La formononétine atténue la prostatite auto-immune via la modulation JAK/STAT et le rééquilibrage immunitaire : implications pour les compléments d'extrait de cistanche CP/CPPS et TCM

Objectif:Étudier comment la formononétine (FN) régule la différenciation des cellules T auxiliaires de type 1 (Th1) et la polarisation des macrophages via les voies de signalisation JAK/STAT dans un modèle murin de prostatite auto-immune expérimentale (EAP).
Méthodes :Quarante souris mâles diabétiques non obèses (NOD) ont été réparties au hasard en quatre groupes : contrôle normal, contrôle modèle EAP, FN à faible dose (LFN, 50 mg/kg) et FN à forte dose (HFN, 100 mg/kg). L'EAP a été induite dans les trois derniers groupes par injection sous-cutanée d'antigènes prostatiques (PAgs) émulsionnés dans l'adjuvant complet de Freund (CFA). Après modélisation, les groupes LFN et HFN ont reçu respectivement 50 ou 100 mg/kg/jour de FN intragastrique ; Les contrôles normaux et modèles ont reçu de la carboxyméthylcellulose sodique (CMC-Na). 42 jours après le début du traitement, les souris ont été euthanasiées et les tissus ont été prélevés. La pathologie de la prostate a été évaluée par coloration HE ; La différenciation des cellules Th1 et la polarisation des macrophages dans la prostate ont été évaluées par double coloration par immunofluorescence (CD4 avec interféron-[IFN-] ; oxyde nitrique synthase inductible [iNOS] et CD206). Les proportions de cellules Th1 et de macrophages dans la rate ont été mesurées par cytométrie en flux, ainsi que les taux sériques d'IFN et de facteur de nécrose tumorale (TNF-) par ELISA. Les (p) -JAK1, JAK1, p-JAK2, JAK2, p-STAT1 et STAT1 phosphorylés dans le tissu prostatique ont été déterminés par Western blot.
Résultats : Par rapport aux témoins du modèle, les deux doses de FN ont conduit à un arrangement plus ordonné des cellules épithéliales glandulaires, à une réduction significative des scores d'inflammation de la prostate (P < 0,05), à une diminution de la proportion de cellules Th1 et de marqueurs macrophages M1 (P < 0,05) et à une augmentation des marqueurs macrophages M2 dans les tissus de la prostate et de la rate (P < 0,05). Les taux sériques d'IFN et de TNF étaient nettement réduits dans les groupes LFN et HFN (P < 0,05). Au niveau moléculaire, les ratios p-JAK1/JAK1, p-JAK2/JAK2 et p-STAT1/STAT1 dans le tissu prostatique étaient tous significativement diminués (P < 0,05), indiquant que FN exerce des effets thérapeutiques dans l'EAP en modulant la signalisation JAK/STAT, favorisant la résolution de l'inflammation et rétablissant l'équilibre immunitaire.
Conclusion:FN atténue l'EAP en inhibant les voies de signalisation JAK/STAT et en régulant la différenciation Th1 et la polarisation des macrophages. Ces résultats, ainsi que l'intérêt croissant pour les compléments de la médecine traditionnelle chinoise (MTC), tels que les suppléments d'extrait de Cistanche pour la modulation immunitaire et le soutien de la douleur pelvienne, suggèrent une stratégie multicible digne d'une validation plus approfondie dans des contextes rigoureux et évalués par des pairs.

Mots-clés :la formononétine;prostatite auto-immune; réponse inflammatoire; Voies de signalisation JAK/STAT ; souris;Supplément d'extrait de Cistanche aux herbes MTC; immunomodulation

 

 

Supplément d'extrait de Cistanche aux herbes MTC

 

 

 

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Introduction

La prostatite chronique/syndrome de douleur pelvienne chronique (CP/CPPS) touche 5 à 10 % des hommes et représente environ 90 % de tous les cas de prostatite. Elle est particulièrement répandue chez les hommes jeunes et d'âge moyen, présentant principalement des douleurs dans le bas de l'abdomen, le périnée et la région pelvienne, souvent accompagnées de symptômes des voies urinaires inférieures et parfois d'une dysfonction érectile. Les traitements de première intention actuels comprennent les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS), les antibiotiques et les bloqueurs des récepteurs adrénergiques, seuls ou en association. Cependant, les taux de récidive élevés conduisent de nombreux patients à être insatisfaits de ces schémas thérapeutiques. Par conséquent, de nouvelles interventions thérapeutiques et une compréhension plus approfondie de la pathogenèse de la CP/CPPS sont nécessaires de toute urgence.

