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Effets protecteurs de Cistanche Tubulosa contre la dégradation du collagène des fibroblastes cutanés induite par H2O2/UVB via la signalisation TGF/Smad médiée par Hsa-microARN-4535-

May 10, 2023

ABSTRAIT

Cette étude visait à étudier le mécanisme sous-jacent aux effets protecteurs du cistanche contre les dommages induits par H2O2/UVB à l'aide de modèles in vitro et in vivo de photodommages. De plus, nous avons identifié l'implication de la régulation des miARN dans ce processus. Les fibroblastes dermiques humains HS68 traités au H2O2/UVB et les souris nues C57BL/6J induites par les UVB ont été utilisés comme modèles in vitro et in vivo de photodommage. Les résultats ont montré quetraitement cistancheréduction de la viabilité cellulaire induite par H2O2/UVB atténuée, altération de la signalisation TGF/Smad et vieillissement dermique. Sur la base des résultats des analyses de matrices de microARN et des recherches dans les bases de données, has-miR-4535 a été identifié comme un miARN candidat potentiel ciblant Smad4. In vitro,traitement cistancheactivé le complexe Smad2/3/4 et inhibé l'expression de hsa-miR-4535 dans les cellules exposées au H2O2/UVB. In vivo, l'application topique de doses faibles (12 mg/kg) et élevées (24 mg/kg) de cistanche sur la peau dorsale de souris nude C57BL/6J a significativement atténué les photodommages cutanés induits par les UVB en favorisant la signalisation de la synthèse du collagène TGF/Smad, réduirehyperplasie épidermique, formation de rides etsénescence cutanée, ainsi queinhibition de l'expression hsa-miR-4535. Pris ensemble, nos résultats indiquent un lien entre hsa-miR-4535 et la signalisation de la synthèse du collagène TGF/Smadet suggérer que ces facteurs soient impliqués dans lamécanisme photoprotecteur deCistanchedans les fibroblastes dermiquescontre H2O2/Vieillissement induit par les UVB. La preuve indiquait queCistancheavecpropriétés anti-âgepeut êtreconsidéré comme un complément dans les produits de soins de la peau.

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INTRODUCTION

Les signes cliniques du vieillissement cutané humain comprennent une augmentation des rides, un relâchement et une pigmentation irrégulière [1]. Le processus de vieillissement cutané est complexe et peut être divisé en deux types : le vieillissement intrinsèque et le vieillissement extrinsèque. Le vieillissement intrinsèque est dû au passage du temps et à des facteurs génétiques, tandis que le vieillissement extrinsèque, également appelé photovieillissement, résulte principalement de l'exposition aux rayonnements ultraviolets [2, 3]. Des études antérieures ont montré que d'abondantes espèces réactives de l'oxygène (ROS) sont générées au cours du vieillissement intrinsèque et extrinsèque. L'accumulation de ROS peut induire la signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) et activer son facteur de transcription en aval, la protéine activatrice -1 (AP-1). L'AP -1 activé peut se déplacer vers le noyau et se lier aux régions promotrices des métalloprotéinases matricielles (MMP) [4]. Les MMP sont un grand groupe d'endopeptidases dépendantes du zinc, contribuant à la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM) du derme cutané. En particulier, la MMP-1, une collagénase, est impliquée dans le clivage des collagènes de types I et III [5]. Les collagènes de types I et III, composants majeurs de la MEC, sont capables de conférer soutien et force au derme cutané et leur désorganisation conduit au plissement et au relâchement caractéristiques des peaux âgées [6]. Le facteur de croissance transformant bêta (TGF) est une cytokine omniprésente et puissante avec trois isoformes différentes, TGF 1, TGF 2 et TGF 3, qui peuvent réguler positivement la synthèse de collagène dans le derme cutané humain [2]. Les TGF initient leur signal en interagissant avec des complexes spécifiques de récepteurs de sérine/thréonine kinase de surface cellulaire, y compris les récepteurs de TGF de types I (T RI) et II (T RII). La phosphorylation de T RI déclenche la phosphorylation des R-Smads (Smad2 et Smad3). Les R-Smad activés interagissent avec Smad4 pour réguler sa translocation du noyau et activer transcriptionnellement les collagènes de types I et III en se liant aux promoteurs des éléments de liaison Smad (SBE) [7, 8]. De plus en plus de preuves indiquent qu'une génération élevée de ROS, induite par le vieillissement intrinsèque ou le photovieillissement, contribue à l'altération de la voie de signalisation TGF / Smad, qui à son tour entraîne une réduction de la synthèse de collagène dans les fibroblastes dermiques de la peau humaine [9, 10].

