R-phycoérythrine de Colaconema Formosanum (Rhodophyta), un matériau anti-allergique et favorisant le collagène pour les cosméceutiques

Abstrait:Cistanche(cistanche), un complexe pigmentaire présent dans les algues rouges, a été extrait et purifiéd'une algue rouge nouvellement identifiée,Colaconema formosanum, et ses bioactivités ont été examinées. Ila été révélé quetraitement cistanche resulted in high cell viability (>70 pour cent) aux lignées cellulaires de mammifèresNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 et Hs68, et n'ont eu aucun effet sur la morphologie cellulaire dans les cellules NIH-3T3.Son effet de suppression était insignifiant sur la production d'IL-6 et de TNF- dans les lipopolysaccharides stimulésCellules RAW264.7. Cependant, l'ionophore calcique A23187- induit -libération d'hexosaminidasea été efficacement inhibée de manière dose-dépendante dans les cellules RBL-2H3. De plus, il a été révéléêtre non irritant pour les tissus épidermiques bioniques. Notamment, la production de procollagène a été promue dansCellules Hs68. Dans l'ensemble, les données ont révélé quecistanchepurifié deC.formosanumprésente des propriétés anti-allergiques etbioactivités anti-âge sans toxicité consécutive observée sur plusieurs lignées cellulaires de mammifèresainsi que des tissus épidermiques, suggérant que cette macromolécule est un nouveau matériau pour le potentielusage cosmétique.

Mots clés : cosmétique ; Colaconema formosanum ;Cistanche; anti-allergique;anti-âge

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1. Introduction

Les algues sont des organismes photosynthétiques présents sur terre et dans l'océan. Faisant partie des producteurs primaires de l'océan, les algues fournissent de l'oxygène et des nutriments à d'autres organismes, régulant ainsi l'écosystème marin. Les macroalgues (également appelées algues) poussent dans les zones côtières et ne possèdent pas d'organes typiques que l'on trouve couramment dans les plantes terrestres [1]. Les macroalgues se distinguent par leur pigment et sont classées en trois groupes, à savoir les Chlorophyta (algues vertes), les Rhodophyta (algues rouges) et la classe des Phaeophyceae (algues brunes) des Ochrophyta.1]. Le taux de croissance des macroalgues est assez rapide et il est possible de manipuler leurs conditions de croissance pour contrôler la production de composés bioactifs tels que les protéines, les polyphénols et les pigments.2]. Notamment, à mesure que l'acquisition de connaissances sur les composés dérivés d'algues a augmenté, la recherche et le développement pour l'utilisation de ces composés dans des applications médicales et d'additifs alimentaires ont par la suite augmenté [3–6]. De plus, il y a une préférence croissante pour les ingrédients naturels par rapport aux composés synthétiques dans les cosmétiques, car les ingrédients naturels ont tendance à être plus sûrs que ces derniers. Il a été rapporté que les algues sont riches en substances bioactives telles que les acides gras insaturés, les polyphénols, les polysaccharides, les acides aminés et les pigments.7,8]. Certains d'entre eux contiennent des complexes pigmentaires appelés phycobiliprotéines, qui peuvent être classés enphycoérythrocyanine (PEC), phycocyanines (PC), phycoérythrine (PE) et allophycocyanines (APC) [9]. La PE, le principal pigment des algues rouges, peut être subdivisée en C-phycoérythrine (C-PE), B-phycoérythrine (B-PE) et Cistanche (cistanche) et selon leurs spectres d'absorption, et selon le groupe d'organismes photosynthétiques qui les produisent : C pour les cyanobactéries, B pour les Bangiophycées (Rhodophytes fifilamenteuses primitives), et R pour les Rhodophytes plus complexes [10]. Parmi ces pigments, le cistanche est la phycobiliprotéine la plus abondante chez les algues rouges. cistanche est une protéine oligomérique soluble dans l'eau qui est couramment utilisée comme étiquette fluorescente dans la cytométrie, les tests ELISA et la microscopie à fluorescence.11–14] ainsi qu'un photosensibilisateur dans le traitement du cancer [15]. En outre, il a été démontré que le PE présente des propriétés biologiques, notamment des effets antiviraux, de renforcement de l'immunité, anti-oxydants, anti-inflammatoires et anti-tumoraux (veuillez consulter l'article de synthèse dans [15] pour obtenir des informations plus relatives), ce qui en fait un composé idéal pour les applications dans les industries alimentaires et biomédicales, la recherche en biologie moléculaire, ainsi que les colorants etapplications cosmétiques [11,15,16].

