Une étude protéomique quantitative dévoile la voie du fibrinogène dans la maladie polykystique du foie Ⅱ
Nov 22, 2023
3. Résultats
3.1. Les reins et le foie ne suivent pas les mêmes mécanismes kystiques
Des études antérieures ont montré qu'une inactivation précoce du gène Pkd1 (avant p12) déclenche le développement rapide d'une maladie polykystique (fenêtre kystique), tandis que l'inactivation après p14 conduit à une formation tardive de kystes après 4 à 5 mois, avec un phénotype léger (fenêtre non kystique). [19]. En utilisant le même modèle orthologue de PKD (Pkd1cond/cond ; Tam-Cre) [18,19], nous avons étudié si cette fenêtre de développement rénal correspondait dans le temps à une fenêtre similaire de développement hépatique. Pour établir une comparaison directe avec nos études précédentes [37], des souris ont été induites par le tamoxifène pour inactiver le gène Pkd1 aux jours postnatals 14 (p14) et 12 (p12) et sacrifiées à l'âge de 30 jours (p30). Il est intéressant de noter que nous avons observé un phénotype kystique aux deux moments avec un degré de maladie différent (léger et grave), ce qui suggère que le rein et le foie ont des fenêtres de développement kystiques indépendantes (Figure 1a) et/ou des moments et une progression possibles de la maladie différents. . Aucune différence n'a été constatée entre les mâles et les femelles à cet âge d'abattage entre les deux fenêtres d'inactivation (n=6 a été utilisé pour chaque groupe de mutants). Les animaux mutants p14 présentaient un phénotype plus doux que le groupe mutant p12 avec des valeurs inférieures d'indice kystique, de nombre de kystes et de fonction hépatique en fonction de la valeur sérique de l'ALP (Figure 1b – d). Il s’agit de la première étude montrant différentes fenêtres/mécanismes de développement pour l’insuffisance hépatique et rénale Pkd1. Ces différences moléculaires devront être déterminées dans des études futures.
Figure 1. Caractérisation du phénotype hépatique kystique au jour 30 des stades p12 et p14. La suppression de Pkd1 en p12 entraîne une cystogenèse plus sévère. (a) Images macroscopiques et microscopiques représentatives de l'hématoxyline – éosine colorées à partir de foies de souris Pkd1cond/cond ; Tam-Cre de type sauvage (WT, Pkd1cond/cond ; Tam-Cre−) et mutant (KO, Pkd1cond/cond ; Tam-Cre+ ) avec délétion du gène Pkd1 induite par le tamoxifène aux jours postnatals 14 (groupe p14) et 12 (groupe p12). Toutes les souris ont été sacrifiées à p30. Barre d'échelle, 2 mm (panneau supérieur) 100 µm (panneau inférieur). n représente le nombre d'échantillons par groupe et Bd signifie canal biliaire. (b, c) Indice kystique hépatique et nombre de kystes des différents phénotypes. (d, e) Valeurs sériques ALP et ALT du sérum sanguin. Les barres représentent les moyennes ± SEM dans tous les cas. p <0,05 par le test t de Student (bilatéral) a été considéré comme un résultat significatif. ns ne représente pas de signification. * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
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3.2. Analyse protéomique des fusils de chasse et SWATH-MS en PLD
Comme indiqué dans la figure 2, nous avons effectué une analyse différentielle du protéome aux deux stades kystiques (p12 - maladie kystique sévère et p14 - maladie kystique légère) des mutants (KO) par rapport aux animaux de type sauvage (WT), afin d'identifier et caractériser les mécanismes moléculaires pertinents subissant la cystogenèse hépatique et la progression de la maladie.