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le cistanche (3,5,7-trihydroxyflavone), un membre naturel de la famille des flavonoïdes, est abondant dans Alpinia officinarum et la propolis. cistanche est un candidat potentiel pour le traitement des AVC ischémiques, du diabète et de différents types de cancer [11–13]. De plus, le cistanche possède des activités anti-radicalaires et anti-inflammatoires [14, 15]. Nous avons précédemment montré que le cistanche réduisait l'inflammation induite par H2O 2- et favorisait la formation de collagène via les voies de signalisation du récepteur du facteur de croissance analogue à l'insuline 1 (IGFI-R) / ERK1 / 2 dans les cellules HS68 [16, 17]. De plus, une étude a indiqué que le cistanche a été identifié comme un composé d'Alpinia officinarum et possède des effets inhibiteurs de la collagénase dans les cellules fibroblastes dermiques [18]. Cependant, un mécanisme moléculaire plus détaillé lié à la façon dont le cistanche régule le vieillissement de la peau dermique est inconnu.

Les microARN (miARN) sont un groupe de petites molécules d'ARN simple brin non codantes d'une longueur moyenne de 22 nucléotides. Les miARN matures sont transcrits à partir de séquences d'ADN. Dans la plupart des cas, les miARN matures se lient aux régions 3′ non traduites (UTR) des ARNm cibles pour faire taire la traduction des ARNm [19]. Dans la peau humaine, les miARN jouent un rôle crucial dans la régulation du métabolisme cellulaire, du cancer, de la sénescence et de la formation de collagène [20–23]. Par exemple, miR-377 peut induire la sénescence des fibroblastes dermiques en inhibant l'expression de l'ADN méthyltransférase 1 (DNMT1), ce qui conduit ensuite à moins de méthylation dans le promoteur p53 et à la sénescence des fibroblastes dermiques [22]. Le profil des miARN dans les dommages induits par les UVB dans le derme humain

les cellules papillaires (nHDP) a déjà été étudiée [24]. Cependant, la façon dont la sénescence des fibroblastes dermiques induite par les UVB par la régulation des miARN, en particulier dans l'implication du composé naturel, est largement inconnue. Cette étude visait à étudier les effets protecteurs du cistanche contre les dommages dermiques induits par H2O2/UVB ainsi que le rôle de la dégradation du collagène médiée par les microARN dans ce processus. Nous avons également cherché à identifier les microARN impliqués dans la régulation de la synthèse du collagène.

RÉSULTATS

cistanche inhibe la cytotoxicité induite par les UVB/H2O2-dans les fibroblastes dermiques humains HS68

Pour étudier la cytotoxicité du cistanche (Figure 1A) in vitro, les cellules HS68 ont été traitées avec différentes doses de cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) pendant 24h. Les résultats du test MTT ont montré que le cistanche n'était pas cytotoxique pour les cellules HS68 (figure 1B). Ensuite, nous avons exposé des cellules HS68 à différentes doses de H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) et UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) pendant 24 h. Le traitement H2O2 et UVB a diminué la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante (Figure 1C, 1D). Pour évaluer les propriétés cytoprotectrices du cistanche suite à une exposition au H2O2 et aux UVB, nous avons traité la cellule HS68 avec différentes concentrations de cistanche (10, 20, 30 μM) après H2O2- (200 μM) et induite par les UVB (40 mJ/cm² ) dommage. Traitement H2O2 ou UVB seul

