Induction rapide de l'immunité protectrice contre la peste pulmonaire par les antigènes polymères F1 et LcrV de Yersinia Pestis

Abstrait:

Dans une étude récente, nous avons démontré que la vaccination avec l'antigène capsule polymère F1 de l'agent pathogène de la peste Yersinia pestis entraînait l'induction rapide d'une réponse immunitaire humorale protectrice via l'activation pivot des cellules B1b de type inné. À l'inverse, la version monomère de F1 n'a pas réussi à protéger rapidement les animaux vaccinés dans ce modèle de peste bubonique. Dans cette étude, nous avons examiné la capacité de F1 à conférer l'apparition rapide d'une immunité protectrice dans le modèle murin plus difficile de la peste pulmonaire. La vaccination avec une dose de F1 adsorbée sur de l'hydroxyde d'aluminium a induit une protection efficace contre une exposition intranasale létale ultérieure à une souche de Y. pestis entièrement virulente en une semaine. Fait intéressant, l'ajout de l'antigène LcrV a raccourci le temps nécessaire pour obtenir une immunité protectrice aussi rapide à 4 à 5 jours après la vaccination. Comme trouvé précédemment, la structure polymérique de F1 était essentielle pour donner la réponse protectrice accélérée observée par la vaccination avec LcrV. Enfin, dans une étude de longévité, une seule vaccination avec F1 polymère a induit une réponse humorale plus élevée et plus uniforme qu'une vaccination similaire avec F1 monomère. Cependant, dans ce contexte, la contribution dominante de LcrV à une immunité durable contre une provocation pulmonaire létale a été réitérée.

Il existe une relation étroite entre les réponses immunitaires humorales protectrices et l'immunité. La réponse immunitaire humorale protectrice est une réponse de défense de l'organisme contre les agents pathogènes étrangers, à laquelle participent principalement les anticorps. L'immunité fait référence à la capacité du corps à résister à l'invasion d'agents pathogènes étrangers. La réponse immunitaire humorale protectrice peut favoriser l'effet destructeur des cellules immunitaires, renforcer la résistance de l'organisme et ainsi améliorer l'immunité. De plus, la réponse immunitaire humorale protectrice peut également réguler l'équilibre du système immunitaire, contrôler l'activité du système immunitaire et éviter une réaction excessive et l'apparition de maladies auto-immunes. Par conséquent, une réponse immunitaire humorale protectrice est essentielle pour maintenir la santé du corps et renforcer l'immunité. De plus, l'immunité humaine est également très importante, ce qui peut nous empêcher d'être attaqué par des virus. Cistanche peut renforcer l'immunité. Cistanche est riche en diverses substances antioxydantes, telles que la vitamine C, la vitamine C, les caroténoïdes, etc. Ces ingrédients peuvent piéger les radicaux libres, réduire le stress oxydatif et améliorer la résistance du système immunitaire.

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Mots clés:

vaccination; peste pulmonaire; protection rapide; polymère F1; F1 monomère; LcrV; modèle de souris.

1. Introduction

La bactérie Gram négatif Yersinia pestis constitue l'agent étiologique de la peste bubonique et pulmonaire. Des centaines de millions de personnes ont succombé en raison de la nature létale des infections infligées par ce pathogène dévastateur lors de trois pandémies majeures et de nombreuses épidémies locales enregistrées au cours des deux derniers millénaires [1,2]. En raison de son pouvoir infectant et de sa létalité élevés, Y. pestis est classé comme agent potentiel de bioterrorisme (https://www.cdc.gov/plague/bioterrorism/index.html, consulté le 9 juillet 2021). Depuis la découverte et l'utilisation intensive des antibiotiques, la prévalence et la mortalité causées par la peste ont fortement diminué [3,4].

Néanmoins, l'antibiothérapie contre la peste a des limites ; pour être efficace, le traitement doit être administré peu de temps après l'apparition de symptômes qui, au début, sont similaires à ceux d'une infection commune des voies respiratoires supérieures et donc souvent mal diagnostiqués. Tout retard dans l'administration d'antibiotiques spécifiques pour le traitement de la peste peut altérer leur efficacité et entraîner une mortalité importante chez les personnes traitées [5]. L'isolement récent de souches virulentes de Y. pestis résistantes à plusieurs antibiotiques, y compris ceux recommandés pour le traitement, et la crainte que de tels phénotypes altérés puissent être introduits de manière malveillante dans des souches virulentes pour la guerre biologique ou le bioterrorisme nécessitent le développement de contre-mesures supplémentaires [6–8]. . En effet, l'application récente d'antibiotiques de deuxième intention, de modalités thérapeutiques supplémentaires et la combinaison d'antibiotiques et de phagothérapie montrent des résultats prometteurs dans le modèle murin de la peste pulmonaire [9,10].

