Effets préventifs des glycosides de phényléthanol de Cistanche Tubulosa

Contact : Audrey Hu Whatsapp/hp : 0086 13880143964 E-mail :audrey.hu@wecistanche.com

Shu-Ping You, et al

Résumé

Arrière plan:Cistanchetubuleuxest une phytothérapie traditionnelle chinoise largement utilisée pour réguler l'immunité.Phényléthanolglycosides(CPhG) de cette plante sont les matériaux les plus efficaces. Le but de cette étude était d'évaluer les effets préventifs et thérapeutiques des CPhG sur la fibrose hépatique induite par la BSA chez le rat et les mécanismes moléculaires associés impliquant les cellules étoilées hépatiques. Le Biejiarangan (BJRG), une autre plante médicinale traditionnelle chinoise, a été utilisé comme témoin positif.

Méthodes :Dans des expériences in vivo, 75 rats SD ont été divisés au hasard en 6 groupes : normal (traité à l'eau distillée), modèle (traité à la BSA), médicament positif (traité à la BSA plus BJRG 600 mg/kg/jour) et traité à la BSA plus les groupes CPhG (125, 250 et 500 mg/kg/jour). Les indices hépatique et splénique, les taux sériques d'aspartate aminotransférase (AST), d'alanine aminotransférase (ALT), d'acide hexadécénoïque (HA), de laminine (LN), de procollagène de type III (PCIII), de type IVcollagène (IV-C), d'hydroxyproline (Hyp ) et le facteur de croissance transformant 1 (TGF- 1) ont été mesurés dans le foie des rats. Les grades histopathologiques de la fibrose hépatique ont été évalués pour chaque groupe à l'aide de la coloration H&E et du trichrome de Masson. L'expression du TGF- 1, du collagène I (Col-I) et du collagène III (Col-III) a été déterminée par une méthode de coloration immunohistochimique. Ces effets ont ensuite été évalués in vitro en déterminant les niveaux d'expression de NF-κB p65 et Col-I par des analyses PCR quantitatives en temps réel. L'expression de la protéine Col-I a également été examinée par western blot.

Résultats: Tous les groupes de doses (125, 250 et 500 mg/kg/jour) de CPhG ont réduit de manière significative l'indice du foie et de la rate, ont diminué l'ALT, l'AST, l'HA, la LN , PCIII, taux sériques IV-C, teneur en TGF- 1 (P < 0.01,="" p="">< 0.01="" et="" p="">< 0,01)="" et="" hyp="" contenu.="" les="" cphg="" ont="" également="" nettement="" atténué="" le="" gonflement="" des="" cellules="" hépatiques="" et="" prévenu="" efficacement="" la="" nécrose="" des="" hépatocytes="" et="" l'infiltration="" des="" cellules="" inflammatoires.="" les="" résultats="" immunohistochimiques="" ont="" montré="" que="" les="" cphg="" réduisaient="" de="" manière="" significative="" l'expression="" de="" tgf-="" 1="" (p="">< 0,01,="" p="">< 0,01="" et="" p="">< 0,01),="" col-i="" et="" col-iii.="" les="" effets="" in="" vitro="" des="" cphg="" (100,="" 75,="" 50="" et="" 25="" ug="" ml)="" sur="" hsc-t6="" ont="" montré="" que="" les="" cphg="" réduisaient="" de="" manière="" significative="" l'expression="" de="" l'arnm="" de="" nf-κb="" p65="" et="" col-i,="" et="" que="" les="" cphg="" réduisaient="" également="" l'expression="" de="" la="" protéine="">

Conclusion :Les CPhG ont un effet anti-fibrose hépatique significatif et peuvent être utilisés comme agents hépatoprotecteurs pour le traitement de la fibrose hépatique.

Mots clés:Fibrose hépatique,Cistanche tubuleuse,Phényléthanolglycoside,Chemokine BSA, Prévention et thérapie

PhényléthanolglycosidedansCistanchetubuleux

Arrière plan

La fibrose hépatique est une réponse de cicatrisation à une lésion hépatique grave qui se produit dans la pathogenèse de l'hépatite chronique induite par divers facteurs. Ces facteurs sont l'infection virale, l'abus d'alcool, la cholestase et les maladies métaboliques et auto-immunes [1–3]. L'accumulation progressive de matrice extracellulaire (ECM) et la diminution du remodelage perturbent l'architecture normale du foie, entraînant une fibrose hépatique [4]. La fibrose hépatique est critique dans les maladies chroniques du foie et se développe souvent en cirrhose irréversible et en carcinogenèse. À l'heure actuelle, il n'y a pas de méthodes ou de médicaments efficaces pour le traitement de la fibrose hépatique. Par conséquent, il est urgent de trouver un médicament anti-fibrose hépatique qui atténuera la progression des lésions hépatiques vers la fibrose et le cancer.

CistanchetubuleuxW (de la famille des Orobanchaceae) est une plante parasite largement cultivée dans la région sud du Xinjiang en Chine [5]. Les gens l'utilisent généralement pour revigorer les reins, nourrir le sang, détendre l'intestin et retarder la sénescence. Il est officiellement répertorié dans la pharmacopée chinoise [6].Cistanchetubuleuxcontient une variété de composants actifs. Ceux-ci inclusPhényléthanolglycosides(CPhG), des iridoïdes et des polysaccharides. L'un des nombreux composants actifs deCistanchetubuleux, CPhGsont montré des effets antioxydants, anti-fatigue, neuroprotecteurs et anti-inflammatoires convaincants dans des études in vivo et in vitro [7]. Ces dernières années, il a été rapporté que les CPhG ont des effets hépatoprotecteurs. Les mécanismes potentiels sous-jacents à ces effets sont le piégeage des radicaux libres, la protection des membranes hépatiques, l'immunorégulation, l'inhibition de l'apoptose, l'inhibition de l'expression de HBsAg et HBeAg, et l'inhibition de la réplication de l'ADN du VHB et autres [8-11]. Cependant, peu d'études dans la littérature traitent de l'effet anti-fibrose hépatique des GPhC. Par conséquent, cette étude visait à étudier l'effet anti-fibrose hépatique des GPhC en utilisant un modèle de fibrose hépatique induite par l'albumine sérique bovine (BSA) chez le rat. Les mécanismes moléculaires associés ont été étudiés dans les cellules HSC-T6.