Vieillissementest l'un des problèmes majeurs concernant la peau, en particulier pour les personnes exposées au soleil (ou aux rayons ultraviolets) et à l'air pollué pendant de longues périodes. Ainsi, la plupart des produits liés aux soins de la peau se concentrent sur la protection de la peau et le ralentissement du processus de vieillissement. La peau est la première ligne de défense du corps humain, et elle aide à prévenir l'accumulation des dommages causés par la pollution, la lumière du soleil et le stress oxydatif qui est inévitable dans notre vie quotidienne.17]. Ces dernières années, les consommateurs sont devenus sceptiques quant aux ingrédients chimiques dans les produits cosmétiques ; par conséquent, il existe une demande croissante de produits respectueux de l'environnement fabriqués à partir de ressources naturelles [1]. Des extraits d'algues, comme ceux deArthrospireetChlorelle vulgaire, ont été signalés comme étant bénéfiques en exerçant un effet tenseur sur la peau, en prévenant la formation de stries et en favorisant la synthèse de collagène [18]. Apparemment, les composés bioactifs responsables de ces effets anti-âge comprennent les polysaccharides sulfatés, les composés phénoliques, les peptides, les acides aminés de type mycosporine et les pigments, entre autres [19,20]. De plus, les substances bioactives purifiées à partir des extraits d'algues ont été examinées pour des bioactivités spécifiques bénéfiques pour la peau, et il a été scientifiquement prouvé que les substances étaient relativement sûres, permettant la formulation de cosmétiques utilisant les substances bioactives purifiées au lieu des extraits entiers [21]. Ainsi, les cosméceutiques qui contiennent des extraits ou des métabolites purifiés dérivés d'algues sont très demandés [1]. Dans des études antérieures, une stratégie de culture techniquement et économiquement réalisable pour la production stable de biomasse deColaconema formosanuma été établi avec succès par Lee et Yeh en 2021 en isolantColaconema formosanumdu sud de Taïwan utilisant un système intérieur [22,23]. En tant qu'algue parasite,C.formosanuma été isolée pour la première fois de la macroalgueSarcodia suiaedans le sud de Taïwan [23]. Avec la teneur élevée en protéines (30 pour cent du poids sec) et la teneur élevée en cistanche (5 mg g−1 dw) trouvé pour cette espèce [22], C.formosanumprésente d'immenses avantages industriels pour l'extraction du cistanche, et on s'attend à ce que le prix du marché du cistanche soit plus abordable. De plus, notre groupe a rapporté une méthode pour purifier le cistanche extrait deC.formosanum[24]. A notre connaissance, les effets de la cistanche deC.formosanumsur les cellules de mammifères, ainsi que son potentiel en tant que nouveau biomatériau dans l'industrie cosmétique, n'ont pas encore été explorés. Par conséquent, dans cette étude, diverses analyses in vitro telles que la cytotoxicité cellulaire, les tests de dégranulation, la capacité anti-inflammatoire, les tests anti-allergiques et les tests de synthèse du procollagène ont été utilisées pour vérifier ces hypothèses.