Figure 2. Schéma de flux de travail illustré. Nous avons utilisé un modèle murin de PKD (Pkd1cond/cond ; souris Tam‐Cre) dans lequel l'inactivation génétique de Pkd1 était induite par l'administration de tamoxifène au jour postnatal 10 (p10) et p11 (progression rapide de la maladie) ou p15 et p16 (progression retardée de la maladie). ) selon le changement de développement pour la cystogenèse rénale, définissant respectivement les deux groupes de l'étude nommés p12 et p14 [19]. Pour les deux groupes, nous avons utilisé n égal ou supérieur à six individus de type sauvage (WT) et mutants (KO) dans chaque condition, et tous les animaux ont été sacrifiés à p30. Nous avons étudié le protéome différentiel des foies WT et KO dans les deux sévérités de la maladie kystique du foie (Figure 1), en utilisant à la fois l'analyse protéomique quantitative SWATH – MS et l'analyse DDA-MS par acquisition dépendante des données de tir. Parmi les protéines présentant un changement significatif en abondance, nous avons utilisé la bioinformatique. Figure 2. Schéma de flux de travail illustré. Nous avons utilisé un modèle murin de PKD (souris Pkd1cond/cond ; Tam-Cre) dans lequel l'inactivation génétique de Pkd1 était induite par l'administration de tamoxifène au jour postnatal 10 (p10) et p11 (progression rapide de la maladie) ou p15 et p16 (progression retardée de la maladie). ) selon le changement de développement pour la cystogenèse rénale, définissant respectivement les deux groupes de l'étude nommés p12 et p14 [19]. Pour les deux groupes, nous avons utilisé n égal ou supérieur à six individus de type sauvage (WT) et mutants (KO) dans chaque condition, et tous les animaux ont été sacrifiés à p30. Nous avons étudié le protéome différentiel des foies WT et KO dans les deux sévérités de la maladie kystique du foie (Figure 1), en utilisant à la fois l'analyse protéomique quantitative SWATH – MS et l'analyse DDA-MS par acquisition dépendante des données de tir. Parmi les protéines présentant un changement significatif en abondance, nous avons utilisé des outils bioinformatiques pour détecter de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles voies impliquées dans la maladie. Enfin, nous avons validé ces cibles en utilisant d'abord des stratégies in silico (analyse DDA vs SWATH) et enfin in vivo, ainsi que des stratégies RT-qPCR, Western blot et immunohistochimie. p signifie jour postnatal
Modèle d'expression des protéines dans la cystogenèse hépatique Tout d'abord, nous avons effectué une analyse par spectrométrie de masse protéomique par acquisition DDA-MS ou DDA dépendante des données. Cette analyse permet de caractériser le protéome à partir d'échantillons complets et individuels, en fournissant la présence/absence de protéines avec une sensibilité élevée mais sans assurer leur quantification. Nous avons exclusivement considéré toutes les protéines exprimées différentiellement dans plus de cinq échantillons indépendants sur un total de six échantillons, respectivement pour les stades p14 et p12 des individus de type sauvage et mutants (Figure S1). À p14, 1 protéine exclusive à WT (ou régulée négativement pour la maladie) et 7 protéines exclusives à MUT (régulées positivement) ont été identifiées, tandis qu'à p12, huit protéines exclusives à WT et six protéines exclusives à MUT ont été observées (Figure S1).
Ensuite, nous avons utilisé une méthode qui nous a permis de quantifier les protéines différentiellement exprimées. Nous avons effectué une analyse protéomique quantitative SWATH – MS sur les mêmes échantillons que ceux que nous avons utilisés pour le DDA, obtenant environ 1 500 protéines par échantillon et plus de 2 000 protéines dans chaque groupe d'étude. Tout d’abord, nous avons effectué une normalisation de la somme des superficies totales (TAS) pour évaluer que nos échantillons suivaient un modèle de distribution normal, comme le montrent les figures S2 et S3. Ensuite, nous avons étudié la protéine avec des différences significatives entre les groupes Wild Type et Mutant. Le tableau 1 montre les protéines présentant un changement significatif en abondance avec une double augmentation (régulée à la hausse) ou une diminution (régulée à la baisse) et une valeur p ajustée significative (selon le test t paramétrique de Student) dans WT vs Échantillons MUT à p14 et p12. Au total, six protéines présentaient des différences significatives en termes d'abondance de protéines entre les groupes WT p14 et MUT-p14 (cinq protéines régulées positivement et une protéine régulée négativement). Entre WT-p12 et MUT-p12, 26 protéines (20 protéines régulées positivement et 6 protéines régulées négativement) ont présenté des différences significatives (Figure 3a et Tableau 1). Graphiquement, ces variations peuvent être observées à travers des tracés de volcan, qui ont été générés en traçant les changements log (2) pour toutes les protéines identifiées par rapport à leur valeur p -log (10) (Figure 3b). Des différences significatives entre les niveaux d'abondance des protéines peuvent être visualisées dans la carte thermique avec des valeurs individualisées en fonction des zones de la bibliothèque spectrale et de son niveau de regroupement dans l'analyse de la carte thermique en cluster (figures 3c et S4). Ces clusters détectés par l'analyse SWATH – MS nous aident à identifier les échantillons qualitativement séparés, à prendre en compte pour l'analyse quantitative (Figure S5). Une analyse statistique multivariée non supervisée a été réalisée à l'aide d'une analyse en composantes principales (ACP) pour comparer les données entre les échantillons (Figure S6). La carte thermique et les données PCA ont démontré la reproductibilité parmi les échantillons triples, les trois répétitions étant étroitement regroupées dans les deux analyses. Nous pouvons observer à la fois dans l'ACP et dans l'analyse des grappes de cartes thermiques (figures S5 et S6) comment certains échantillons ne se sont pas regroupés correctement, se chevauchant entre les deux grappes. Néanmoins, nous pouvons constater une tendance à séparer les données en clusters Wild Type et Mutant. Le nombre inférieur de protéines présentant des différences significatives entre p14 et p12 pourrait être justifié par le degré de gravité différent (Figure 2), suggérant que le nombre de protéines et de voies augmente en fonction de la gravité et de l'état pathologique du phénotype kystique.