Méthodes

produits chimiques et réactifs

Un kit Hydroxyproline (hydrolyse alcaline) (Lot : 20140616) a été acheté auprès du Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Chine). Les kits ELISA sandwich TGF- 1 de rat (lot : 238240615) ont été achetés auprès de Lianke Biotech Co., Ltd. (Chine). L'anticorps Rabbit Anti-CollagenI (Lot : 140619), l'anticorps Rabbit Anti-Collagen III (Lot : 980788 W) et l'anticorps Rabbit Anti-TGF- 1 (Lot : 140619) ont été fournis par Beijing BiosynthesisBiotechnology Co., LTD ( Chine). Inclus avec du sérum de mouton normal (liquide de travail) (Lot : WP141214), PV-6000(Lot : WK141225) et le kit DAB (Lot : K136621D) ont été achetés auprès de Zhongshan Golden Bridge BiotechCo., Ltd. (Chine). La détection des anticorps primaires a été réalisée en utilisant 2. Solution d'anticorps (Alk-Phos. Conjugué, Anti-lapin) et 2. Solution d'anticorps (Alk-Phos. Conjugué, Anti-souris) (lot : 272387) achetée auprès de la société Invitrogen (États-Unis) .

L'albumine de sérum bovin (BSA) (Lot : SLBG8239V) a été achetée auprès de Sigma (USA). Avant utilisation, la BSA a été préparée à 18 g/L dans une solution saline normale, les bactéries ont été éliminées par filtration et la BSA a été stockée à 4 degrés. L'adjuvant incomplet de Freund contenant 1 g de lipide de poils de mouton (Lot : AF0220LA14, Shanghai yuan ye Bio-Technology Co., Ltd. (Chine) a été mélangé avec 2 g de paraffine liquide (Lot : 20130815, Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., (Chine), stérilisé dans un autoclave à vapeur et stocké à 4 degrés. Le médicament positif BJRG a été obtenu sous forme de comprimés Biejiarangan de Inner Mongolia Furui Medical Science Co., Ltd. (Chine). Les stocks de médicaments BJRG ont été préparés en dissolvant des comprimés BJRG dans eau distillée à une concentration de 600 mg/kg.

Phényléthanol glycosidedansCistanchea des effets préventifs

Matières végétales

Cistanche tubuleux(famille Orobanchaceae) a été achetée dans la région de Minfeng au Xinjiang en Chine. Le matériel a été authentifié par le chercheur Jun Zhao, Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of Materia Medica of Xinjiang. Des spécimens de bon ont été déposés à l'Institut de Materia Medica du Xinjiang.

Préparation des CPhG

Rhizomes séchés et tranchés deCistanchetubuleux(6,0 kg) ont été extraits consécutivement au reflux trois fois avec de l'éthanol à 70 %, et le solvant a été éliminé pour donner l'extrait à l'éthanol. Les extraits d'éthanol ont été purifiés en utilisant de la résine AB-8 pour obtenir lephényléthanoïdeglycosides(CPhG). Les solutions mères de CPhG utilisées pour différents groupes de doses dans les études animales (500 mg/kg, 250 mg/kg et 125 mg/kg, respectivement) ont été dissoutes dans 0,5 % (5 g/L) de carboxyméthylcellulose ( Le sel de sodium).

Quantification des CPhG

Le contenu de deux composants (échinacoside et actéoside) dans les CPhG a été déterminé par HPLC en utilisant une méthode rapportée précédemment (Zhang et al. 2004)[12]. La HPLC a été réalisée à l'aide d'un Shimadzu LC-10AHPLC équipé d'un détecteur UV. La colonne HPLC était une colonne Phenomenex Gemini ODS (250 × 4,6 mm, 5 μm). La phase mobile isocratique consistait en méthanol-acétonitrile-1 pour cent d'acide acétique (15:10:75, v/v/v). L'élution a duré 40 min et le débit a été maintenu à 0,6 mL/min. La température de la colonne a été maintenue constante à 30 degrés. La détection UV était à 334 nm.

Animaux et lignée cellulaire HSC-T6

[Grade SPF] Des rats Sprague-Dawley (SD) mâles adultes en bonne santé (180-220 g) ont été achetés auprès du Xinjiang MedicalUniversity Animal Center, numéro de licence : SCXK (nouveau) 2011-0004. Les rats ont été nourris avec une nourriture sans pathogène spécifique (SPF). Toutes les procédures liées aux expérimentations animales ont été approuvées par le Comité d'éthique animale du premier hôpital affilié de l'Université médicale du Xinjiang. Les rats ont été logés dans des cages dans des conditions environnementales contrôlées (25 degrés et un cycle lumière / obscurité de 12 h) et avaient libre accès à la nourriture standard en granulés pour rats et à l'eau du robinet. Les rats ont été acclimatés avant le traitement.

Une lignée cellulaire étoilée hépatique de rat immortalisée, HSC-T6, a été obtenue auprès de Wuhan Procell Gene Biotechnology Co., LTD. (Wuhan, Chine). Les cellules HSC-T6 ont été cultivées dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (High Glucose) (DMEM, Pékin, Chine) additionné de 10 % de sérum fœtal bovin (Gibco, Amérique du Sud), de 100 UI/ml de pénicilline et de 100 ug/ml de streptomycine (Pékin, Chine). ) dans un incubateur humidifié à 37 degrés avec 5 % de CO2.

