Marqueurs de qualité de Cistanches Herba basés sur la relation spectre-effet antioxydant

Abstrait

Objectif : Etablir une méthode de recherche sur les marqueurs de qualité (Q-markers) desCistanches Herba(CH)basé sur lerelation spectre-effet antioxydant, fournissant une base pour l'étude de ses substances pharmacologiques et le contrôle de la qualité. Méthodes : La chromatographie liquide à ultra haute performance (UPLC) a été utilisée pour établir des profils d’empreintes digitales pour 10 lots de CH. Un modèle de dommages oxydatifs cellulaires a été établi en utilisant H2O2, et la capacité antioxydante du CH a été déterminée sur la base de la concentration inhibitrice semi-maximale des espèces réactives de l'oxygène, ainsi que des niveaux de superoxydedismutase et de catalase comme indicateurs pharmacologiques. La relation spectre-effet a été construite au moyen d'une analyse des composantes principales, d'une analyse de corrélation de Pearson et d'une analyse de régression par les moindres carrés partiels. Les composants actifs ont été soumis à une validation pharmacologique. Résultats : Des profils d'empreintes digitales pour CH ont été établis par UPLC, identifiant 17 pics courants. Sur la base d'une analyse de corrélation spectre-effet, neuf composants ont été sélectionnés. Les résultats de validation pharmacologique ont indiqué que l'acide géniposidique, l'acide 8-épiloganique,échinacoside, acéoside,isoactéoside, ettubuloside Aprésentait une activité antioxydante dépendante de la concentration. Conclusion : Cette étude a exploré les marqueurs Q du CH sur la base de la relation spectre-effet, fournissant des informations de référence pour le fondement de ses substances pharmacologiques et l'amélioration des normes de qualité.

Mots clés:Cistanches Herba; Marqueur Q ;relation spectre-effet; antioxydant

EXTRAIT DE CISTANCHE BIO AVEC 30% D'ÉCHINACOSIDE ET 12% D'ACTÉOSIDE POUR LA FONCTION RÉNALE

Cistancheest la tige charnue séchée aux feuilles écailleuses de Cistanche deserticola YCMa ou Cistanche tubulosa (Schenk) Wight, plante appartenant au genre Cistanche de la famille des Orobanchiaceae. Il a été enregistré pour la première fois dans la « Materia Medica de Shen Nong » et est répertorié comme étant de première qualité [1]. Il est de nature chaude, au goût sucré et salé ; il retourne vers les méridiens des reins et du gros intestin ; il a pour effets de nourrir le yang des reins, de reconstituer l'essence et le sang, d'humidifier les intestins et de laxatif, et est un médicament important pour tonifier les reins et reconstituer l'essence [2-3]. Les reins stockent l’essence, et l’essence et le sang proviennent de la même source. Si l’essence et le sang sont déficients, cela affectera les activités vitales globales du corps humain ; la moelle productrice d'essence est stockée dans les os et le cerveau est la mer de moelle. Si l'essence des reins est insuffisante, les os perdront leur nourriture et le cerveau sera déficient, entraînant des changements dégénératifs osseux tels qu'une texture lâche, une perte de dents, une perte de mémoire, une démence et une diminution de la fonction immunitaire [4-6]. Cistanche deserticola contient des glycosides de phényléthanol, des iridoïdes, des lignanes et d'autres composants structurels, notamment l'échinacéaside, le verbascoside, l'isorbascoside, l'acide génipinique et l'acide 8- épistryanique. , tubuline A, etc. [7]. Le contrôle de qualité actuel du Cistanche deserticola dans l'édition 2020 de la « Pharmacopée de la République populaire de Chine » stipule uniquement la teneur en échinacéaside et en verbascoside, ce qui ne peut pas refléter pleinement les caractéristiques d'action multi-composants et multi-cibles de la médecine traditionnelle chinoise. , ce qui n’est pas propice à son contrôle qualité et à son évaluation.

Afin d'améliorer le niveau de contrôle qualité de la médecine traditionnelle chinoise et d'optimiser l'évaluation de la qualité de la médecine traditionnelle chinoise, l'académicien Liu Changxiao a proposé le nouveau concept de marqueur de qualité (Q-marker) de la médecine traditionnelle chinoise [8]. Parmi eux, « l'efficacité » est l'élément central des « cinq principes » du Q-marker [9] et est également au cœur de l'évaluation de la qualité des médecines traditionnelles chinoises.