significativement diminué (40 pour cent) la viabilité des cellules HS68. Cependant, le traitement cistanche a empêché la mort cellulaire d'une manière dépendante de la concentration (Figure 1E, 1F). Une concentration plus élevée de cistanche (30 μM) a nettement atténué la cytotoxicité induite par H2O2- et UVB. Par conséquent, la dose de 30 μM de cistanche a été utilisée dans des études in vitro ultérieures pour évaluer sa protection

effets dans les cellules HS68.



cistanche atténue la sénescence des cellules HS68 induite par H2O2-plutôt que l'apoptose

Pour déterminer si la diminution de la viabilité cellulaire était due à la mort cellulaire ou à l'inhibition de la croissance, nous avons vérifié l'expression de plusieurs marqueurs d'apoptose et de survie par western blot dans des cellules HS68 exposées à différentes doses de H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM) pendant 24h. Nous avons constaté une diminution significative de l'expression des marqueurs de survie, tels que p-Akt, et une augmentation de l'expression de

apoptosis-related markers, such as cleaved-caspase 3 and cytochrome c, at concentrations >200 μM H2O2 (figure 2A). De plus, nous avons effectué une cytométrie en flux pour évaluer les cellules apoptotiques à l'aide de la coloration à l'annexine V et à l'IP et avons observé des résultats similaires. Pris ensemble, 200 μM H2O2 n'ont pas provoqué l'apoptose des cellules HS68 (figure 2B). Ensuite, nous avons détecté l'expression de plusieurs
marqueurs de sénescence, tels que p16, p21 et SA- -gal, pour déterminer les cellules sénescentes. Nos résultats ont montré que le traitement par cistanche diminuait de manière significative les niveaux de protéines p16 et p21 induits par H2O 2- ainsi que le nombre de cellules SA - - gal-positives (Figure 2C, 2D).



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Figure 1. cistanche inhibe la cytotoxicité induite par les UVB/H2O2-dans les fibroblastes dermiques humains HS68. (A) La structure chimique du cistanche. (B) Viabilité cellulaire des cellules HS68 traitées avec différentes concentrations de cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) pendant 24h. (C et D) Viabilité cellulaire des cellules HS68 exposées à différentes doses de H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) ou irradiées aux UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) pendant 24 h. (E et F) Viabilité cellulaire des cellules HS68 exposées à H2O2 (200 µM) ou irradiées aux UVB (40 J/cm2) pendant 1 h puis traitées avec cistanche (10, 20, 30 µM) pendant 23 h. Les effets cytoprotecteurs du cistanche ont été déterminés par le test MTT. Les cellules témoins ont reçu une viabilité de 100 %. Les valeurs sont indiquées sous forme de moyenne ± SE. La quantification des résultats est indiquée (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 par rapport aux cellules témoins non traitées ; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs H2O2 ou cellules traitées aux UVB.

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cistanche atténue la production de ROS intracellulaires/mitochondriales induite par les UVB/H2O2-et le déséquilibre des MMP dans les cellules HS68
Le stress oxydatif joue un rôle clé dans diverses maladies, et peut être induit par des facteurs endogènes ou exogènes. Ici, nous avons utilisé H2O2 comme facteur endogène et UVB comme facteur exogène pour induire des dommages oxydatifs, puis nous avons étudié les activités d'élimination des ROS du cistanche. Pour identifier les sources de ROS, MitoSOX et DCFH-DA ont été utilisés pour déterminer les ROS intracellulaires et mitochondriaux. Les résultats de la coloration ont montré que le traitement H2O2 et UVB induisait une accumulation de ROS tandis que le traitement cistanche réduisait la génération de ROS (Figure 3A, 3B). De plus, comme le MMP déséquilibré peut initier la mort cellulaire, nous avons utilisé JC-1 pour déterminer les changements dans le MMP. Les mitochondries normales émettaient une fluorescence rouge (dimères JC-1) ​​tandis que les mitochondries altérées émettaient une fluorescence verte (monomères JC-1). L'exposition aux UVB et au H2O2 a induit des niveaux élevés de fluorescence verte. Notamment, le traitement cistanche a déplacé la fluorescence verte au rouge, indiquant la relance des fonctions mitochondriales (figure 3C).