Lésions hépatiques induites par la BSA et traitements

Soixante-quinze rats SD ont été répartis au hasard en six groupes : normal (traité à l'eau distillée), modèle (traité à la BSA), médicament positif (traité à la BSA plus BJRG 600 mg/kg/jour) , et traités par BSA plus CPhG (125, 250, 500 mg/kg/jour). Les groupes traités par BSA plus CPhG (125, 250, 5 00 mg/kg/jour) avaient 13 rats dans chaque groupe, et l'autre groupe avait 12 rats dans chaque groupe. Le modèle de lésion hépatique induite par la BSA est divisé en une sensibilisation primaire suivie d'une attaque immunologique) [13]. À l'exception du groupe normal, les autres groupes ont reçu des injections sous-cutanées multiples avec 0,5 ml (9 mg/ml) d'adjuvant incomplet de BSAFreund le jour 1, le jour 15, le jour 22, le jour 29 et le jour 36 pour la sensibilisation primaire. Sept jours après la cinquième injection, du sang a été prélevé par le plexus veineux rétinien du rat et testé pour les anticorps anti-albumine sérique. L'anticorps BSA dans le sérum de rat a été détecté par une double méthode de diffusion sur gélose. L'injection d'attaque a été réalisée en administrant 0,4 ml de BSA dans une solution saline normale par la veine caudale chez des rats positifs pour l'anticorps BSA deux fois par semaine pendant dix fois. Les concentrations et les temps d'injection étaient de 5,00, 5,50, 6,00, 6,50, 7,00, 7,50, 8,50, 9,00, 9,50 et 10,00 g/L au jour 46 , jour 50, jour 53, jour 57, jour 60, jour 64, jour 67, jour 71, jour 74 et jour 78, respectivement. Dans le groupe normal, une solution saline normale a été utilisée pour les injections immunologiques primaires (sensibilisation) et secondaires (attaque) au lieu de BSA, et les autres conditions étaient les mêmes que celles du groupe modèle.

Le groupe normal a reçu de l'eau distillée par voie orale avec une dose de 10 ml/kg/jour. Le groupe modèle a reçu par voie orale 10 ml/kg/jour de solution de CMC-Na à 0,5 pour cent. Le groupe de médicament positif a reçu par voie orale 600 mg/kg/jour de BJRG. Les groupes traités par BSA plus CPhG (125, 250 et 500 mg/kg/jour) ont reçu par voie orale 125, 250 et 500 mg/kg/jour de CPhG, respectivement. L'administration quotidienne aux rats s'est poursuivie pendant deux semaines après la dernière injection.

Après la période expérimentale, les rats ont été mis à jeun pendant 12 h avant de recevoir 10 % d'hydrate de chloral, puis immédiatement euthanasiés. Des échantillons de sérum ont été prélevés sur chaque rat et immédiatement utilisés. Les foies ont été récoltés à deux fins : (1) conservation dans de l'azote liquide pour les kits Hyp et (2) fixation dans du formaldéhyde à 10 % pour les examens histologiques et immunohistochimiques. La durée totale des études animales était de 93 jours.

Phényléthanol glycosidedansCistanchea des effets préventifs

Indices du foie et de la rate

Le foie et la rate ont été disséqués par laparotomie et lavés avec des solutions salines normales à 4 degrés. Après avoir absorbé l'excès d'eau avec du papier filtre, le foie et la rate ont été pesés pour calculer les indices correspondants : poids relatif de l'organe=masse de l'organe (g)/masse corporelle individuelle (g) × 100 % [14].

Analyse des marqueurs de la fibrose hépatique

L'effet protecteur des CPhG contre les lésions hépatiques induites par la BSA a été évalué en mesurant l'ALT et l'AST (analyseur biochimique automatique Mind ray, A086A0182). Le développement de la fibrose hépatique et les effets du traitement ont été déterminés en examinant HA, LN, PC III et IV-C (analyseur de chimiluminescence, TaiGeKeXin, MP2808).

Contenu Hyp et analyse TGF- 1

Le niveau d'Hyp dans le tissu hépatique a été déterminé par une méthode spectrophotométrique conformément aux instructions du kit. Le niveau d'Hyp a été exprimé en Hyp (ug)/protéine (mg).Hyp (ug/mg)=(OD mesurée - DO blanc)/(DO standard DO blanc)×5 (ug/ml) × 10/poids humide du tissu (ml/mg). La concentration hépatique de TGF- 1 a été détectée en utilisant des kits ELISA selon les instructions du fabricant. L'effet inhibiteur des CPhG sur la fibrose a été confirmé par les niveaux d'expression de TGF- 1.

Examen histopathologique

Le tissu hépatique dans la même partie du lobe gauche a été réséqué et fixé dans une solution de formaldéhyde à 10 %. Les tissus ont été colorés avec une coloration H&E conventionnelle et au trichrome de Masson pour observer les changements histopathologiques sous un microscope optique. L'expression du collagène de type I, du collagène de type III et du TGF- 1 dans les tissus hépatiques a été analysée par coloration immunohistochimique [15].

L'immunohistochimie semi-quantitative a été réalisée selon les méthodes rapportées [16, 17]. Les classifications suivantes ont été utilisées pour les cellules positives TGF- 1 : "-" indique presque aucune expression, 20=l ; " plus " indique des cellules positives rassemblées individuellement dans la zone de lésion, 21=2 ; « plus plus » indique des cellules positives en petits groupes rassemblés autour de la zone de la lésion, 22=4 ; " plus plus plus " indique des cellules positives dispersées exprimées, comme 23=8. Les résultats représentent une intégration hiérarchique. Le degré et la portée chromogéniques du collagène de type I et du collagène de type III ont été convertis en IRC pour une analyse statistique (degré chromogénique × plage chromogénique). Le degré chromogénique est divisé en « plus » faible, modéré « plus plus » et fort « plus plus plus ». La plage chromogénique est divisée en " plus ", sa plage chromogénique < vue="" 1/4 ;="" "="" plus="" plus="" ",="" sa="" plage="" de="" vision="" chromogénique/4-2/4 ;="" "="" plus="" plus="" plus="" ",="" son="" champ="" de="" vision="" chromogénique="" 2/4-3/4 ;="" "="" plus="" plus="" plus="" plus="" ",="" sa="" plage="" chromogénique=""> 3/4. La notation en aveugle a été effectuée par deux personnes où "plus" est 1 ; " plus plus " vaut 2, " plus plus plus " vaut 3 et " plus plus plus plus " vaut 4. Trois champs d'observation au microscope (grossissement × 200) ont été sélectionnés au hasard pour chaque section, le niveau moyen des échantillons étant utilisé comme critère. niveau semi-quantitatif.