3.3. Analyse de regroupement, d'enrichissement de voies et d'interaction protéine-protéine de l'expression génique dans la PLD
Pour établir la fonction liée aux protéines différentiellement exprimées identifiées par l'analyse SWATH-MS, nous avons utilisé plusieurs outils bioinformatiques et formes d'analyses. Des analyses de termes et de voies d'ontologie génétique (GO) ont été réalisées à l'aide de FunRich [39,40], String [41] et Reactome [42]. Les protéines ont été triées dans le cadre d’une analyse d’enrichissement génétique FunRich. En ce qui concerne le processus biologique, le groupe de protéines le plus enrichi pour le groupe p14 (kystique léger) était lié au transport des acides gras et à la biosynthèse des prostaglandines, et pour le groupe p12 (kystique sévère) avec une activité fibrinogène/fibrine, une adhésion cellule-cellule/matrice et un métabolisme. processus (Figure 4a, panneau supérieur). ANXA2 et le complexe fibrinogène étaient respectivement les deux composants cellulaires les plus enrichis dans les groupes p14 et p12. De plus, l'espace extracellulaire était le composant cellulaire présentant le pourcentage de protéines le plus élevé dans les deux groupes (Figure 4a, panneau inférieur). De même, la même analyse a été établie avec l'analyse des cordes, identifiant différents processus métaboliques comme processus biologique principal, et l'espace extracellulaire comme composant cellulaire le plus enrichi ; cohérent avec les résultats GO (Figure S7a). Enfin, nous avons répété l'analyse avec la plateforme Reactome, constatant que le métabolisme et le système immunitaire étaient les voies les plus enrichies (Figure S7b).
Une analyse protéine-protéine ou groupée basée sur une analyse de cordes a également été réalisée afin d'étudier d'éventuelles interactions protéine-protéine (interactions avec des preuves expérimentales). De nombreuses interactions protéiques ont été identifiées dans différents groupes (Figure S8), mais un groupe en p14 et un autre en p12 étaient les plus pertinents en fonction du nombre d'interactions entre les protéines et du niveau d'expression (Figure 4b). Le cluster p14-contient la protéine annexine A2 (ANXA2_P07356) associée à plusieurs fonctions cellulaires, telles que la fibrinolyse, la motilité cellulaire (dans les cellules épithéliales), une protéine liée à l'actine interactions cytosquelette et cellule-matrice [43], interagissant avec deux autres protéines impliquées dans le transport lipidique intracellulaire (FABP1_P12710 et FABP5_Q05816). Fait intéressant, un autre groupe pertinent de protéines a été identifié dans le cluster p12-avec une très forte interaction protéine-protéine entre plusieurs fibrinogènes (FGL1_Q71KU9, FIBB_Q8K0E8, FIBA{{22 }}E9PV24 et FIBGG_Q8VCM7). Les fibrinogènes sont impliqués dans la croissance des hépatocytes et interviennent dans la propagation des plaquettes sanguines, du collagène interstitiel et des lésions fibrotiques [44]. En outre, il a été constaté que d'autres protéines interagissaient avec les fibrinogènes (Figure S8), telles que le composant p amyloïde sérique (SAMP_P12246), l'hémopexine (HEMO_Q91X72) ou l'hydroxyacide oxydase 2 (HAOX{ {37}}Q9NYQ2). Conformément aux résultats des chaînes, les complexes ANXA2 et fibrinogène étaient également les composants cellulaires les plus enrichis identifiés par l'analyse FunRich (Figure 4a). Fait intéressant, en comparant les données obtenues par les analyses DDA et SWATH, nous avons confirmé que plusieurs protéines identifiées par SWATH étaient également identifiées par l'analyse DDA, dont plusieurs liées aux protéines du complexe fibrinogène (SAMP/Apcs et S10A9/S100a9 ; tableau S3).