cistanche atténue l'altération de la voie de synthèse du collagène TGF/Smad induite par H2O2- dans les cellules HS68

La signalisation TGF / Smad est propice à la formation de collagène dans les fibroblastes dermiques de la peau humaine [25-27]. Par conséquent, nous avons étudié le rôle du cistanche dans la synthèse du collagène via la voie TGF/Smad dans les cellules HS68 exposées au H2O2. Les résultats de Western blot ont indiqué que le cistanche améliorait de manière significative la signalisation TGF/Smad ainsi que la synthèse de collagène dans les cellules HS68 exposées à H2O 2- (figure 4A). Par ailleurs, la désorganisation du collagène de type I et III est une des caractéristiques typiques des fibroblastes cutanés âgés [28]. La famille des MMP étant impliquée dans le catabolisme du collagène [29], nous avons ensuite confirmé l'influence du cistanche sur l'activation des MMP-1. Nous avons constaté que le cistanche empêchait la dégradation du collagène dans les cellules HS68 en supprimant le niveau de MMP -1 amélioré par H2O 2- (Figure 4A).

De plus, nous avons identifié le mécanisme moléculaire subcellulaire sous-jacent à cette action protectrice en comparant les cellules HS68 traitées avec H2O2 seul ou co-traitées avec cistanche en utilisant l'immunotransfert et la coloration par immunofluorescence. le traitement par cistanche a amélioré l'accumulation nucléaire de p-smad2/3 et Smad4 qui a été perturbée par l'exposition au H2O2 dans les cellules HS68

(Figure 4B, 4C). Ces résultats indiquent que cistanche peut améliorer la fragmentation du collagène induite par H2O2- en activant la voie TGF/Smad dans les cellules HS68.


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Figure 2. Cistanche atténue la sénescence des cellules HS68 induite par H2O2- plutôt que l'apoptose. (A) Les cellules HS68 ont été exposées à différentes doses de H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 µM) pendant 24 h. L'apoptose et les marqueurs liés à la survie ont été détectés par western blot. (B) Les cellules colorées à l'annexine V et PI ont été analysées par cytométrie en flux pour identifier les cellules apoptotiques sous exposition à H2O2. (C) Les cellules HS68 ont été
exposé à H2O2 (200 µM) pendant 1 h puis traité avec cistanche (30 µM) pendant 23 h. Des marqueurs de vieillissement tels que p16 et p21 ont été détectés par western blot. GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. (D) Les cellules sénescentes ont été détectées à l'aide d'un kit de détection de la galactosidase associée à la sénescence (SA{{10}} gal). Les cellules SA- -gal-positives sont représentées en vert. (C) Les valeurs sont indiquées sous forme de moyenne ± SE. La quantification des résultats est indiquée (n=3) **P < 0,01, ***P < 0,001 par rapport aux cellules témoins non traitées ; ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs H2O2-cellules traitées.