Expériences cellulaires

Les cellules HSC-T6 ont été étalées dans une plaque à puits 96-. Initialement, les cellules ont été cultivées avec du DMEM contenant 10 % de FBS pendant 48 h. Le milieu a ensuite été remplacé par du DMEM sans FBS pour affamer les cellules pendant 12 h. Les cellules ont ensuite été cultivées avec du DMEM contenant 5,0 ng/mLTGF- 1 (sans FBS) pendant 24 h. Enfin, différentes concentrations de CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml et 25 ug/ml), d'actéoside (6 ug/ml, 3 ug/ml et 1,5 ug/ml), d'andéchinacoside (500 ug/ml, 250 ug/ml, et 125ug/ml) ont été effectués dans la plaque en quatre puits et incubés pendant 48 h.

Analyse PCR en temps réel

Le niveau d'expression de l'ARNm de NF-κB, p65 et collagèneI a été déterminé par PCR en temps réel. Pour déterminer les expressions de l'ARNm dans les cellules HSC-T6, les cellules (4 × 105cellules) ont été ensemencées dans des plaques à six puits avec 3 mL de DMEM avec 10 % de FBS et incubées pendant une nuit à 37 degrés et 5 % de CO2, après quoi le les milieux de culture cellulaire ont été remplacés par du DMEM sans sérum. Ensuite, les CPhG (100 ug/ml, 50 ug/ml et 25 ug/ml), l'actéoside (6 ug/ml, 3 ug/ml et 1,5 ug/ml) et l'échinacoside (500 ug/ml, 250 ug /ml et 125 ug/ml) ont été ajoutés aux puits. Après 48 h d'incubation avec des CPhG ou des compositions monomériques, l'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen, USA) et agité vigoureusement avec du chloroforme pendant 15 s. Après avoir reposé à température ambiante pendant 3 min, le lysat a été centrifugé à 12,000 × g pendant 15 min à 4 degrés. L'ARN dans la phase aqueuse a été précipité avec de l'isopropanol et la phase aqueuse supérieure a été transférée dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. L'ARN a été précipité en ajoutant 0,75 % d'éthanol, après quoi le tube de microcentrifugeuse a été centrifugé à 12 000 × g à 4 degrés pendant 5 minutes au maximum. Le surnageant a été retiré et l'ARN a été séché à température ambiante pendant 5 à 10 min. Ensembles spécifiques d'amorces (Sangon, Shanghai, Chine) qui ont été utilisés pour l'amplification de l'actine de rat [GenBank : NM_031144.3], du collagène I [GenBank : NM_ 053304.1] et de la NF- Les gènes κB p65[GenBank : NM_199267.2] ont été conçus à l'aide de l'amorce de lot 3. Les amorces directes (FW) et inverses (RV) étaient les suivantes : Collagène I (FW : GGA GAGAGC ATG ACC GAT GG, RV : GGG ACT TCT TGAGGT TGC CA), NF-κB p65 (FW : CAT ACG CTG ACCCTA GCC TG, RV : TTT CTT CAA TCC GGT GGCGA), -actine (FW : TAA GGC CAA CCG TGA AAA GATG, RV : AGA GGC ATA CAG GGA CAA CAC A). Les résultats ont été normalisés par rapport à l'ARNm du gène domestique -actine en tant que contrôle interne et sont présentés sous forme de niveaux d'ARNm relatifs

Les réactions ont été effectuées avec 8 μL IQ SYBR GreenSupermix, 1 μL de paire d'amorces 10 pM, 8,5 μL d'eau distillée et 2,5 μL d'ADNc. Chaque réaction en chaîne par polymérase a été réalisée dans les conditions suivantes : 95 degrés pendant 3 min, puis 40 cycles de 10 s à 95 degrés, 30 s à 55 degrés et 10 s à 55 degrés - 95 degrés pour l'extension, suivis d'une mesure de fluorescence unique. Les résultats finaux ont été décrits avec les valeurs relatives (2-ΔΔCt). Le calcul et l'analyse ont été effectués par le système de détection PCR en temps réel iQ5.

Analyse Western blot

Les niveaux d'expression des protéines de collagène I (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni, Art n° : ab34710) ont été déterminés par Western blot [avec -actine (Lot : 60008-1-lg ; Proteintech, Chine) comme contrôle interne. Des extraits de cellules entières ont été préparés à l'aide d'un tampon de test de radioimmunoprécipitation (RIPA) (Thermo Scientific, États-Unis) avec un cocktail d'inhibiteurs de Haltprotéase à 1 % (Thermo Scientific, États-Unis) et des cocktails d'inhibiteurs de Halt phosphatase à 1 % (Thermo Scientific, États-Unis). La concentration en protéines a été mesurée et quantifiée par la méthode de Bradford [18]. La protéine (10–50 ug) a été séparée sur un gel SDS-PAGE à 10 % et transférée sur des membranes PVDF (Millipore, États-Unis). Les membranes ont été bloquées pendant 1 h à température ambiante avec 5 % de BSA, et les anticorps primaires (Anti-Colla gen I anticorps, dilution 1:200 ou mAb de souris de -actine, dilution 1:5000) ont été incubés à 4 degrés pendant la nuit. L'Alk-Phos correspondant. les anticorps secondaires conjugués ont été incubés à température ambiante. Enfin, les membranes ont été lavées trois fois avec 1 × Tris-HClsaline avec 0,1 % de Tween 20, et les signaux ont été scannés et visualisés par le système d'imagerie GEL DOC XR (Bio-Rad). L'analyse densitométrique a été effectuée sur les protéines d'intérêt et normalisées à l'actine par le logiciel GEL DOCImage Studio (Bio-Rad). -l'actine a été utilisée comme contrôle interne.