Nous avons récemment démontré en utilisant le modèle murin de la peste bubonique que l'administration de l'antigène capsulaire F1 de Y. pestis suscite une immunité protectrice en quelques jours et, par conséquent, peut servir d'intervention thérapeutique pour prévenir la maladie [11,12]. Cette apparition rapide de la protection impliquait une activation rapide des cellules B1b de type inné qui résident dans les cavités péritonéale et pleurale, entraînant la production d'anticorps IgM et IgG anti-F1 circulatoires [11,12]. La structure polymérique de F1 était essentielle pour l'induction rapide de l'immunité anti-peste, comme le démontre l'observation que, contrairement à la F1 polymérique, la protéine F1 permutée circulaire monomérique modifiée (monoF1) ne s'est pas associée aux cellules péritonéales B1b immédiatement après l'immunisation, et en conséquence, la production d'anticorps anti-F1 a été retardée [12]. Dans cette étude, en utilisant un modèle murin d'infection intranasale à Y. pestis, nous avons examiné la capacité de l'antigène F1 à fournir une immunité protectrice rapide contre la peste pulmonaire, qui représente la manifestation la plus grave de la maladie.

Cette étude établit que, comme dans le cas de l'immunité contre la peste bubonique, la nature polymérique de F1 était essentielle pour une immunité rapide et durable après une vaccination avec une dose unique de l'antigène. Étant donné que les antigènes F1 et LcrV représentaient les vaccins sous-unitaires anti-peste candidats les plus probables et qu'il a été démontré qu'ils induisaient une immunité protectrice rapide dans un modèle murin de la peste pulmonaire [13], nous avons étendu cette étude en envisageant la possibilité d'accélérer davantage le montage de la protection contre peste pulmonaire par un F1 combiné avec la formulation LcrV.

2. Matériels et méthodes

2.1. Déclaration d'éthique

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Institut national de la santé. Toutes les expérimentations animales ont été réalisées conformément à la loi israélienne et ont été approuvées par le comité d'éthique pour les expérimentations animales de l'Institut israélien de recherche biologique (numéros de permis : IACUC-IIBR M-50-18, IACUC-IIBR M-36-19, IACUC -IIBR M-64-19, IACUC-IIBR M-73-20). Après la provocation intranasale, les souris ont été surveillées quotidiennement. Des paramètres humains ont été utilisés dans nos études de survie. Les souris présentant une perte du réflexe de redressement ont été euthanasiées par dislocation cervicale.

2.2. Animaux

Des souris femelles consanguines C67BL/6 âgées de six à huit semaines ont été achetées chez Envigo (Jérusalem, Israël). Des CD-1 masculins et féminins d'âge similaire ont été achetés à Charles River (Royaume-Uni).

2.3. Immunisation des animaux avec des antigènes purifiés

PolyF1 : La protéine polymère F1 a été purifiée à partir du surnageant de culture de cellules E. coli exprimant l'opéron caf1 de la souche Y. pestis Kimberley53, comme décrit précédemment dans [14]. Le poids moléculaire de la F1 purifiée a été déterminé comme étant supérieur à 1000 kDa par chromatographie d'exclusion de taille en utilisant une colonne Superdex 200 (Cytiva, MA, USA).

MonoF1 : Le plasmide pAH34L codant pour le monomère F1 (cpCaf1) a été aimablement obtenu auprès du Dr Daniel Peters et du professeur Jeremy H. Lakey, Université de Newcastle, Royaume-Uni [15]. pAH34L a été introduit dans Lemo21 (DE3) E. coli acheté auprès de New England Biolabs (Ipswich, MA, USA). Des transformants sélectionnés au hasard ont été cultivés à 37 °C et 220 tr/min dans un bouillon Terrific additionné d'ampicilline (200 µg/mL). L'expression a été induite à mi-log par l'ajout d'isopropyl-thiogalactopyranoside (IPTG; 1 mM), et les cultures ont ensuite été incubées à 18 °C et 220 tr/min pendant 19 h supplémentaires. Les culots bactériens ont été pesés (poids humide) et solubilisés avec le réactif de lyse des cellules CelLytic™ B conformément aux instructions du fabricant (Merck-Sigma, Rehovot, Israël).