le traitement cistanche réduit l'expression régulée à la hausse induite par H2O2-hsa-miR-4535, prévue pour cibler Smad4
L'analyse de la matrice de miARN des cellules HS68 traitées au cistanche a révélé que l'expression de hsa-miR -4535 était réduite dans le groupe traité au cistanche par rapport à celle du groupe témoin (figure 5A). En outre, à l'aide de bases de données de miARN, telles que miRDB et TargetScanHuman, nous avons prédit un site cible putatif conservé pour hsa-miR-4535 dans Smad4-3′-UTR (Figure 5B). Après confirmation du site cible, les constructions Smad4-3′-UTR-WT et Smad4-3′-UTR MT reporter ont été transfectées dans des cellules HS68 pour vérifier la liaison directe de hsa-miR-4535 à C'est fou4-
3′-UTR. Nous avons observé une réduction de 50 % des activités de la luciférase entre les groupes Smad4-3′-UTR de type sauvage et mutant suivis de transfections mimiques hsa-miR-4535 (figure 5C). Nous avons ensuite évalué les effets de H2O2 (100 200 μM) sur la régulation de hsa-miR-4535 et de Smad 4 dans les cellules HS68, et avons constaté que H2O2 augmentait de manière dose-dépendante hsa-miR-4535 et supprimait l'ARN de Smad4. (Figure 6A, 6B). De plus, cette tendance dans l'expression de hsa-miR-4535 et Smad4 a été inversée après le traitement par cistanche, ce qui indique que la régulation de la signalisation Smad peut être impliquée dans l'atténuation médiée par les cistanches des dommages aux cellules HS68 induits par H2O2- ( Figure 6C, 6D). Pris ensemble, ces résultats suggèrent que le cistanche atténue l'altération de la voie TGF/Smad induite par H2O2- en régulant à la baisse l'expression de hsa-miR-4535 dans les fibroblastes dermiques de la peau humaine.


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Figure 4. Cistanche atténue l'altération de la voie de synthèse du collagène TGF/Smad induite par H2O2- dans les cellules HS68. (A) Les cellules HS68 ont été exposées à H2O2 (200 µM) pendant 1 h, puis traitées avec du cistanche (30 µM) pendant 23 h. L'expression protéique des composants de la voie liée à la synthèse du collagène (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) et la protéine liée à la dégradation du collagène (MMP-1) ont été détectées par western blot. (B) L'expression protéique de p-smad2/3, Smad4 dans les fractions nucléaire et cytosolique a été détectée par western blot. GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. Les valeurs sont indiquées sous forme de moyenne ± SE. La quantification des résultats est indiquée (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 vs. cellules témoins non traitées; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 vs H2O2-cellules traitées. (C) L'anticorps anti-p-Smad2/3, Smad4 et l'anticorps secondaire conjugué FITC/PE ont été utilisés pour détecter l'expression de p-Smad2/3 (vert), Smad4 (rouge). DAPI a indiqué l'emplacement du noyau (bleu). Les images ont été capturées à l'aide d'un microscope à fluorescence (200×).


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La modulation de Smad4 par hsa-miR-4535 est impliquée dans la synthèse de collagène dans les fibroblastes cutanés humains exposés à H2O2-

Pour déterminer plus en détail les mécanismes par lesquels hsa-miR-4535 exerce son effet sur l'expression de Smad4 et sa signalisation en aval dans les cellules HS68, nous avons transfecté des cellules HS68 avec des imitateurs ou des inhibiteurs de hsa-miR-4535 et mesuré Smad4 et son expression de collagène en aval. Les résultats ont démontré que l'inhibition de hsa-miR-4535 par l'inhibiteur de hsa-miR-4535 a inversé de manière significative la régulation à la baisse de l'ARNm de Smad4 et l'expression des protéines dans les cellules HS68 traitées à l'H2O2- (Figure 7A–7C) . De plus, la suppression de hsa-miR-4535 partiellement restaurée H2O2- a induit une altération de COL1A1 et COL3A1 dans les cellules HS68 traitées par H2O2- (Figure 7C).