analyses statistiques

Le test de normalité de Shapiro-Wilk et le test d'homogénéité de la variance de Levene ont été appliqués pour vérifier la normalité et l'homogénéité de la variance. L'analyse de la variance (ANOVA) suivie du test post hoc de Tukey a été utilisée pour identifier les différences statistiques dans les données homogènes et normalement distribuées. Le test non paramétrique de Kruskal-Wallis a été utilisé pour analyser des données non normalement distribuées ou homogènes. Les résultats ont été exprimés en moyenne ± ET. La signification a été fixée à P < 0.05.="" toutes="" les="" données="" ont="" été="" analysées="" par="" le="" logiciel="" spss="" 16.0="" (xinjiang="" medical="">

Résultats

Détermination quantitative des CPhGsCPhG dansCistanchetubuleuxcontient deuxPhényléthanolglycosides, l'échinacoside et l'actéoside, et leur contenu dans les CPhG a été déterminé par analyse HPLC (Fig. 1) comme étant de 42,71 ± 0.42 % et 14,27 ± 0.18 %, respectivement.

Indices du foie et de la rate

Comme le montre le tableau 1, les indices du foie et de la rate du groupe modèle ont été significativement élevés [P < 0.01,p="">< 0,05].="" les="" indices="" hépatique="" et="" splénique="" du="" médicament="" positif="" bjrg="" et="" cphg="" à="" différents="" groupes="" de="" doses="" ont="" été="" considérablement="" réduits="" par="" rapport="" au="" groupe="" modèle="" [pliver="0.004," pliver="0.003," pliver="0.004," pliver="0.005 ;" pspleen="0.017," pspleen="0.027," pspleen="0.024," pspleen="0.070," respectivement].="" les="" indices="" du="" foie="" et="" de="" la="" rate="" étaient="" inférieurs="" à="" ceux="" du="" groupe="">

Effets des CPhG sur les activités ALT, AST et les marqueurs de la fibrose hépatique

Dans la présente étude, les taux sériques des enzymes hépatiques AST et ALT ont été significativement augmentés dans le groupe modèle, reflétant les dommages hépatocellulaires chez les rats atteints de fibrose hépatique induite par la BSA. Cependant, les expériences ont montré que le traitement au BJRG (600 mg/kg) et aux CPhG (125, 250 et 500 mg/kg) réduisait significativement AST[PAST < 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" past="">< 0,001,="" respectivement]="" et="" alt="" [palt="0.117," palt="0.139," palt="0.189" ,="" palt="0.255," respectivement]="" niveaux="" chez="" les="" rats="" atteints="" de="" fibrose="" hépatique.="" (tableau="">

Les niveaux de HA, LN, PC et IV-C chez les rats modèles ont été considérablement augmentés [PHA < 0.001,="" pln="">< 0.{{39}="" }01,="" ppciii="0.002," piv-c="">< 0,001, respectivement].="" par="" rapport="" au="" groupe="" modèle,="" les="" niveaux="" de="" ha="" [pha="0.009," pha="0.007,PHA=0.009," pha="0.023," respectivement],="" ln="" [pln="0.011," pln="0.004," p="" ln="0.026," p="" ln="0.069," respectivement],="" pc="" iii[p="" pciii="" {{26="" }}.006,="" p="" pciii="0.067," p="" pciii="0.136," p="" pciii="0.296," respectivement]="" et="" iv-c="" [p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" p="" iv-c="">< 0,001,="" respectivement]="" chez="" les="" rats="" ont="" été="" nettement="" diminués="" par="" le="" bjrg="" (600="" mg/kg)="" et="" les="" cphg="" à="" différents="" groupes="" de="" doses="" (125,="" 250="" et="" 500="" mg/kg="" )="" (tableau="">

Contenu Hyp et TGF- 1

La teneur en collagène a également été détectée en mesurant les Hyplevels dans le tissu hépatique. Comme le montre le tableau 4, le niveau moyen d'Hyp dans le groupe modèle était significativement plus élevé que dans le groupe normal, mais il était nettement diminué dans le groupe BJRG et les différents groupes de doses de CPhG.

La concentration hépatique de TGF{{0}} du groupe modèle chez les rats a été significativement augmentée [P < 0.001].="" par="" rapport="" au="" groupe="" modèle,="" les="" niveaux="" de="" tgf-="" 1="" du="" médicament="" positif="" et="" des="" différents="" groupes="" de="" doses="" de="" cphg="" ont="" été="" nettement="" diminués="" [p="" tgf-="" 1="">< 0.001,="" p="" tgf-="" 1="">< 0,001,="" p="" tgf{{10="" }}="">< 0,001,="" ptgf-="" 1="">< 0,001,="" respectivement].="" les="" résultats="" sont="" résumés="" dans="" le="" tableau="">

Examen histopathologique

Les observations de coupes de tissu hépatique normal colorées avec H&E et le trichrome de Masson présentent des hépaticlobules et des sinusoïdes hépatiques distincts. La structure du tissu hépatique chez les rats modèles était désordonnée, et le tissu hépatique et les sinusoïdes hépatiques ont été remplacés par une grande quantité de tissu conjonctif. Cependant, une cytoarchitecture plus normale et moins de tissu conjonctif ont été détectés dans le groupe de traitement que ceux du groupe modèle.

Coloration H&E

Dans le groupe normal, l'intégrité structurelle du lobule hépatique sans zones portales anormales et sinusoïdes hépatiques a été observée. Les cordons hépatiques étaient disposés de manière ordonnée, avec le noyau rond et clair. Les noyaux sont situés au centre de la cellule, avec un cytoplasme abondant. Seule la zone porte a une petite quantité de tissu fibreux (Fig. 2a).