La protéine de fusion recombinante Tol3–cpCaf1 a été purifiée par chromatographie liquide sous pression facilitée (PFLC) sur une colonne HisTrap™ HP conformément aux directives du fabricant (Cytiva, MA, USA). Le fragment Tol3 a été séparé de cpCaf1 par clivage avec de la thrombine (Merck-Sigma, Rehovot, Israël) et réabsorption du premier sur une colonne HisTrap™ HP régénérée. Le fragment cpCaf1 (monoF1) a été recueilli à partir de la fraction d'écoulement et largement dialysé contre du PBS 1 ×. Les endotoxines ont été éliminées par la méthode de séparation de phase Triton X-114, comme décrit précédemment dans [16]. La quantité de protéines a été mesurée en utilisant la méthode à l'acide bicinchoninique (Pierce™ BCA Protein Assay Kit, Thermo). La pureté du F1 monomère a été vérifiée par SDS-PAGE suivie d'une coloration au bleu de Coomassie et d'une analyse Western blot en utilisant des anticorps anti-F1 de lapin, comme décrit précédemment dans [11].

LcrV : La séquence codante LcrV pleine longueur de la souche virulente Y. pestis Kimberley53 a été clonée dans le vecteur d'expression pGEX (GE Healthcare, Chicago, IL, USA) et introduite dans des cellules E. coli. La séquence codante LcrV s'est avérée identique à la séquence LcrV de la souche Y. pestis CO92. Le LcrV recombinant a été produit et purifié comme décrit par Leary et al. [17]. Les endotoxines ont été éliminées de la LcrV purifiée comme décrit ci-dessus.

Un total de 20 à 160 µg de polyF1 et LcrV ou 80 µg de monoF1 ont été adsorbés sur un gel d'hydroxyde d'aluminium (AlOH) à 2 % (Brennentag Biosector, Danemark) à une concentration finale de 0,36 %. Des souris individuelles ont été immunisées par voie sous-cutanée en utilisant un volume constant de 200 µL administré dans le bas du dos.

2.4. Caractérisation de la réponse sérologique

Les souris ont été saignées par la queue et les titres individuels d'IgG générés contre F1 et LcrV dans le sérum ont été déterminés par ELISA, comme indiqué précédemment dans [11]. Les titres d'IgG1 et d'IgG3 ont été mesurés à l'aide d'anticorps de chèvre anti-souris conjugués à la phosphatase alcaline isotype (Jackson Laboratories, Farmington, CT, USA).

Lavage bronchoalvéolaire (LBA) : les souris ont été anesthésiées par une solution de kétamine/xylazine, et la trachée a été exposée, en prenant des précautions supplémentaires pour ne pas provoquer de saignement. Une petite incision a été pratiquée et une canule flexible de calibre {{0}} (BD Neoflon™) a été insérée et fixée par une suture chirurgicale. Les poumons ont été lavés avec du PBS 1 × à l'aide d'une seringue luer-lock de 1 ml connectée à la canule sécurisée. Le liquide de lavage qui était contaminé par tout signe de sang a été jeté. Le liquide de lavage a été éliminé par centrifugation (400× g, 4 ◦C) et le surnageant a été filtré stérilement avant ELISA. Les concentrations d'anticorps anti-F1 et anti-LcrV dans le liquide BAL (BALF) des animaux vaccinés ont été déterminées à l'aide de Mab 57 dilué (F1) et de Mab 59 (LcrV) précédemment rapportés dans [18] sous forme de courbes standard incluses dans chaque {{14} }plaque de test bien. Les limites de détection (LOD) des anticorps anti-F1 IgG et anti-LcrV dans le BALF ont été déterminées à 0,8 ng/mL et 0,15 ng/mL, respectivement.

2.5. Infection de souris

Les infections intranasales (in) ont été réalisées comme décrit précédemment dans [19]. En bref, une boucle pleine de colonies bactériennes typiques de Y. pestis Kim53 a été récoltée et diluée dans un bouillon d'infusion cardiaque (HIB, Difco) additionné de 0.2 pour cent de xylose et 2,5 mM de CaCl2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) à une DO660 de 0.01 et cultivée pendant 22 h à 28 ◦C et 100 tr/min. À la fin de la période d'incubation (OD660 ≈ 4), la culture a été lavée et diluée dans une solution saline (0,9 % de NaCl) jusqu'à la dose infectieuse souhaitée qui a été vérifiée en comptant les unités formant colonies après étalement et incubation sur des plaques BHIA (48 h à 28 ◦C). Les souris ont été anesthésiées avec un mélange de 0,5 % de kétamine HCl et de 0,1 % de xylazine, puis infectées par voie intranasale avec 35 µL/souris de la suspension bactérienne. La DL50 intranasale de la souche Kim53 vis-à-vis des souris C57BL/6 est de 1 100 ufc et de 2 100 ufc vis-à-vis des souris CD-1. Les valeurs de DL50 ont été calculées selon la méthode décrite par Reed et Muench [20]. La morbidité et la mortalité des souris ont été surveillées quotidiennement pendant 21 jours. À la fin de cette période, la clairance de l'agent pathogène a été vérifiée en étalant des homogénats de rate d'animaux survivants sur des plaques de BHIA additionnées de 200 µg/mL de streptomycine (48 h à 28 ◦C).