À l'inverse, l'expression améliorée de hsa-miR -4535 à la suite de la transfection mimique de hsa-miR -4535 a bloqué la régulation à la hausse médiée par les cistanches de Smad4 dans les cellules HS68 exposées à H2O2 (Figure 7D–7F). La surexpression de a miR-4535 a partiellement réduit les niveaux de COL1A1 et COL3A1 induits par les cistanches (Figure 7F). La surexpression de hsa-miR-4535 (Figure 8A–8C) ou l'inhibition de Smad4 par l'ARNsi (Figure 8D, 8E) a entraîné une réduction de la synthèse de collagène sous traitement cistanche après exposition à H2O2. Étonnamment, nous avons constaté que les deux directs Smad4

le silençage et les traitements avec hsa-miR-4535 imitent la synthèse de collagène induite par la cistanche inversée dans les cellules HS68 traitées à l'H2O2-. Pris ensemble, nous avons conclu que la synthèse de collagène régulée par cistanche, potentiellement via la diminution du niveau de hsa-miR-4535 pour améliorer la signalisation Smad4 dans les cellules HS68 exposées à H2O2.


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Figure 5. Hsa-miR-4535 cible Smad4. (A) L'expression de microARN dans les cellules HS68 traitées avec cistanche a été évaluée à l'aide de puces à ADN. (B) Diagramme de Venn illustrant les candidats potentiels d'ARNm qui peuvent être régulés par hsa-miR-4535 basé sur les bases de données miRDB et TargetScanHuman. Analyse de séquence des sites putatifs de liaison aux miARN dans l'ARNm de Smad4-3′-UTR pour hsa-miR-4535. Les correspondances sont indiquées par des lignes droites. (C) Les cellules HS68 ont été co-transfectées avec Smad4-3′-UTR-WT (type sauvage ; 0.5 µg/mL) plus hsa-miR-4535 mimique (2{ {25}} nM) ou Smad4-3′-UTR MT (mutant ; 0.5 µg/mL) plus hsa-miR-4535 mimique (20 nM) pendant 24 h. L'activité de la luciférase a été déterminée et normalisée à celle de Renilla. La quantification des résultats est affichée (n=3) ; ***P < 0,001, par rapport au groupe mimique Smad4-3′-UTR-MT plus hsa-miR-4535. G1=contrôle, G2=cistanche (10 μM), G3=cistanche (30 μM)



cistanche améliore la voie de synthèse du collagène TGF/Smad et atténue la sénescence dermique ainsi que l'inhibition de l'expression de hsa-miR-4535 dans les cellules HS68 exposées aux UVBComme la lumière UV joue un rôle important dans divers troubles du derme cutané, y compris l'inflammation, l'immunosuppression, le cancer et le vieillissement prématuré [30–32], nous avons examiné l'effet du cistanche sur la signalisation liée à la synthèse du collagène dans les cellules HS68 exposées aux rayons UVB. Les niveaux de protéines des composants de la voie TGF/Smad et des COL1A1 et COL3A1 en aval ont diminué dans les cellules HS68 traitées aux UVB, mais ont été efficacement régulés à la hausse après le traitement par cistanche (figure 9A).

Les résultats du transfert Western ont confirmé que le cistanche supprimait l'expression de MMP-1 renforcée par les UVB dans les cellules HS68 (figure 9A). De plus, nous avons clarifié l'effet anti-âge du cistanche dans les cellules HS68 soumises à une exposition aux UVB en démontrant que le cistanche réduisait l'élévation induite par les UVB des niveaux de p16 et p21 (figure 9A). Pour évaluer si le cistanche pouvait atténuer la dégradation du collagène induite par les UVB par l'inhibition de hsa-miR-4535 ciblant Smad4, nous avons étudié les niveaux de hsa-miR-4535 et de Smad4 dans les cellules co-traitées aux UVB et au cistanche à l'aide de la qPCR. Nous avons constaté que l'expression de hsa-miR-4535 était significativement régulée à la hausse dans les cellules exposées aux UVB, mais diminuait après le traitement par cistanche. Inversement, l'expression de Smad4 a été supprimée par l'exposition aux UVB et cette suppression a été nettement inversée par le traitement cistanche (Figure 9B, 9C). Collectivement, nos résultats suggèrent que le cistanche exerce des effets similaires à ceux de H2O2 pour restaurer la diminution induite par les UVB de la formation de collagène en réprimant les niveaux de hsa-miR-4535 afin de favoriser la signalisation Smad4 dans les cellules HS68.