Dans le groupe modèle, la structure lobulaire était sévèrement endommagée. Les cellules hépatiques ont montré une légère dégénérescence aqueuse, principalement une dégénérescence gonflée et/ou une dégénérescence graisseuse. La formation d'une infiltration cellulaire inflammatoire, d'une hyperplasie étendue du tissu fibreux, de la formation d'un grand nombre de septum fibreux, de lobules divisés et d'une prolifération importante de cellules hépatiques a également été observée. Ces observations ont confirmé le succès de l'établissement du modèle animal de lésion immunitaire chez le rat. fibrose hépatique (Fig. 2b).

Par rapport au groupe modèle, il y a eu une réduction de l'infiltration des cellules inflammatoires dans les différents CPhG. On a également observé moins de nécrose et de dégénérescence graisseuse des cellules hépatiques ainsi qu'un soulagement de la fibrose. Les CPhG ont considérablement atténué la pathologie de la fibrose hépatique induite par la BSA chez le rat, atténué le gonflement des cellules hépatiques et empêché efficacement la nécrose des hépatocytes et l'infiltration de cellules inflammatoires, ce qui suggère que la CPhG exerce un effet protecteur sur la fibrose hépatique du rat induite par la BSA. (Fig. 2c–f).

Coloration au trichrome de Masson

Dans le groupe normal, le tissu hépatique était normal. La zone porte hépatique montrait un petit nombre de fibres de collagène bleu et le tissu hépatique était normalement structuré (Fig. 3a). Comparé au tissu hépatique du groupe normal, le tissu fibreux a proliféré par le feuillet central et s'est étendu dans le parenchyme hépatique. Les fibres de collagène s'étendaient, se reliaient et enveloppaient tout le lobule et entouraient la veine centrale. Ces effets, ainsi que la fibrose des hépatocytes, les lésions structurelles lobulaires, la fibrose périportale et la formation de pseudolobules (Fig. 3b) ont fourni la preuve que le modèle était établi.

Par rapport au groupe modèle, les fibres de collagène du groupe témoin positif au médicament étaient légèrement étendues vers l'extérieur de la zone porte périphérique (Fig. 3c). Par rapport au groupe modèle, les fibres de collagène dans les différents groupes de doses de CPhG ont été significativement réduites, la prolifération des fibres a été inhibée et la prolifération du tissu fibreux dans le parenchyme hépatique a été significativement réduite. Ces résultats suggèrent que les CPhG protégeaient les rats de la fibrose hépatique induite par la BSA (Fig. 3d – f).

Coloration immunohistochimique

Il est important de noter que l'expression du collagène de type I et du collagène de type III joue un rôle essentiel dans le développement de la fibrose hépatique, et leur génération et leur dépôt dans le tissu hépatique pourraient constituer un déterminant important de l'efficacité anti-fibrose hépatique. Les résultats sont résumés dans le tableau 5.

Collagène de type I

Le groupe normal exprimait le collagène de type I principalement dans les vaisseaux sanguins et la zone porte. Le groupe modèle exprime fortement la fibrose vasculaire de collagène de type I dans les zones portales. Dans l'espace de Disse, la coloration du collagène de type I a été observée sous forme de traînée ou de distribution inégale. Du collagène enrobé de fibrosepta pour former un pseudolobule. Dans ces expériences, moins de cloisons fibreuses ont été formées pour la BJRJ (600 mg/kg) et différents groupes de doses de CPhGs (125, 250 et 500 mg/kg) [PCol I= 0.002, PCol I {{6 }}.001, PCol I=0.023 et PCol I=0.044, respectivement]. Les résultats semi-quantitatifs ont révélé que l'expression de leur collagène de type I était significativement plus faible par rapport au groupe modèle (Fig. 4).

Collagène de type III

Le collagène de type III était faiblement exprimé dans le groupe normal et les zones périphériques entourant les veines porte et hépatique présentaient une petite quantité de fines fibres jaunes au lieu de fibres continues (Fig. 5a). Dans le groupe modèle, les fibres de collagène présentaient des cordons larges et épais, indiquant une forte expression, principalement localisée dans les zones porte et tissu fibreuse (Fig. 5b).

Les fibres de collagène de BJRJ (600 mg/kg) et de différents groupes de dose de CPhG (125, 250 et 500 mg/kg) étaient filamenteuses et distribuées autour de la veine centrale et des zones portailes. Par rapport au groupe modèle, les fibres de collagène étaient significativement réduites, la coloration était pâle et fine et la coloration immunohistochimique était faiblement positive (Fig. 5c – f). Ces résultats semi-quantitatifs montrent que les cellules exprimées positivement dans les groupes de doses positives et différentes [PCol III=0.015, PCol III=0.001, PColIII=0.010 et PCol III=0.037, respectivement] étaient différents de ceux du groupe modèle.

TGF- 1

Il y avait peu d'expression de TGIF - 1 dans les cellules hépatiques normales de rat. L'expression était limitée à un petit nombre de cellules interstitielles (Fig. 6a). Dans le groupe modèle, l'expression du TGF- 1 était largement distribuée dans la zone porte, les espaces fibreux, les cellules étoilées hépatiques, les cellules inflammatoires, la paroi sinusoïdale et le cytoplasme. Une zone porte particulière a présenté une expression fortement positive avec une coloration jaune brunâtre (Fig. 6b)

Il y avait une petite quantité d'expression dans la zone porte et les septa fibreux de BJRJ (6 0 0 mg/kg) et différents groupes de doses de CPhG (125, 250 et 500 mg/kg). L'étendue de la coloration positive dans ces groupes était significativement réduite par rapport à celle du groupe modèle. La coloration des cellules interstitielles dans les septa fibreux et le cytoplasme des cellules inflammatoires a diminué (Fig. 6c–f). Les résultats semi-quantitatifs ont révélé que la BJRJ et différents groupes de doses de CPhG [P TGF- 1=0.001, P TGF- 1 < 0,001, p="" tgf-="" 1="0.009," ptgf-="" 1="0." 004,="" respectivement]="" étaient="" significatifs="" par="" rapport="" au="" groupe="">