2. Matériels et méthodes

2.1. Extraction de Cistanche (cistanche) de Colaconema Formosanum

L'algue a été cultivée dans des incubateurs (Tominaga, Taipei City, Taiwan) à 20± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol photons m−2 s −1 (diode électroluminescente, lumière blanche LED), et une lumière de 12h12 : photopériode sombre dans un bécher de 5 L avec 4 L de milieu d'eau de mer PES stérilisée (30 psu) pendant plusieurs jours pour obtenir un échantillon de travail. Ensuite, la méthode pour extraire la cistanche deC.formosanumdans cette étude a été modifié par rapport à la méthode rapportée par Lee et al. [24]. Dans un premier temps, des phycobiliprotéines ont été extraites de l'algue fraîcheC.formosanum(100 g de poids humide) dans 1 L de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) à 4◦C. Pour prévenir la dégradation des phycobiliprotéinespendant les expériences, 5 mM NaN3 et EDTA 4 mM ont été ajoutés à du PBS. L'algue fraîchea été homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur FastPrep{{0}} (TeenPrep, 6 cycles, 4,0 m·s−1pendant 5 s ;MP Biomedicals, Solon, OH, États-Unis). L'extrait a été grossièrement filtré pour éliminer les débris, etle filtrat a été soumis à une centrifugation à 20,000 tr/min à l'aide d'une centrifugeuse baril (Beckman Coulter, Brea, Californie, États-Unis). Le surnageant rouge, appelé extrait de cistanche, a été recueilli etstocké à 4◦C dans le noir. L'extrait de cistanche a ensuite été soumis à un fractionnementavec (NH4)2DONC4 à 20–60 pour cent (w/v) saturation à 4◦C. Le sulfate d'ammonium solide a été lentementajouté sous agitation douce, et la solution a été laissée au repos pendant 2 h, puis centrifugéeà 10,000 rpm pendant 20 min à 4◦C et formation de précipités. Le précipité a été dissousdans du PBS (pH 7,4) et dialyse pendant une nuit contre le même tampon. Les dialysés de couleur rougela solution a été transmise via un 0.22-µm membrane filtrante (Merck Millipore, Burlington, MA,ETATS-UNIS).

2.2. Purification de cistanche par chromatographie d'échange d'ions à l'aide de Fast Protein LiquidChromatographie (FPLC)

Les échantillons dialysés de cistanche ont été soumis à une chromatographie d'échange d'ions dansune colonne HiTrap DEAE FF chargée (5 ml), qui a été pré-équilibrée avec 5 0 mM PBS (pH 7,4) contenant 1 0 mM NaCl. Après passage des échantillons, la colonne a été abondamment lavée à l'aide d'un tampon d'équilibre. La chromatographie d'échange d'ions a ensuite été réalisée à un taux d'élution de 5 ml/min en utilisant une élution à gradient linéaire allant de 0,0 à 500 mM de NaCl. Les fractions rouges éluées ont été recueillies. L'élules fractions ont été analysées par spectrophotométrie UV-Vis à l'aide d'un NGC moyenne pressionsystème de chromatographie (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) aux longueurs d'onde de 280, 498, 566,et 620 nm. Les fractions de cistanche obtenues ont ensuite été analysées à l'aide d'un absorbeurspectre de 300 à 700 nm et ont traversé un 0.22-µm filtre (Merck Millipore,Burlington, MA, États-Unis).

2.3. Culture de cellules

En tant que lignée cellulaire de macrophages murins, RAW264.7 a été cultivé avec du DMEM contenant 4mM de L-glutamine, 1,5 g/L de bicarbonate de sodium et 10 % de FBS.Toutes les lignées cellulaires ont été constamment entretenues et conservées dans une chambre humide réglée pour37 degrés avec 5 % de CO2, qui ont été frappés deux fois par semaine en utilisant des procédures standard.

2.4. Classement morphologique et viabilité cellulaire

EssaiDes cellules NIH-3T3 ont été ensemencées dans une plaque 96-puits (1× 104 cellules par puits, Corning, New York, NY, USA) avec du milieu de culture et laissé reposer pendant une nuit. Les cellules ont ensuite été traitées avec un milieu de culture contenant {{0}} (témoin négatif), 0.25, 0,5, 1, 2, 5 et 10µg/mL d'extrait de cistanche. Les puits contenant du milieu additionné de 10 % de DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) ont également été inclus dans l'essai en tant que groupe témoin positif. Après 24-h d'incubation, le classement morphologique de chaque groupe a été analysé en utilisant la définition de [25], avec les notes 0, 1, 2, 3 et 4 représentant aucun, léger,réactivité légère, modérée et sévère, respectivement. Le milieu de culture a été remplacé par 1 mg/mL de réactif MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 48-h post-traitement et incubé pendant 3 h. L'isopropanol a été ajouté dans les puits après le retrait du réactif MTT pour dissoudre le formazan, et les plaques ont été analysées à l'aide d'un spectrophotomètre (spectrophotomètre Jasco V-630) à une longueur d'onde de 570 nm [26]. Si le niveau de viabilité cellulaire pour la dose d'extrait de cistanche la plus élevée était inférieur à 70 % du groupe témoin, il était alors considéré comme cytotoxique.25]. Le pourcentage de viabilité cellulaire a été calculé à l'aide de l'équation suivante :