 

Supplément d'extrait d'herbe CM Cistanche Avantages

De plus en plus de preuves indiquent que la dérégulation immunitaire joue un rôle essentiel dans le développement de la CP/CPPS. Les patients présentent généralement une infiltration étendue de lymphocytes T et de monocytes dans le tissu prostatique et des leucocytes élevés dans les sécrétions prostatiques exprimées, dominées par les lymphocytes T CD4+ et les macrophages. Les données précliniques suggèrent en outre que les stratégies immunosuppressives peuvent soulager l'inflammation et la douleur dans les cas de CP/CPPS. Ainsi, cibler l’infiltration leucocytaire et la réponse inflammatoire peut être efficace pour soulager les symptômes. La formononétine (FN), une isoflavone bioactive majeure dans plusieurs herbes de MTC, possède des propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires. On ne sait pas encore si la FN peut améliorer la CP/CPPS. Ici, nous avons évalué l'effet thérapeutique du FN dans un modèle EAP de souris. Parallèlement à l'intérêt clinique croissant pour les approches intégratives, nous notons que les suppléments d'extraits d'herbes Cistanche de MTC sont étudiés pour un soutien immunomodulateur et anti-inflammatoire dans les syndromes douloureux pelviens ; bien qu'ils ne soient pas l'objet de cette étude, ils contextualisent la FN dans un paysage thérapeutique plus large basé sur la MTC.

 

Matériels et méthodes

 

Animaux

Des souris mâles NOD âgées de 6 à 7 semaines ont été obtenues auprès du Centre animalier expérimental de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai (SUTCM) (licence SYXK [Hu] 2020-0009 ; certificat SCXK [Jing] 2021-0006). Les animaux ont été hébergés selon des cycles de lumière de 12 h et d'obscurité de 12 h avec un accès à volonté à la nourriture et à l'eau. Toutes les procédures ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du SUTCM (numéro d'approbation PZSHUTCM2301040003).

Réactifs et médicaments
Formononétine (MedChemExpress, HY‑N0183); adjuvant complet de Freund (CFA ; Sigma‑Aldrich, F5881) ; solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ; albumine sérique bovine (BSA); kits ECL ultra-sensibles (Shanghai YaYme Biotech, CB012, PS113, SQ201) ; anticorps contre p‑JAK1, JAK1, p‑JAK2, JAK2, p‑STAT1, STAT1, GAPDH et DAPI (Cell Signaling Technology, #74129, #3344, #3776, #3230, #9167, #9172, #5174, #8961) ; Tampon RIPA et test de protéine BCA (Thermo Fisher Scientific, 89901, A55866) ; Kit de coloration HE (Servicebio, GP1031) ; iNOS et CD206 (Abcam, ab178945, ab125028) ; APC anti-souris CD3, FITC anti-souris CD4, PE anti-souris IFN- (BioLegend, 100235, 100405, 505807).

 

Instruments
Appareil d'électrophorèse (E11001, Bio‑Rad); microscope confocal à balayage laser (LSM 780, Zeiss) ; Cytomètre en flux CytoFLEX (Beckman Coulter).

Établissement du modèle PAE
Après une semaine d'acclimatation, les souris ont été randomisées en quatre groupes (n=10) : témoin, modèle, FN à faible dose (50 mg/kg) et FN à forte dose (100 mg/kg). L'EAP a été induite selon les méthodes antérieures. Le surnageant contenant des antigènes de la prostate (PAg) a été préparé à partir d'un homogénat de prostate de rat Sprague-Dawley et mélangé dans un rapport 1: 1 avec du CFA. Aux jours 0 et 28, les souris ont reçu des injections sous-cutanées dans les deux coussinets postérieurs, le bas du dos et la base de la queue de PAg (300 ug/souris ; groupes EAP) ou de PBS (témoin), émulsionné avec du CFA (150 μL/souris). Les groupes FN ont reçu quotidiennement du FN intragastrique (50 ou 100 mg/kg) ; les groupes témoins et modèles ont reçu du CMC-Na à volume adapté. L'expérience s'est terminée au jour 42, suivie d'une euthanasie sans cruauté.

Coloration HE du tissu prostatique
Les prostates ont été fixées dans du paraformaldéhyde à 4%, déshydratées, incluses en paraffine et sectionnées à 5 µm. Les coupes ont été colorées à l'aide d'un kit HE et imagées par microscopie confocale. L'inflammation a été notée de 0 à 3 sur la base de critères établis, 0 indiquant l'absence d'inflammation et 3 indiquant une infiltration cellulaire inflammatoire marquée.