Comme mentionné précédemment dans l'article, le TGF- 1 est une cytokine importante dans la physiopathologie de la fibrose hépatique, stimulant la production de matrice extracellulaire [19]. Nous avons montré que le niveau de TGF- 1 augmentait dans le groupe modèle d'une manière cohérente avec la sévérité de la fibrose hépatique. Les niveaux d'expression de TGF- 1 dans le foie étaient compatibles avec les niveaux sériques de TGF- 1. Cela indique que les CPhG peuvent réduire de manière significative la fibrose hépatique due à l'expression du TGF- 1 en participant à la synthèse et à la dégradation de l'ECM.

L'expression du collagène de type I, du collagène de type III et du TGF- 1 peut détecter le processus pathologique de la fibrose hépatique. Leurs niveaux d'expression dans les groupes de traitement ont été significativement diminués et ont illustré que les CPhG peuvent améliorer l'activité de la collagénase, maintenir l'équilibre dynamique de la synthèse et de la dégradation de l'ECM hépatique, retardant et empêchant ainsi la formation de fibrose hépatique.

Expression de NF-κB p65 et du collagène I après intervention médicamenteuse dans les cellules HSC-T6

Afin de caractériser les signaux de fibrose hépatique, deux gènes régulateurs clés dans le foie ont été déterminés via un test RT-PCR. Les données ont montré que les cellules tHSC-T6 du groupe témoin avaient des niveaux inférieurs d'ARNm de NF κB et de collagène de type I. À l'inverse, le TGF- 1 a induit les cellules HSC-T6 à réguler nettement à la hausse l'ARNm de NF-κB (P <0.01) et="" col-i="" (p=""><0,01), avec="" des="" niveaux="" supérieurs="" à="" ceux="" du="" groupe="" témoin.="" en="" présence="" de="" différentes="" concentrations="" de="" cphgs,="" les="" résultats="" de="" nf-κb="" p65="" [p="" nf-κb="0.001" pour="" 100="" ug/ml,="" p="" nf-κb="0.002" pour="" 75="" ug/ml="" ,="" p="" nf-κb="0.007" pour="" 50="" ug/="" ml,="" et="" p="" nf-κb="0.012" pour="" 25="" ug/ml,="" respectivement]="" et="" col-i="" [p="" col-i="" {{32="" }}.006,="" p="" col-i="0.009," p="" col-i="0.014," p="" col-i="0.019," respectivement]="" ont="" montré="" des="" expressions="" réduites="" de="" ces="" arnm="" (="" figure="">

Analyse Western blot du niveau de collagène I après intervention médicamenteuse dans les cellules HSC-T6

La figure 8 montre les niveaux d'expression de la protéine collagène I dans les cellules HSC-T6 des différents groupes expérimentaux. et 25 ug/ml) par rapport au groupe TGF- 1.

Discussion

CPhGs est un glycoside phényléthanoïde isolé et purifié à partir du rhizome de Cistanche, qui est utilisé comme phytothérapie traditionnelle chinoise. Ces dernières années, il a été démontré que le CPhG possédait une puissante capacité à prévenir les lésions hépatiques [20]. Par conséquent, nous avons cherché à déterminer si les CPhG ont des effets inhibiteurs sur la fibrose de l'hépatite par la fibrose hépatique induite par la BSA chez le rat. Le BJRG est couramment utilisé comme médicament thérapeutique pour la fibrose hépatique en Chine. Il est fabriqué à partir de carapaces de tortues. Radix Paeonia Rubra, Cordyceps Sinensis, Radix isatidis, etc. ont pour effet de reconstituer le Qi et le sang, de soulager la fatigue, de ramollir les nœuds. De plus, des études antérieures montrent qu'il a pour fonction évidente de bloquer la fibrose précoce du foie, d'inhiber la prolifération des cellules stockant les graisses et de réduire la synthèse de collagène [21]. Par conséquent, le BJRG a été utilisé comme médicament positif dans cette étude.

Les modifications pathologiques de la fibrose hépatique chez le rat induites par des injections de BSA sont similaires à celles de la cirrhose porte humaine [22]. Les CPhG ont atténué de manière dose-dépendante le degré de fibrose hépatique et inhibé la transformation des CSH en cellules de type myofibroblaste, réduit les taux sériques élevés d'ALT, AST, HA, LN, CIV, TGF- 1 et l'indice hépatique, et ont nettement supprimé l'expression du collagène I, collagène III et TGF- 1 dans le tissu hépatique.

Les stades de la fibrose hépatique sont corrélés aux taux sériques de HA, LN et IV-C qui, en tant que marqueurs, peuvent jouer un rôle dans la détection du degré de fibrose hépatique [23]. Il a été rapporté que HA est la principale ressource de la matrice extracellulaire. L'IV-C en tant qu'élément essentiel de la membrane basale sera synthétisé abondamment et déposé massivement dans les premières phases de la cirrhose du foie. Les taux sériques de LN et IV-C sont les indices du taux de renouvellement de la membrane basale et montrent le degré de fibrose dans la région porte et les capillaires sinusoïdaux [24]. La PC III est un marqueur dans le diagnostic de la fibrose hépatique et de la cirrhose précoce, mais sa sensibilité et sa spécificité ne sont pas élevées et il n'y a pas de différence significative entre les différents stades de fibrose dans de nombreuses références [24, 25]. Cette étude a obtenu un résultat similaire.