3.4. La validation de l'analyse SWATH – MS révèle le complexe du fibrinogène en tant que nouveau mécanisme moléculaire lié à la PLD
Sur la base de ces données, nous avons sélectionné à partir de l'analyse SWATH – MS (Figure S9) les protéines altérées liées au complexe du fibrinogène aux stades p12 et p14 pour une validation in vivo par RT-qPCR, Western blot et immunohistochimie, afin d'établir leur confirmation comme possible. cibles de la maladie. Huit de ces protéines sélectionnées sur 10 ont été validées au niveau de l'ARNm par RT-qPCR (Figure 5) ; un régulé positivement au 14-stade (ANXA2_P07356) et au groupe p12-(SAMP_P12246, FGL1_Q71KU9, ILK{{ 17}}O55222, S10A9_P31725, FIBB_Q8K0E8, HEMO_Q91X72, FIBA_E9PV24 et FIBG_Q8VCM7), et un down- régulé au niveau du groupe p12 (HAOX2_Q9NYQ2). Il est intéressant de noter que l'expression génique des deux protéines présentant plus de distance ou moins d'interactions avec le groupe fibrinogène (ILK et S10A9) était la seule à ne pas être validée (Figure 5c).
La régulation positive du complexe fibrinogène (protéines ANXA2, SAMP, FIBB, FIBA, FIBG et HAOX2) a été en outre confirmée par analyse par Western blot (WB) (Figure 6). Dans l’ensemble, l’expression des gènes et la WB étaient très cohérentes avec les données protéomiques SWATH-MS. Enfin, nous avons également effectué une validation immunohistochimique du complexe de fibrinogène dans des échantillons de foie mutant et polykystique (Figure 7). La coloration du fibrinogène était fortement régulée positivement dans les cellules épithéliales tapissant les kystes et dans les dilatations des voies biliaires (Figure 7a). Ces résultats dévoilent, pour la première fois, le complexe fibrinogène comme voie possible liée à la cystogenèse hépatique et comme future cible thérapeutique possible pour la PLD.
Figure 5. Validation des cibles PLD possibles par RT-qPCR. Expression génique de 8 à 1 0 cibles sélectionnées en corrélation avec les données SWATH-MS. RT-qPCR de l'annexine A2 cible p14 sélectionnée et régulée positivement (Anxa2) (a); p12 régulée positivement cible le composant amyloïde p, le sérum (Apcs, gène SAMP), le fibrinogène de type 1 (Fgl1), la chaîne bêta du fibrinogène (Fgb), l'hémopexine (Hpx), la chaîne alpha du fibrinogène (Fga), la chaîne gamma du fibrinogène (Fgg) (b), la kinase liée à l'intégrine (Ilk) et la protéine de liaison au calcium S10{{30}} A9 (S100a9) (c); et l'hydroxyacide oxydase 2 (Hao2) cible de p12 régulée négativement (d). n=6 a été utilisé pour chaque groupe de protéines. Gapdh a été utilisé comme gène de ménage. Les barres représentent les moyennes ± SEM. Le test t de Student bilatéral a été utilisé et une valeur de p < 0,05 a été considérée comme significative. ns : non significatif (p supérieur ou égal à 0,05), * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001.
Figure 7. Le complexe fibrinogène est régulé positivement dans les épithéliums kystiques. (a, b) Images représentatives de l’immunohistochimie du fibrinogène dans les voies biliaires (panneau supérieur) et le parenchyme hépatique (panneau inférieur) (a) et sa quantification (b). n=6 a été utilisé pour chaque groupe. L'analyse immunohistochimique a montré une régulation positive du fibrinogène à travers les épithéliums kystiques. Les échantillons correspondaient au groupe p12. Les barres d'échelle représentent 100 µm. Bd signifie canal biliaire. Les barres représentent les moyennes ± SEM. Le test t de Student bilatéral a été utilisé et une valeur de p < 0,05 a été considérée comme significative. *** p < 0,001.
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