analyse de l'Encyclopédie des gènes et génomes de Kyoto (KEGG)

L'analyse bioinformatique pour le séquençage de l'ARN a été réalisée à l'aide des outils OmicStudio (//www.omicsudio.cn/tool). L'analyse d'enrichissement fonctionnel de Gene Ontology (GO) et l'analyse d'enrichissement de l'Encyclopédie de Kyoto des gènes et des génomes (KEGG) [37–39] ont été utilisées pour analyser les fonctions biologiques des gènes cibles prédits. L'analyse GO clarifie les principaux processus biologiques à travers trois aspects : la composition cellulaire, les fonctions moléculaires et les processus biologiques (//www.geneontology.org/). L’analyse place d’abord tous les gènes différentiellement exprimés et les gènes de fond dans la base de données GO. Chaque élément est cartographié, le nombre de gènes dans chaque élément est calculé et la distribution hypergéométrique est utilisée pour effectuer des tests d'hypothèse afin d'obtenir la valeur P du résultat d'enrichissement. Plus la valeur P est faible, plus le résultat de l’enrichissement est significatif. KEGG est une base de données qui analyse les ARNm différentiellement exprimés par biologie génétique pour explorer des voies importantes liées aux gènes cibles (https://www.genome.jp/kegg/). Les résultats sont exprimés par des valeurs p ; plus la valeur p est faible, plus le résultat de l’enrichissement est significatif.

qRT–PCR

GAPDH a été utilisé comme contrôle endogène. Ensuite, les niveaux d’expression relatifs de gènes inconnus ont été calculés. Toutes les amorces ont été conçues et synthétisées spécifiquement pour cette expérience. Des amorces pour GAPDH ont été commercialisées. La spécificité des amorces Adra1a et Csnk1a1 a été identifiée par le pic unique de la courbe de fusion.

Construire un réseau de coexpression ARNm-lncARN

La transrégulation était basée sur la recherche, puis l'énergie trans a été calculée. Plus l’énergie trans était faible, plus la possibilité de liaison était élevée. Ensuite, le coefficient de corrélation ARNm-ARNnc a également été calculé. Le réseau ARNm-ARNnc a été construit en choisissant un coefficient de corrélation de Spearman supérieur à 0.9. Le réseau de coexpression ARNm-lncARN a été construit à l'aide du logiciel Cytoscape (v3.7.1).

Culture de cellules

Des cellules épithéliales tubulaires proximales rénales de souris (MRPT-EpiC) ont été cultivées dans un milieu de cellules épithéliales-animal (EpiCM-a, Cat. #4131) contenant 2% de sérum bovin fœtal (FBS, Cat. #0010) et un supplément de croissance de cellules épithéliales-animal (EpiCGS-a, Cat. #4182) sans antibiotiques dans un incubateur humidifié à 37 degrés et 5 % de CO2. Le milieu de culture a été changé tous les 2 à 3 jours. Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été repiquées lorsque la croissance a atteint 90 %. La suspension cellulaire digérée par la trypsine a été ensemencée dans des plaques à 6-puits avec 2*104 -5*104 cellules dans chaque puits. Les cellules utilisées pour la transfection étaient toutes entre les générations 2 et 5.

Construction plasmidique et transfection cellulaire

Le plasmide de surexpression lncRNA Gm43360 a été construit par GeneChem (Shanghai, Chine). Le squelette plasmidique était GV658 et le promoteur CMV pilotait l’expression de lncRNA. La séquence nucléotidique clonée est fournie dans le matériel supplémentaire. Pour l'inactivation de lncRNA Gm43360, trois lncRNA ENS DOIVENT00000197656-cibler les siARN (lncRNA Gm43360- siRNA1, 5'-CCUUCACUCCAGCUGGUAATT-3' ; lncRNA Gm43360-siRNA2, 5'-CCCUGUCACUCA UGAAGUUTT-3' ; et lncRNA Gm43360-siRNA3, 5'-GGUCAAUUAACUCAAUGGGTT-3') ont été conçus et synthétisés chez GenePharma (Shanghai, Chine). Selon le protocole du fabricant, les cellules ont été transfectées avec 2 500 ng de plasmide ou 100 pmol de siARN avec 6 µl de réactif de transfection Lipofectamine™ 2000 (Invitrogen, USA) par puits. Les niveaux d'expression d'ARN et de protéines ont été détectés 48 heures après la transfection et chaque expérience a été répétée au moins trois fois. La PCR quantitative en temps réel a été utilisée pour valider l’efficacité de la surexpression et de l’inactivation de lncRNA Gm43360.

Analyse par Western Blot

Les cellules cultivées ont été lavées avec du PBS glacé, 120 µl de tampon RIPA (Heart, Chine) ont été ajoutés, et un inhibiteur de protéase et du PMSF (Heart, Chine) ont été ajoutés pendant 30 minutes sur de la glace. Après avoir collecté les cellules dans différents tubes de microcentrifugeuse, la concentration en protéines a été quantifiée. Un tampon de chargement a été ajouté à chaque échantillon, puis bouilli pendant 7 minutes. Trente microgrammes de l'échantillon ont été séparés par SDS – PAGE à 12% (Beyotime, Chine) et électrotransférés sur des membranes PVDF (Thermo Fisher, USA). Ensuite, les membranes ont été bloquées avec du lait à 5 %. Les membranes ont été incubées avec des anticorps primaires spécifiques : anti-p21 (1 : 1000, Abcam, ab109199), anti-p53 (1 : 1000, Proteintech, 10442-1-AP) et anti-GAPDH (1 : 3000, Profintech , 60004-1-Ig) pendant la nuit à 4 degrés. Après lavage au TBST, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. Les bandes de protéines ont été observées à l'aide d'un kit de chimiluminescence (Millipore, USA). L'expression de GAPDH a été utilisée pour normaliser les niveaux de protéines.

Test de prolifération cellulaire

La capacité de prolifération cellulaire a été déterminée par le test du kit de comptage cellulaire-8 (CCK-8). Quarante-huit heures après la transfection, 90 µl de nouveau milieu et 10 µl de solution CCK-8 ont été ajoutés à chaque puits (Beyotime, C0042). Les cellules ont été incubées pendant 1 à 4 heures à 37 degrés dans 5 % de CO2 et mesurées à 450 nm par un lecteur de microplaques universel (Bio-Tek, USA).

Analyse cytométrique en flux

Les cellules ont été étalées dans des plaques à 6- puits la veille de la transfection. Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été trypsinisées et centrifugées à 1 000 tr/min pendant 5 min. Ensuite, les cellules ont été fixées dans de l’éthanol à 70 % à 4 degrés pendant au moins 4 h. Après centrifugation, une solution de coloration de RNase A et d'iodure de propidium (PI) a été ajoutée aux cellules, puis les cellules ont été incubées pendant 30 minutes à température ambiante dans l'obscurité. Les cellules colorées au Te ont été analysées à l'aide d'un ACEA NovoCyte (Biosciences, USA).

analyses statistiques

Les données de mesure selon la distribution normale sont présentées sous forme de moyenne ± écart type. La différence entre les deux groupes différents a été déterminée à l'aide de tests t de Student bilatéraux non appariés, et une valeur p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Tous les calculs ont été effectués à l'aide de GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, Inc., USA).

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