2.6. Caractérisation du modèle murin de la peste pulmonaire

Les souris infectées par voie intranasale ont été anesthésiées au moment indiqué après l'exposition par une solution de kétamine/xylazine, et du sang héparinisé a été prélevé par ponction cardiaque. Par la suite, le ganglion lymphatique médiastinal (mdLN), les poumons et la rate ont été excisés et écrasés en une suspension unicellulaire sur un filet de nylon de 7 0 µm (cell tamis, Falcon, Corning, NY, USA) dans 1 × PBS . Le nombre de Y. pestis Kim53 dans les divers organes et le sang a été déterminé en étalant des suspensions cellulaires diluées en série sur des plaques BHIA additionnées de 200 µg/mL de streptomycine. Pour l'analyse histologique, les souris ont été anesthésiées, et leurs trachées ont été canulées comme indiqué ci-dessus. Une colonne (0,7 × 30 cm, KONTES, St. Louis, MO, USA) remplie d'une solution tamponnée de formaldéhyde (concentration finale à 10 %) a été connectée à la canule et les poumons ont été "gonflés" uniquement par gravité. Les poumons remplis de fixateur ont été conservés dans le même tampon pendant 14 jours, puis traités pour former des blocs inclus en paraffine. Des coupes de un à trois micromètres ont été colorées avec une coloration standard à l'éosine/hématoxyline (H&E) et avec un kit de coloration Masson-Goldner (Merck, Rehovot, Israël) pour la détection de la fibrose. De plus, des coupes pulmonaires ont été colorées pour Y. pestis à l'aide d'anticorps IgG anti-F1 de lapin maison (1:10,000) et du kit Histostain®-SP (ZYMED®, Invitrogen, Waltham, MA, USA ). Les sections colorées ont été imagées à l'aide d'une caméra ICC3 couplée à un microscope Axioscope A1 (Zeiss, Allemagne).

2.7. Analyses statistiques

La signification entre les titres enregistrés chez les souris appartenant à plus de deux groupes a été déterminée par Kruskal-Wallis non paramétrique avec le test post hoc de Dunn. Le test du log-rank (Mantel-Cox) a été utilisé pour comparer les courbes de survie obtenues dans les différents groupes de vaccination. Les différences étaient considérées comme significatives si p inférieur ou égal à 0.05. Les calculs ont été effectués à l'aide du logiciel GraphPad Prism.

3. Résultats

Dans une étude précédente, nous avons démontré que la vaccination de souris avec la forme polymère native de l'antigène capsulaire F1 de Yersinia pestis entraînait une élicitation rapide d'une protection contre la peste bubonique. En conséquence, il a été suggéré que l'administration de F1 pourrait être considérée non seulement comme une mesure prophylactique, mais également comme une intervention thérapeutique dans les cas d'urgence tels que les épidémies impliquant des souches résistantes aux antibiotiques d'origine naturelle ou conçues de manière malveillante [12]. Dans ce rapport, l'élicitation d'une protection rapide a été interrogée dans le cas de la peste pulmonaire en utilisant le modèle murin bien établi consistant en l'exposition de souris à l'agent pathogène par inoculation intranasale. Il a été démontré que ce modèle préservait la pathogénicité caractérisant les manifestations respiratoires de la peste pulmonaire primaire (Figure supplémentaire S1) [10,19,21–24].

3.1. Immunité protectrice rapide offerte par F1 et LcrV dans le modèle murin de la peste pulmonaire

La capacité de l'antigène F1 à induire une protection rapide a été testée par des expériences dans lesquelles des souris C57BL/6 ont été vaccinées par une seule administration de polyF1 adsorbé par AlOH (20, 80 et 160 µg/souris), alors que les animaux témoins n'ont reçu qu'une injection de l'adjuvant. La capacité des souris vaccinées à survivre à une infection intranasale mortelle par la souche virulente de Y. pestis Kim53 (10LD50=11,000 ufc) a été évaluée trois et sept jours après la vaccination par rapport aux animaux témoins (Figure 1 ). Après trois jours, seule une extension modeste du délai de décès et de survie (de signification statistique insatisfaisante) a été observée (Figure 1A). L'allongement du délai entre la vaccination et la provocation de seulement 4 jours supplémentaires (7 jours au total) a permis de sauver toutes les souris vaccinées avec les fortes doses de polyF1 (80 et 160 µg/souris) ainsi que 87 % des souris vaccinées avec le faible dose de polyF1 (figure 1B).