Compte tenu de l'état actuel de la recherche, caractérisé par une faible corrélation entre les normes de qualité et l'efficacité des médicaments, l'exploration des marqueurs Q des médecines traditionnelles chinoises et l'établissement de normes de qualité plus scientifiques et raisonnables revêtent une grande importance pour améliorer la qualité des médecines traditionnelles chinoises. La relation spectre-effet consiste à relier les pics chromatographiques des empreintes digitales de la médecine traditionnelle chinoise avec des données pharmacodynamiques spécifiques pour trouver les substances efficaces de la médecine traditionnelle chinoise, reflétant ainsi la qualité inhérente de la médecine traditionnelle chinoise [10]. L'établissement d'un modèle mathématique d'efficacité spectrale peut clarifier le QMarker de la médecine traditionnelle chinoise d'un point de vue « holistique », fournissant davantage de référence pour le contrôle qualité ultérieur de la médecine traditionnelle chinoise, la formulation de normes de qualité et la sélection des ingrédients actifs. Cette étude utilise des empreintes digitales combinées au taux de demi-inhibition des espèces réactives de l'oxygène (ROS IC50), au contenu de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) pour étudier la relation spectre-effet de la médecine traditionnelle chinoise, et utilise l'analyse en composantes principales. (PCA) ), analyse de corrélation de Pearson (PCC) et analyse de régression partielle des moindres carrés (PLS) pour analyser de manière exhaustive le marqueur Q de Cistanche deserticola afin de fournir une base pour son contrôle qualité.

1 matériel

1.1 Échantillon

Cistanche désertiquea été récolté dans le comté de Yutian, au Xinjiang et dans la base de plantation de Cistanche deserticola Good Agricultural Practice (GAP) en Mongolie intérieure. Il a été identifié par le chercheur Zhang Tiejun du Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co., Ltd. comme étant Cistanche tubulosa (Schenk) Wight et Cistanche deserticola.

YC Ma, des informations détaillées sont présentées dans le tableau 1.

1.2 Médicament testé

L'échinacéaside (numéro de lot : 111670-201907, pureté : 91,8 %) et le verbascoside (numéro de lot : 111530-201914, pureté : 95,2 %) ont tous deux été achetés auprès de l'Institut chinois de contrôle des aliments et des drogues ; isorescoside (numéro de lot : 61303-13 -7), salidroside (numéro de lot : 10338-51-9), acide 8-épistrychnoïque (numéro de lot : 82509-41-9), acide génipinique (numéro de lot : Z24A10X95926) , tubérosine B (numéro de lot : 112516-04-08), 2-glycoside d'acétyleugénol (numéro de lot : 94492-24-7) ont été achetés auprès de Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., pureté supérieure ou égale à 98 % ; Le glycoside Cistanche A (numéro de lot : MUST -20062806, pureté : 98,51 %) et la vasculine A (numéro de lot : MUST19110102, pureté : 98,57 %) ont été achetés auprès de Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. ; De l'acétonitrile et de l'acide formique chromatographiquement purs ont été achetés auprès de la société Tianjin Concord Technology Co., Ltd.; Eau purifiée (Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd.). Vitamine E (VE, V8010, société Beijing Solarbio) ;

Diméthylsulfoxyde (DMSO, D2660-100ML, Sigma Company, États-Unis) ; Kit de détection de la prolifération cellulaire en solution unique CellTiter 96® AQueous (G3580, Promega Company, USA) ; Le kit de détection CAT (S0051), le kit de détection d'activité SOD S0101M) et le kit de détection ROS (S0033S) ont été achetés auprès de Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.

1.3 Instruments

Chromatographie liquide ultra haute performance Waters classe H-PDA (Waters Company, États-Unis) ; Balance électronique Sartorius BT25S (société Sartorius, Allemagne) ; Centrifugeuse de bureau à grande vitesse H1650 (Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.) ; SpectraMax M5

Lecteur de microplaques (Meigu Molecular Instrument Co., Ltd.) ; Microscope biologique WYS-41XDY (Tianjin Micro-Instrument Optical Instrument Co., Ltd.).

1,4 cellules

Des cellules rénales embryonnaires humaines HEK 293 ont été utilisées dans cette expérience et ont été achetées auprès de la banque de cellules de l'Académie chinoise des sciences.

2 méthodes

2.1 Etablissement de la carte d'empreintes digitales

2.1.1 Préparation de la solution d'essai : Peser 2 g de matière médicinale Cistanche deserticola, ajouter 10 fois la quantité d'eau, chauffer et refluer 3 fois, 1 h à chaque fois, centrifuger à 1.0 ×105r·min-1 pendant 15 min (le rayon centrifuge est de 300 mm), combiner les surnageants et concentrer pour obtenir une solution mère avec une concentration massique de 100 mg·mL-1, diluer 10 fois, et filtrez-le à travers une membrane filtrante microporeuse de 0,22 µm pour l’obtenir.