De plus, les observations de H&E et de Masson sur les coupes colorées au trichrome montrent des tissus hépatiques normaux avec des lobules hépatiques et des sinusoïdes hépatiques distincts. La structure du tissu hépatique dans le groupe modèle était désordonnée, et le tissu hépatique et la sinusoïde hépatique ont été remplacés par une grande quantité de tissu conjonctif. Cependant, une amélioration significative a été observée dans les groupes de traitement par rapport au groupe modèle.

Il est important de noter que l'expression du collagène de type I et du collagène de type III joue un rôle essentiel dans le développement de la fibrose hépatique, dont le blocage peut prévenir et traiter la fibrose hépatique. Par conséquent, la génération et le dépôt dans le tissu hépatique de collagène de type I et de collagène de type III pourraient servir de déterminant important de l'efficacité anti-fibrose hépatique. Le TGF- 1 est également une cytokine profibrogène importante dans les lésions hépatiques et il est biologiquement actif avec de multiples actions pharmacologiques[26]. Un équilibre entre ces actions est nécessaire pour maintenir l'homéostasie tissulaire. L'expression aberrante du TGF 1 est impliquée dans la pathogenèse des maladies du foie [27, 28]. On sait que le TGF- 1 est une cytokine cruciale impliquée dans les premiers stades de la fibrose hépatique. Le stress oxydatif déclenche le TGF- 1, ce dernier stimulant la production et le dépôt d'ECM [29]. Par conséquent, l'une des stratégies efficaces pour produire un médicament contre la fibrose hépatique consiste à identifier les agents anti-TGF- 1. L'analyse immunohistochimique a montré que les expressions du collagène de type I, du collagène de type III et du TGF- 1 pouvaient détecter le processus pathologique de la fibrose hépatique. Les expressions du collagène de type I, du collagène de type III et du TGF - 1 dans les groupes de traitement sont diminuées, ce qui était significativement plus faible dans le groupe de traitement des CPhG à forte dose en particulier, et suggère que le CPhG est un collagène efficace de type I, collagène de type III , et inhibiteur de TGF- 1. Vraisemblablement, le CPhGscan améliore l'activité de la collagénase, en maintenant l'équilibre dynamique de la synthèse et de la dégradation de l'ECM, retardant et empêchant ainsi la formation de fibrose hépatique.

Les CPhG pourraient non seulement améliorer la fibrose hépatique induite par la BSA chez les rats, mais pourraient également être associés à l'inhibition de l'activation des HSC in vitro. On pense que l'activation des CSH représente l'étape cruciale de la fibrogenèse. Dans cette étude, les résultats ont illustré que l'administration de CPhG de 25 à 100 ug/ml atténuait remarquablement la diminution de l'expression de NF-κB p65, de l'ARNm du collagène I et de la protéine du collagène I dans les HSC.

NF-κB joue un rôle important dans la modulation de la réponse immunitaire à une infection ou à des stimuli [30]. L'accumulation de NF-κB dans les cellules hépatiques peut entraîner le recrutement de cytokines/médiateurs inflammatoires, induisant ainsi le développement de la fibrose [31, 32]. De plus, le collagène est également un indice sensible qui reflète le niveau de fibrose et représente environ 50 % de la protéine totale dans le foie fibreux [33]. En conséquence, nous avons postulé que le mécanisme moléculaire contre la fibrose hépatique est lié à l'inactivation médiée par les CPhG de l'expression de NF-κB, dans laquelle le bénéfice contribue aux rôles synergiques d'atténuation de l'immunotoxicité et du stress inflammatoire dans les tissus hépatiques lésés par la BSA, corrigeant davantage le dysmétabolisme pour améliorer les fonctions hépatiques.

conclusion

En conclusion, nos études indiquent que les CPhG atténuent significativement l'étendue de la fibrose hépatique induite par la BSA chez le rat. Son mécanisme peut être au moins partiellement dû à l'effet inhibiteur des CPhG sur la composition de l'ECM et à la stimulation de la dégradation de l'ECM, et/ou par l'inhibition directe de la synthèse du collagène de type I, du collagène de type III et de l'expression du TGF{{0 }}. Par conséquent, nous nous attendions à ce que les CPhG puissent être utilisés dans des produits de soins de santé ou dans des médicaments cliniques pour la prévention de la fibrose hépatique humaine. Des études futures sont nécessaires pour établir l'efficacité des CPhG en tant que puissant médicament anti-fibrose hépatique.

Abréviations

CPhGs : anol glycosides de cistanche ;

BSA : albumine sérique bovine ;

HSC-T6 : Cellules étoilées hépatiques ;

Hyp : hydroxyproline ;

BJRG : Comprimés Compound Biejiarangan ;

TGF- 1 : facteur de croissance transformant 1 ;

ALT : Alanineaminotransférase ;

AST : Aspartate aminotransférase ;

HA : acide hyaluronique ;

LN : Laminine ; PC III : procollagène de type III ;

IV-C : collagène de type IV ;

NF-κB : activateur de la chaîne légère kappa du facteur nucléaire des lymphocytes B activés ;

RT-PCR : amplification en chaîne par transcriptase inverse-polymérase ;

SDS-PAGE : Électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide.

Intérêts concurrents

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent

Contributions des auteurs

TL, JZ, SPY, LM, MT et SLZ ont conçu et conçu les expériences. SPY, TL et JZ ont analysé les données. SPY et JZ ont écrit le manuscrit. TL, LM et JZ ont révisé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Reconnaissance

Cette recherche a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81260624). Les auteurs tiennent à exprimer leurs sincères remerciements au professeur Tao Liu pour ses améliorations suggérées pour la rédaction de cet article.

Détails de l'auteur

1Département de toxicologie, École de santé publique, Université médicale du Xinjiang, No. 393 Xinyi Road, Urumqi 830011Région autonome ouïghoure du Xinjiang, Chine. 2Key Laboratory for Uighur Medicine, Institute of MateriaMedica of Xinjiang, Urumqi 830004, Chine. 3Non. 140 Xinhua South Road, Tianshan District, Urumqi 830000 Région autonome ouïghoure du Xinjiang, Chine.

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