La capacité de l'antigène F1 à induire une réponse immunitaire protectrice rapide contre la peste pulmonaire nous a encouragés à examiner si l'immunisation avec un antigène protecteur supplémentaire, LcrV, améliorerait encore l'état immunitaire des animaux en accélérant l'apparition de l'immunité protectrice. En effet, lorsque la provocation létale à Y. pestis a été réalisée 3 jours après la vaccination combinée, l'administration de la formulation mixte LcrV et polyF1 (80 µg ou 160 µg de chacun des antigènes) a pu sauver 30 à 50 % des souris (figure 1C). Plus particulièrement, l'extension de la période entre la vaccination et la provocation à sept jours a offert une protection complète à tous les animaux vaccinés à toutes les doses d'antigènes (figure 1D). La capacité de polyF1 seul ou en combinaison avec LcrV à conférer une immunité protectrice rapide contre la peste pulmonaire en une semaine n'a pas été affectée en augmentant de dix fois la dose de provocation de l'exposition intranasale (Figure 1E), confirmant la robustesse de l'état protégé.

3.2. Cinétique de la réponse humorale après vaccination par F1 et LcrV

L'observation selon laquelle le vaccin combiné LcrV et F1 induisait une immunité protectrice rapide suggérait qu'une réponse humorale était déclenchée peu de temps après. Pour aborder cette possibilité et déterminer la contribution de la réponse humorale contre chacun des antigènes à la protection contre Y. pestis, la cinétique des anticorps IgG spécifiques générés contre les deux antigènes individuels a été analysée 5 à 9 jours après une dose unique de vaccination. de souris C57BL/6 avec une formulation mixte de polyF1 et LcrV (figure 2A). Comme prévu, sur la base des observations précédentes, les titres d'anticorps IgG anti-F1 (GMT=1.35 × 103) étaient déjà détectables dans le sérum de tous les animaux vaccinés au jour 5 après la vaccination (Figure 2B).

Une augmentation progressive des titres d'anticorps IgG anti-F1 a été observée dans les jours suivants, atteignant des niveaux ~60- fois plus élevés au jour 9 après la vaccination (GMT=8.26 × 104, figure 2B). Les anticorps anti-F1 IgG pourraient également être détectés dans le liquide pulmonaire à partir du jour 7 après la vaccination, atteignant une concentration aussi élevée que ~ 1 µg/mL le jour 9 (figure 2C). Fait intéressant, alors que la réponse humorale anti-LcrV était en retard par rapport à celle provoquée par polyF1 (Jour 7 GMT=613, Figure 2D), une augmentation plus élevée des taux d'anticorps IgG anti-LcrV a été mesurée dans les jours suivants, présentant une augmentation globale de ~160- fois (GMT=1 × 105, Figure 2D). Les anticorps anti-LcrV IgG pourraient également être détectés dans le liquide pulmonaire des souris vaccinées à partir du jour 8, mais à une concentration inférieure par rapport aux niveaux anti-F1 (figure 2E).

La forte augmentation des titres d'IgG anti-LcrV, observée aux jours 8 à 9 après la vaccination, ne semble pas impliquer l'activation des cellules B1b de type inné, comme le suggère l'observation que la fraction IgG3 de ces anticorps était inférieure à la détection par rapport à la fraction d'anticorps anti-F1 IgG3 ([12] et Figure supplémentaire S2). Par conséquent, les données indiquent que LcrV pourrait également générer une réponse humorale rapide fournissant, en combinaison avec F1, une protection efficace contre la peste pulmonaire dès une semaine après la vaccination. De plus, l'observation que les anticorps IgG anti-F1 et anti-LcrV s'accumulent dans les poumons des animaux vaccinés suggère que la réponse locale dans les poumons peut être importante pour obtenir une immunité contre la peste pulmonaire.