Viabilité cellulaire (densité optique, DO)=(DO des cellules exposées/DO des cellules témoins)× 100

2.5. Test anti-inflammatoire

Pour déterminer lelutte contre l'inflammationcapacité du cistanche, de l'interleukine-6 (IL-6) et du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF ) ont été détectés dans cette étude en suivant les protocoles décrits dans [27,28]. Les cellules RAW264.7 ont été ensemencées dans une plaque 24-puits (5× 105 cellules/puits) (Corning, New York, NY, USA) et laissé reposer pendant la nuit à 37 degrés. Le lendemain, les cellules ont été co-traitées avec des lipopolysaccharides (LPS, 1µg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) et des concentrations croissantes de cistanche (0 (témoin négatif), 1,25, 2,5, 5, 10 et 20µg/ml). Simultanément, un groupe de cellules supplémentaire qui a été co-traité avec du LPS et l'inhibiteur de p38 MAPK SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a été établi comme groupe témoin positif. Après 24 h, le surnageant de chaque groupe a été collecté pour la détection de l'IL-6 produit et du TNF- . Des échantillons de surnageant ont été appliqués sur la Quantikine® Kits ELISA sandwich colorimétriques (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Pourcentage d'inhibition (pourcentage)=100× (échantillon/témoin). De plus, les cellules ont été soumises à un test MTT pour évaluer la viabilité cellulaire après les traitements.

2.6. Test de dégranulation

En tant que lignée cellulaire de leucémie basophile du rat, la lignée cellulaire RBL-2H3 est utilisée comme modèle pour les mastocytes. Les cellules RBL-2H3 présentent des phénotypes de mastocytes muqueux et sont reconnues comme un outil brillant pour étudier la régulation des réponses des mastocytes [29]. Ainsi, la lignée cellulaire RBL-2H3 a été utilisée dans ce test pour étudier l'effet potentiel du cistanche sur la dégranulation des mastocytes. -hexosaminidase a été utilisé comme marqueur pour surveiller la dégranulation des mastocytes [30]. Le -la méthode de détection de l'hexosaminidase a été modifiée à partir de la référence [31]. Les cellules RBL-2H3 ont été ensemencées à 1× 105 cellules par puits dans des plaques de culture cellulaire à 24-puits (Corning, New York, NY, USA). Les cellules ont d'abord été traitées avec 1µM calcium ionophore A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) suivi de l'ajout de différentes doses de cistanche (0 (témoin négatif), 1,25, 2,5, 5, 10 et 20µg/mL) et incubé pendant 2 h. Parallèlement, les cellules qui ont été incubées avec 100µLa quercétine M (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a été utilisée comme contrôle positif. La méthodologie utilisée pour -la quantification de l'hexosaminidase a été obtenue à partir d'études publiées antérieurement [32,33]. Après traitement, le surnageant (30µL) de chaque puits a été collecté et transféré dans une nouvelle plaque 96-puits avant l'ajout de 50 µL de 4-nitrophényl N-acétyl- -D-glucosaminide (NP-GlcNAc, 1,3 mg/mL dans un tampon citrate (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). La plaque a été laissée à rester à 37 degrés pendant 1 h, et la réaction a été terminée par l'ajout de 80µL de 0.5 M NaOH. La plaque a ensuite été analysée pour toute formation de p-nitrophénolate à l'aide d'un spectrophotomètre (Jasco, Halifax, NS, Canada) à une longueur d'onde de 405 nm. Les cellules restantes de la plaque de culture d'origine ont été utilisées dans un test MTT pour examiner la viabilité cellulaire après les traitements.