2.1.2 Préparation de la solution de référence mixte

Prenez de l'8-acide épistrrychnique, du salidroside, de l'échinacéaside, du cistanche glycoside A, de l'acide génipinique, du verbascoside, de l'anthocyanoside A, de l'isorbascoside et du 2'-acétyleugénol. Les substances de référence glycoside et angioside B ont été mesurées en quantités appropriées et pesées avec précision. Ajouter une solution de méthanol à 50 % pour dissoudre et préparer une solution de substance de référence mixte avec une concentration massique de 20 µg·mL–1.

2.1.3 Conditions chromatographiques

Colonne ACQUITY UPLC®BEH C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,7 µm) ; la phase mobile est l'acétonitrile (A) ~ 0, solution d'acide formique à 1 % (B), programme d'élution par gradient (0 ~ 6 min, 5 % ~ 8 % A ; 6 ~ 10 min, 8 % ~ 15 % A ; 10~13 min, 15 %~19 %A, 13~20 min, 19 %~25 %A) ; la longueur d'onde de détection est de 237 nm ; le débit est de 0,4 mL·min –1 ; la température de la colonne est de 40 degrés ; le volume d’injection est de 3 µL.

2.1.4 Sélection du pic de référence

Dans le chromatogramme de chromatographie liquide ultra-performante (UPLC) de Cistanche deserticola, le pic présentant le plus grand rapport de surface de pic, un temps de rétention modéré et une bonne séparation a été sélectionné comme pic de référence du spectre d'empreintes digitales.

2.1.5 Revue méthodologique

Test de précision : prélever l'échantillon T1 et préparer la solution d'essai selon la méthode décrite en 2.1.1. Injectez l'échantillon 6 fois en continu et enregistrez l'empreinte digitale. Les résultats montrent que la surface relative du pic RSD de chaque pic est de 0,10 % ~ 4,61 %, et le temps de rétention relatif RSD est de 0,08 % ~ 1,32 %, ce qui indique que l'instrument a une bonne précision.

Test de répétabilité : prélevez l'échantillon T1 et préparez 6 échantillons de la solution d'essai en parallèle selon la méthode décrite en 2.1.1, et injectez l'échantillon en continu. Les résultats montrent que la surface relative du pic RSD de chaque pic chromatographique est de 1,35 % à 4,80 %, et que le temps de rétention relatif RSD est de 0,10 % à 1,80 %, ce qui répond aux exigences de l'empreinte digitale et montre que la répétabilité de l'instrument est bon.

Test de stabilité : prélevez l'échantillon T1 et préparez la solution de test selon la méthode décrite en 2.1.1, injectez des échantillons pour le test à 0, 2, 4, 8 et 12 heures et enregistrez l'empreinte digitale. Le RSD calculé de la surface relative du pic de chaque pic chromatographique est de 0,53 % ~ 4,82 %, et le RSD du temps de rétention relatif est de 0,09 % ~ 2,17 %, ce qui répond aux exigences. de l'empreinte digitale et indique que le produit testé est stable dans les 12 heures.

2.2 Recherche sur l'effet antioxydant de Cistanche deserticola

2.2.1 Préparation de la liqueur mère de Cistanche deserticola

Prendre la liqueur mère au point 2.1.1, la filtrer et la stériliser, puis la diluer avec du milieu de culture à la concentration requise avant utilisation.

2.2.2 Cistanche deserticola et contrôle positif

L'effet de VE sur la viabilité des cellules HEK 293 a été défini comme groupe normal (suspension cellulaire), groupe d'administration de Cistanche deserticola (25, 50, 100, 200, 400 µg·mL–1), groupe VE (20, 40, 60 , 80, 100 µmol·L–1), définir 6 puits en double pour chaque concentration, cultiver pendant 24 h, ajouter 20 µL de réactif en solution unique CellTiter 96® AQueous dans chaque puits pour détecter la viabilité cellulaire, continuer la culture pendant 2 h, et utilisez un lecteur de microplaques pour détecter la viabilité cellulaire à 490 nm. La valeur d'absorbance (OD) de chaque puits a été utilisée pour calculer le taux de survie cellulaire selon la formule (1). Taux de survie (%)=(groupe expérimental OD/groupe vierge OD) × 100 % (1)

2.2.3 Cistanche deserticola sur induction H2O2

Effet des ROS sur les cellules HEK 293. Les cellules ont été divisées en groupe normal (suspension cellulaire) et groupe d'administration de Cistanche deserticola (6,25, 12,5, 25, 50, 100 µg·mL–1 Cistanche deserticola et 60 µm·L–1 H2O2) et cultivées pendant 24 heures. Suivez les étapes du kit de détection ROS pour les opérations ultérieures, observez directement la coloration cellulaire au microscope et utilisez un lecteur de microplaques pour détecter l’intensité de fluorescence de chaque groupe. Les réglages des paramètres utilisaient une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une longueur d’onde d’émission de 525 nm. L'expérience a été répétée trois fois.