3.3. L'importance de la structure polymère F1 pour l'apparition rapide de l'immunité protectrice

Nous avons déjà publié des résultats soutenant fortement l'idée que l'architecture polymère quaternaire de F1 est essentielle pour sa capacité à induire une réponse protectrice rapide contre la peste bubonique [12]. Par conséquent, dans cette étude, cette question a également été abordée dans le cas de la protection contre la peste pulmonaire. Les souris ont été vaccinées avec du F1 monomère ou polymère, impliquant dans les deux cas une co-administration de LcrV (80 µg de chaque antigène/souris). Trois, quatre et cinq jours plus tard, les souris ont été provoquées par voie intranasale avec une dose létale de Y. pestis Kim53. Les données de survie illustrées à la figure 3 ont indiqué que la vaccination avec un mélange de polyF1 et de LcrV protégeait 25 %, 62,5 % et 87,5 % des souris, respectivement (figure 3A), d'une provocation létale.

En revanche, toutes les souris vaccinées avec le mélange monoF1 et LcrV ont succombé à l'infection, à l'exception du groupe vacciné 5 jours avant le défi, qui présentait un faible niveau de protection de 25 % (figure 3B). La vaccination avec des formulations non mélangées constituées de polyF1, de monoF1 ou de LcrV (80 µg/souris) 4 jours avant l'épreuve n'a pas protégé les animaux. Cependant, la vaccination avec polyF1 a permis un retard significatif de la mortalité par rapport à tous les autres groupes expérimentaux (p < 0,001 ; Figure 3C). Pris ensemble, ces résultats montrent clairement que la forme polymérique de F1 est essentielle pour obtenir une réponse protectrice rapide en association avec LcrV.

3.4. Caractérisation de l'immunité protectrice à long terme induite par une vaccination unique avec F1 et LcrV

Enfin, nous avons examiné si l'immunité protectrice classique à long terme contre la peste pulmonaire diffère chez les souris vaccinées par monoF1 ou polyF1. En conséquence, les souris CD1 ont été vaccinées une fois avec monoF1 ou polyF1 seul, ainsi que par l'administration de formulations qui comprenaient une combinaison avec LcrV. Le taux d'anticorps spécifiques dans le sérum des animaux vaccinés a été mesuré six mois plus tard. Les données représentées sur la figure 4A montrent que les titres d'IgG anti-F1 étaient plus élevés dans tous les groupes vaccinés avec polyF1 que dans ceux vaccinés avec monoF1. Des titres élevés et constants d'IgG anti-LcrV ont été mesurés chez toutes les souris vaccinées avec LcrV.

Une période de 6 mois après l'immunisation (3 jours après le prélèvement sanguin pour la détermination du titre), les souris ont été provoquées par voie intranasale avec une dose létale composée de 100LD50 de Y. pestis Kim53, et la survie a été surveillée pendant 21 jours (Figure 5). Les souris vaccinées avec polyF1 en tant qu'antigène unique n'étaient que partiellement protégées, alors que toutes les souris vaccinées avec monoF1 ont succombé à l'infection, comme les souris naïves témoins (figure 5A). Notamment, les titres d'IgG anti-F1 qui ont été mesurés dans les sérums d'animaux vaccinés polyF1- n'ont pas montré de forte corrélation avec la survie contre la provocation pulmonaire (Figure 5B). L'ajout de LcrV a permis une protection complète pour les souris qui ont été vaccinées avec monoF1 ainsi que pour celles qui ont été vaccinées avec polyF1 (figure 5A), indiquant que la réponse antiLcrV a permis la pleine manifestation de la valeur protectrice de la réponse anti-F1. Des résultats similaires concernant les réponses humorales et la survie après provocation pulmonaire ont été obtenus chez des souris CD -1 mâles vaccinées (Figure supplémentaire S3), indiquant que l'étude n'est pas biaisée par le sexe de l'animal (notez que les expériences initiales ont été réalisées avec des animaux femelles) .

Pris ensemble, ces résultats montrent que la F1 seule peut induire l'apparition rapide d'une protection contre la peste pulmonaire, qui dépend de sa structure polymère naturelle. L'ajout de LcrV au polyF1 a non seulement raccourci le temps nécessaire pour obtenir une protection aussi rapide, mais a également fourni une immunité protectrice prolongée et efficace contre la manifestation pulmonaire d'une peste, comme décrit précédemment.