L'application topique de cistanche atténue l'hyperplasie cutanée induite par les UVB et la dégradation du collagène et améliore la signalisation TGF / Smad dans lepeau dorsale de souris nude C57BL6/JPour élucider l'effet photoprotecteur du cistanche sur les lésions cutanées induites par les UVB in vivo, nous avons évalué le niveau de microARN -4535, Smad4 et les altérations des tissus cutanés. La figure 10A montre le schéma de la conception expérimentale et la chronologie de l'application topique de cistanche après irradiation UVB sur la peau dorsale de souris nude C57BL6/J. La formation de rides a été observée sur les coupes de peau dorsale des souris C57BL/6J du groupe exposé aux UVB. L'application topique de cistanche a considérablement réduit la formation de rides, indiquant l'augmentation médiée par le cistanche de la teneur en collagène pour maintenir l'intégrité de la peau (Figure 10B). De plus, l'analyse histologique de la couche dermique a montré que la teneur et la densité du collagène dans la peauétaient significativement plus faibles dans le groupe irradié aux UVB par rapport à celui du groupe témoin excipient. Cependant, l'application topique de cistanche (12 mg/kg et 24 mg/kg) a favorisé une augmentation de la teneur et de la densité en collagène de manière dose-dépendante par rapport à celle des souris soumises à une irradiation UVB (Figure 11). La morphologie de la peau a été évaluée par coloration H&E. UVBl'exposition a augmenté l'épaisseur de l'épiderme par rapport au groupe témoin du véhicule. Cependant, l'application topique de cistanche a significativement atténué l'hyperplasie épidermique induite par les UVB (Figure 11). De plus, la coloration immunohistochimique de -gal a indiqué l'application de cistanche réduit l'expression élevée de -gal dans la peau irradiée aux UVB (figure 11). Pour déterminer si cistanche peut améliorer la perte de fibres de collagène induite par les UVB via la régulation négative de hsa-miR -4535 pour améliorer Smad4 in vivo, son expression d'ARN a été évaluée dans l'échantillon de peau dorsale excisé par qRT-PCR. L'expression de hsa-miR-4535 était élevée dans la peau irradiée par les UVB, mais significativement supprimée dans la peau traitée au cistanche à des doses faibles et élevées. De plus, les faibles niveaux d'expression de l'ARN Smad4 dans la peau irradiée aux UVB ont été restaurés par un traitement cistanche (Figure 12A, 12B)


De plus, l'application de cistanche a sauvé l'expression des protéines TGF, psmad2/3 et Smad4 dans le tissu cutané altéré par les UVB (figure 12C). Nos résultats ont indiqué que cistanche pourrait potentiellement protéger la peau des dommages induits par les UVB en inhibant hsamiR-4535 pour améliorer l'expression de Smad4 pour l'activation de P-smad2/3 pour finalement favoriser la synthèse de collagène (Figure 13).


Cistanche Anti-Aging

Figure 9. cistanche améliore la voie de synthèse du collagène TGF/Smad et atténue la sénescence dermique ainsi que l'inhibition de l'expression de hsa-miR-4535 dans les cellules HS68 exposées aux UVB. Les cellules HS68 ont été exposées aux UVB (40 mJ/cm2 ) puis traitées au cistanche (30 µM) pendant 23 h. (A) Expression protéique des composants de la voie liée à la synthèse du collagène (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), protéine liée à la dégradation du collagène (MMP{{20}}) et sénescence- marqueurs associés (p16 et p21) a été détecté par western blot. GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. (B et C) L'expression d'ARN de hsa-miR-4535 et Smad4 a été détectée par qRT-PCR. Les valeurs sont indiquées sous forme de moyenne ± SE. La quantification des résultats est indiquée (n=3) *P < 0.05, **P < 0,01, vs cellules témoins non traitées ; #P < 0,05, ##P < 0,01 vs cellules exposées aux UVB.

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