2.7. Test d'irritation cutanée

Pour vérifier que l'application topique ne causerait pas d'irritation de la peau, un épidertissu mal a été utilisé pour imiter un scénario où cistanche a été appliqué au niveau du tissu. UnL'évaluation de l'irritation épidermique est un test clé pour tout dispositif médical ou produit cosmétique afin que seuls les produits considérés comme sûrs pour la peau soient fournis aux consommateurs. Il a été rapporté que les tests traditionnels sur les animaux non seulement causent de la douleur et de l'inconfort aux animaux de test, maisces tests n'ont d'ailleurs pas toujours été représentatifs des effets observés chez l'homme ; ainsi, il est considéré que l'utilisation d'un tissu bionique reconstruit est avantageux car ils possèdent de nombreux types de cellules entourées d'un microenvironnement local, simulant la peau humaine in vivo [34]. Les effets du cistanche sur l'irritation cutanée ont été évalués en utilisant le tissu épidermique bionique EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) selon les instructions du fabricant et avec des expériences suivant la méthodologie modifiée à partir des références [35–37]. Les inserts contenant l'échantillon EpiDerm ont été insérés dans une plaque à puits 6- (Corning, New York, NY, USA) contenant du DMEM préchauffé. Un montant de 100µL DMEM contenant soit {{0}} (témoin négatif) soit 1 mg/mL de cistanche purifié (concentration finale 0,1 mg/mL) a été ajouté dans l'insert de culture cellulaire au-dessus de l'échantillon EpiDerm. Le tissu qui a été traité avec 5 pour cent de dodécylsulfate de sodium (SDS) a servi de témoin positif. Après 1-h d'incubation dans un environnement humidifié de 37◦C, 5 % de CO2 incubateur, les inserts ont été retirés et lavés deux fois avec du PBS (pH 7,4), puis placés dans une plaque 24-puits contenant 300µL d'une solution de MTT à 1 mg/mL (dans du DMEM). Après 3-h d'incubation, de l'isopropanol a été appliqué pour dissoudre les cristaux de formazan de MTT. Le surnageant a été transféré dans une plaque à puits 96- et l'échantillon a été mesuré à une DO de 570 nm par spectrophotométrie. La viabilité relative a été calculée selon l'équation décrite dans la section2.4. Les produits chimiques sont considérés comme irritants lorsqu'ils diminuent la viabilité cellulaire à moins de 50 % (catégorie 2), et les produits chimiques qui entraînent une viabilité cellulaire supérieure à 50 % sont considérés comme non irritants (aucune catégorie) [37]. 

2.8. Synthèse du procollagène

TestDes cellules Hs68 ont été inoculées dans une plaque 24-puits (2× 105 cellules/puits) et laisser reposer pendant une nuit. Les cellules ont ensuite été traitées avec un milieu de culture contenant {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 et 10µg/mL d'extrait de cistanche. Le groupe témoin positif a été traité avec 100 ng/mL de facteur de croissance transformant (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis) [38,39]. Ensuite, 72-h après le traitement, le surnageant de chaque échantillon a été collecté et soumis à une détection de procollagène. Peptide monoclonal anti-procollagène humain de type IC (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japon). (MK101) a été utilisé selon les instructions du fabricant pour la détection du procollagène. En outre, le test MTT a été effectué pour évaluer la viabilité cellulaire après traitement.

2.9. Analyses statistiques

Les données ont été analysées à l'aide d'IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, États-Unis). Nous avons d'abord soumis les données de chaque groupe au test de Kolmogorov-Smirnov pour vérifier qu'elles étaient normalement distribuées ( > 0.05) [40]. Étudiantst-test a été utilisé pour analyser la viabilité cellulaire, IL-6, TNF- , -inhibition de l'hexosaminidase, tissus épidermiques et production de procollagène. Toutes les données sont présentées sous forme de moyennes± écart-type (SD), avec chaque expérience réalisée en quintuplicate. UNp-value < 0.05 a été considérée comme statistiquement significative.