4. Discussion

L'isolement récent de souches virulentes de Y. pestis résistantes à plusieurs antibiotiques, dont ceux recommandés pour le traitement [8,25,26], est attribué à la recherche de contre-mesures supplémentaires contre la peste pulmonaire, telles que des vaccins induisant une immunité rapide, une forte santé publique et pertinence clinique. Les vaccins, en général, sont considérés comme des contre-mesures préventives contre les maladies infectieuses et sont donc administrés à des personnes en bonne santé des années à l'avance. En conséquence, la majorité des études précliniques examinant le développement d'un vaccin contre la peste impliquaient des régimes de vaccination prolongés avant une provocation létale [13,27-29]. Nous avons précédemment rapporté que la vaccination avec la forme polymère naturelle de l'antigène capsulaire F1 déclenche une réponse immunitaire dépendante des cellules B très rapide et puissante qui protège les animaux même plusieurs heures après une provocation sous-cutanée mortelle à Y. pestis [11,12].

Dans ces études, nous avons montré qu'une seule vaccination par F1 induit l'accumulation d'anticorps anti-F1 (IgM et IgG) dans le sérum en quelques jours via l'activation de cellules B1b innées. Cette sous-population de cellules B réside dans la cavité péritonéale des souris et génère généralement des réponses sérologiques contre des antigènes polymériques non protéiques, tels que le LPS et les polysaccharides qui composent la capsule de nombreux agents pathogènes (pneumocoques, méningocoques, etc.) [30]. Ces réponses immunitaires rapides sont caractérisées par l'indépendance des lymphocytes T et la génération du sérotype d'anticorps murin IgG3. Nous avons montré que toutes les caractéristiques susmentionnées s'appliquent également à la réponse protectrice rapide générée par F1. De plus, nous avons montré que la nature polymérique de la F1 est essentielle pour cette réponse immunitaire rapide, car la F1 monomérique (générée par la permutation circulaire du gène caf1) n'a pas réussi à activer les cellules B1b, décalée par rapport à la F1 polymérique dans la cinétique des titres d'IgG, n'a pas ne génèrent pas le sérotype IgG3 et n'offrent pas un début rapide de protection. Cette réponse rapide s'accompagne de la réponse adaptative conventionnelle dépendante des lymphocytes T plus lente contre F1. Ainsi, nous émettons l'hypothèse que la F1 polymérique génère deux réponses sérologiques agissant en parallèle : l'une indépendante des lymphocytes T via les cellules B1b et la seconde impliquant les lymphocytes B folliculaires de manière dépendante des lymphocytes T [12].

Dans ce rapport, l'étude précédente a été étendue en abordant la capacité de l'antigène F1 à conférer une réponse protectrice rapide dans le modèle murin plus difficile de la peste pulmonaire. Nous montrons qu'une seule administration de F1 polymérique adsorbé par AlOH, sept jours avant une provocation intranasale létale avec une souche virulente de Y. pestis, peut induire une réponse protectrice efficace (Figure 1). Cette observation surprenante n'a presque pas de précédent, non seulement en ce qui concerne la rapidité de la réaction, mais aussi en ce qui concerne le fait que la capacité de l'antigène F1 à conférer une protection dans un modèle murin de la peste pulmonaire n'a été que rarement abordée [31]. L'observation rapportée ici rejoint celle documentée par Derbise et ses collègues [32] concernant la détection d'anticorps anti-F1 peu après la vaccination. Ici, nous montrons que l'ajout de LcrV à polyF1 était non seulement avantageux à long terme, comme indiqué précédemment [33,34], mais accélérait également la réponse immunitaire protectrice contre la provocation intranasale de Y. pestis à seulement quelques jours (Figures 2 et 5).

La capacité de générer une protection rapide contre la peste pulmonaire par la vaccination avec F1 et LcrV renforce des résultats similaires précédemment rapportés par Williamson et ses collègues [13], dans lesquels la vaccination avec F1 et LcrV a fourni une protection rapide contre la provocation par aérosol avec Y. pestis. La forte augmentation des titres d'IgG anti-LcrV observée aux jours 8 et 9 indique que des mécanismes immunitaires très puissants ont été activés par LcrV tôt après l'immunisation. L'absence d'anticorps anti-LcrV IgG3 dans le sérum, leurs cinétiques différentes et les niveaux inférieurs d'anticorps anti-LcrV IgG trouvés dans le liquide pulmonaire suggèrent fortement que des mécanismes immunitaires discrets ont été activés par les antigènes F1 et LcrV, les deux les plus probablement contribué à l'élicitation rapide de la réponse protectrice (Figure 3C).