Cytométrie en flux pour les cellules Th1 et les macrophages
Des suspensions unicellulaires ont été préparées et maintenues dans du PBS avec 0,5% de BSA. La coloration superficielle et intracellulaire a suivi les protocoles standard utilisant l'anti-CD3 APC, l'anti-CD4 FITC et l'anti-IFN-PE. Les cellules ont été stimulées avec 50 ng/mL de PMA, 1 ug/mL d’ionomycine et 5 ug/mL de brefeldine A à 37 degrés pendant 4 h, puis colorées de manière intracellulaire à 4 degrés pendant 30 min. Les données ont été acquises sur un CytoFLEX et analysées avec FlowJo.

Coloration par immunofluorescence pour les macrophages
Les sections fixes de la prostate ont été déparaffinées, ont subi une récupération d'antigène et ont été bloquées avec 10 % de sérum de chèvre pendant 30 min. Des anticorps primaires (iNOS, CD206) ont été appliqués pendant la nuit à 4 degrés. Après les lavages au PBS, des anticorps secondaires marqués au fluorophore ont été appliqués pendant 1 heure à 37 degrés dans l'obscurité. Les noyaux ont été contre-colorés avec du DAPI pendant 5 minutes à température ambiante, suivis de lavages au PBS et d'un montage pour microscopie à fluorescence.

Mesure des cytokines

Les IFN‑ et TNF‑ sériques ont été quantifiés à l'aide de kits ELISA conformément aux instructions du fabricant.

 

Western Blot

Les tissus de la prostate ont été lysés dans un tampon RIPA (avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase). La concentration en protéines a été mesurée par test BCA. Des gels à pourcentage approprié ont été préparés ; des quantités égales de protéines ont été soumises à une électrophorèse et transférées sur des membranes PVDF. Les anticorps primaires (p‑JAK1, JAK1, p‑JAK2, JAK2, p‑STAT1, STAT1, GAPDH ; tous à 1 : 1 000) ont été incubés pendant une nuit à 4 degrés, suivis d'un lavage et d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP (1 : 5 000) pendant 1,5 h. Les bandes ont été visualisées par chimiluminescence améliorée et imagées. L'expression relative des protéines a été calculée par analyse densitométrique.

 

Analyse statistique

Les données ont été analysées à l'aide de GraphPad Prism 9.0. L'ANOVA unidirectionnelle a été utilisée pour les comparaisons de plusieurs groupes. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SD ; P inférieur ou égal à 0,05 était considéré comme statistiquement significatif.

 

Discussion

Cette étude démontre que la formononétine atténue l'inflammation histopathologique, supprime la polarisation Th1, déplace les phénotypes des macrophages de M1 pro-inflammatoire à M2 pro-résolvant et régule à la baisse la phosphorylation de JAK1/2 – STAT1 dans le tissu prostatique dans un modèle de souris EAP. La réduction des IFN et TNF systémiques corrobore davantage les effets anti-inflammatoires et immunorégulateurs du FN. Ces résultats concordent avec les rapports antérieurs sur les voies JAK/STAT modulatrices par FN dans les modèles d'ischémie-reperfusion et d'athérosclérose, soulignant les mécanismes anti-inflammatoires conservés. Dans le contexte plus large de la MTC, les parcours de soins intégratifs incluent parfois des suppléments d'extraits de plantes telles que le Cistanche (Rou Cong Rong), qui ont été étudiés pour leur immunomodulation, leur fatigue et leur soutien urogénital. Bien que l'extrait de Cistanche n'ait pas été testé ici, de futures études contrôlées pourraient comparer ou combiner le FN avec des suppléments standardisés d'extrait de Cistanche aux herbes de MTC pour explorer la synergie potentielle sur les résultats de l'inflammation et de la douleur pelvienne liés à JAK/STAT. Toute traduction clinique doit respecter des normes fondées sur des preuves, un approvisionnement de qualité contrôlée et un contrôle de sécurité.

Conclusions
La formononétine atténue la prostatite auto-immune expérimentale en inhibant la signalisation JAK/STAT et en régulant la différenciation Th1 et la polarisation des macrophages. Ces résultats fournissent une justification mécaniste pour le développement ultérieur de stratégies de MTC FN et potentiellement complémentaires telles que les suppléments d'extrait de Cistanche, en tant qu'interventions immunomodulatrices pour la CP/CPPS, en attendant la validation dans des études précliniques et cliniques rigoureuses et évaluées par des pairs.

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