2.2.4 Paire de Cistanche deserticola

Effet du H2O2 sur la SOD dans les cellules HEK 293. Les cellules ont été divisées en groupe normal (suspension cellulaire), groupe modèle (60 µm·L–1 H2O2), groupe VE (60 µm·L–1 VE et 60 µm·L–1 H2O2), groupe d'administration de Cistanche deserticola (100 µg·mL–1 Cistanche deserticola et 60 µm·L–1 H2O2), collecter les cellules après 24 h de culture, ajouter la solution de préparation d'échantillon de SOD pour lyser les cellules et centrifuger à 4 degrés et 12 000 r·min{{22} } min (le rayon de centrifugation est de 300 mm), prenez le surnageant comme échantillon à tester et suivez les étapes du kit de détection SOD pour les opérations ultérieures. L'expérience a été répétée trois fois.

2.2.5 Cistanche deserticola sur induction H2O2

Les effets du CAT sur les cellules HEK 293 ont été traités selon la méthode décrite en 2.2.4 et regroupés en groupes. Après traitement, ajoutez la solution de lyse, centrifugez à 4 degrés et 12 000 r·min-1 pendant 10 min (le rayon de centrifugation est de 300 mm), prélevez le surnageant et suivez Suivez les étapes du kit de détection CAT pour les opérations ultérieures . L'expérience a été répétée trois fois.

2.2.6 Analyse statistique

Le logiciel SPSS 26.0 a été utilisé pour l'analyse statistique. Chaque groupe de données était représenté par (±±(). Une analyse unidirectionnelle de la variance a été effectuée sur les données conformes à la distribution normale. Si les variances étaient égales, la méthode de la différence la moins significative a été utilisée. Si les variances étaient inégal, la méthode T3 de Dunnett a été utilisée pour la représentation graphique, et P.<0.05 was considered as a statistically significant difference.

2.3 Analyse de corrélation spectre-effet de l'antioxydant Cistanche deserticola

2.3.1 PCA Les zones des pics communs de 10 lots de Cistanche deserticola qui ont des empreintes digitales établies ont été normalisées par la valeur Z et transformées en une matrice de données d'ordre 10 × 17, qui a été importée dans le logiciel SPSS 26.0. pour l'APC.

2.3.2 PCC

SPSS 26.0 a été utilisé pour effectuer une analyse bivariée afin d'étudier la relation d'efficacité spectrale entre les empreintes digitales de Cistanche deserticola et les antioxydants. Le test de signification a été réalisé à l'aide d'un test bilatéral (T), avec P<0.05 as the standard for statistically significant differences.

2.3.3 SVP

Importez les résultats expérimentaux de la zone de pic standardisée et de l’antioxydant de Cistanche deserticola dans le logiciel SIMCA-P 14.1, définissez la zone de pic comme variable X et définissez l’indice pharmacodynamique comme variable Y pour effectuer le PLS.

2.4 Vérification de l'activité antioxydante du marqueur Q de Cistanche deserticola

2.4.1 Préparation de la solution mère de principes actifs. Pesez avec précision les quantités appropriées d'acide génipinique, d'acide 8-épistrichnique, d'échinacéaside, de verbascoside, d'isorébascoside et d'anthocyanoside A, et ajoutez du DMSO pour les dissoudre dans une solution de référence de 10 mmol·L-1.

2.4.2 Effet des principes actifs sur la cytotoxicité de HEK 293.

Après avoir incubé les cellules HEK 293 pendant 24 heures, ajouter différentes concentrations de solutions de principes actifs sous 2.4.1 dans chaque puits (0.781, 1,563, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100 µmol·L–1 ) 100 µL, stimulation continue

Après que les cellules ont été incubées pendant 24 heures, le réactif en solution unique CellTiter 96® AQueous a été ajouté pour détecter la viabilité cellulaire.

2.4.3 L'effet antioxydant des ingrédients actifs sur les cellules HEK 293 induites par H2O2-.

Les cellules sont regroupées comme suit : le groupe normal, le groupe modèle et le groupe VE sont regroupés selon 2.2.4. Groupe expérimental (0,781, 1,563, composition d'activité de 3,125 µm·L–1 et 60 µm·L–1 H2O2), cultivé pendant 24 h. Déterminer les niveaux intracellulaires de ROS, les teneurs en enzymes SOD et CAT selon les méthodes décrites en 2.2.3, 2.2.4 et 2.2.5 respectivement.

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