Semblable à nos observations précédentes dans le modèle de souris peste bubonique, la capacité à induire une réponse immunitaire protectrice rapide contre la peste pulmonaire dépendait de la structure polymère de l'antigène F1 (Figure 3). Cette observation suggère que le vaccin sous-unitaire anti-peste candidat prévalent, qui se compose de F1 monomère et de LcrV en tant que protéine de fusion [35,36], ne devrait pas fournir un début rapide d'immunité contre la peste pulmonaire ; cependant, cette hypothèse doit être examinée expérimentalement. La réponse sérologique générée par LcrV, bien qu'étant plus lente que celle de polyF1 (Figure 2), a permis la réponse adaptative protectrice rapide qui a empêché l'effet létal de la peste pulmonaire. Cette réponse sérologique relativement rapide découle probablement de la capacité de l'antigène LcrV à former des dimères ou des tétramères dans la solution, comme cela a été constaté dans des études antérieures [37,38] et nos données non publiées. À la lumière de nos découvertes sur l'effet de la structure multimérique de F1 dans l'accélération de la génération d'une réponse immunitaire humorale, l'ingénierie recombinante de la protéine LcrV qui permet une plus grande multimérisation peut encore accélérer la réponse. Conformément à cette hypothèse, il convient de noter le rapport récent documentant que les microcristaux contenant F1 et LcrV étaient plus protecteurs qu'un vaccin similaire composé de ces antigènes sous une forme soluble [39]. Cette observation suggère que l'augmentation de la densité des antigènes, qui se produit de manière inhérente dans le polymère F1, peut améliorer et éventuellement accélérer les réponses humorales protectrices.

En plus de sa capacité à induire une induction rapide de l'immunité, dans des expériences portant sur la longévité de l'état protecteur, une immunisation unique avec F1 polymère a généré des titres d'IgG plus stables et uniformes que celle avec F1 monomère (Figure 4). Cependant, la vaccination avec le polyF1 seul n'a fourni qu'une protection partielle contre les maladies pulmonaires. Il convient de noter que les titres spécifiques d'IgG anti-F1 mesurés chez des souris individuelles sont mal corrélés à leur capacité à survivre au défi (figure 5B). La vaccination des souris avec une combinaison de chaque forme de F1 avec LcrV a généré des niveaux de protection plus élevés (Figure 5). Ces résultats sont conformes aux études précédentes qui ont montré que la vaccination avec le vaccin à cellules entières tuées (KWC), qui induit des titres d'IgG anti-F1 mais pas d'IgG anti-LcrV, était inefficace pour fournir une immunité contre la peste pulmonaire [13,40]. .

Alors que, dans l'étude de longévité, le polyF1 n'a fourni qu'une immunité tardive partielle, cette protéine a démontré sa capacité à protéger complètement les souris peu de temps après la vaccination, suggérant l'implication de mécanismes immunitaires supplémentaires de courte durée qui ont contribué à l'élimination de l'agent pathogène dans le processus rapide. expériences d'immunité. Nous avons récemment démontré que la vaccination avec la souche EV76 atténuée de Y. pestis déclenchait un mécanisme de défense nutritionnelle qui abrogeait les mécanismes de virulence médiés par les sidérophores du pathogène en compétition pour les ions de fer disponibles chez l'hôte, contribuant à l'apparition rapide de l'immunité anti-peste. 41]. L'élucidation des mécanismes de soutien de courte durée qui agissent en synergie avec la réponse immunitaire humorale anti-F1 peut aider au développement de vaccins améliorés contre la peste pulmonaire ainsi que contre d'autres maladies infectieuses mortelles.

Matériel supplémentaire :

Les informations complémentaires suivantes peuvent être téléchargées sur https : //https://www.mdpi.com/article/10.3390/vaccines11030581/s1, Figure S1 : Caractérisation de la peste pulmonaire après inoculation intranasale de Y. pestis Kim53. Figure S2 : Caractérisation isotypique des anticorps anti-F1 et anti-LcrV dans les sérums de souris vaccinées. Figure S3 : Longévité de la réponse sérologique et survie des souris mâles après une seule vaccination avec F1 monomère et F1 polymère seuls ou avec LcrV.

Contributions d'auteur:

Conceptualisation, EM et YL ; Conservation des données, YL ; Analyse formelle, YL ; Enquête, MA, AT, DG, YV, AZ et YL ; Méthodologie, YL ; Ressources, TH et AM ; Supervision, EM ; Rédaction—Brouillon original, EM et YL ; Rédaction—Révision et édition, TC, EM et YL Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement:

Cette recherche a été financée par l'Institut israélien de recherche biologique, numéro de subvention SB/07.

Déclaration du comité d'examen institutionnel :

N'est pas applicable.

Déclaration de consentement éclairé :

N'est pas applicable.

Déclaration de disponibilité des données :

Les données présentées dans cette étude sont disponibles sur demande auprès des auteurs correspondants.

Les conflits d'intérêts:

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

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