pour plus d'informations :ali.ma@wecistanche.com

Partie : II Manifestations rénales et extra-rénales chez le poisson zèbre adulte Modèle de cystinose

2.3.5. Ctns−/− Le poisson zèbre présente une épaisseur accrue de LA cornée

Cystinoseaffecte les yeux entraînant une accumulation de cystine dans plusieurs tissus, tels que l'iris, la conjonctive et l'épithélium rétinien, cependant, la cornée est la partie la plus touchée en raison de l'accumulation de cystine [19] et présente une épaisseur accrue [20]. En utilisant la coloration H&E, nous avons noté que le poisson zèbre ctns-/- montrait une épaisseur accrue de la couche stromale de la cornée par rapport au poisson zèbre de type sauvage (Figure 10A, B, E). Cependant, nous n'avons pas révélé d'anomalies apparentes dans l'épithélium rétinien des ctns-/-zebrafish (Figure 10C, D).

Figure 9. Vitesse de nage moyenne chez les poissons sauvages et ctns−/−zebrafish. La vitesse moyenne est diminuée chez le poisson ctns−/−zèbre par rapport au type sauvage chez les deux sexes. La vitesse de nage moyenne est mesurée en pixel/seconde. Chaque point représente un poisson zèbre, pour un total de n=6 de type sauvage et n=6 ctns−/−18-poisson zèbre âgé d'un mois. ANOVA à deux facteurs avec test de la différence la moins significative (PLSD) de Fisher : ** p <>

Illustration 10. Histologie oculaire chez le poisson zèbre de type sauvage et ctns−/−. (A, B) Images représentatives de la cornée de type sauvage (A) et ctns-/- (B) 18-poisson zèbre d'un mois. La couche stromale de la cornée (pointes de flèches noires et lignes noires). Coloration H&E. Les barres d'échelle représentent 50 µm. (C, D) Images représentatives de la rétine du poisson zèbre de type sauvage (A) et ctns-/- (B). Coloration H&E. Les barres d'échelle représentent 50 µm. (E) Quantification relative de l'épaisseur de la couche stromale de la cornée. Chaque point représente une fication de l'épaisseur de la couche stromale de la cornée. Test t non apparié avec correction de Welch, bilatéral : * p <>

2.3.6. Phénotypes supplémentaires de poisson zèbre Ctns−/−

En plus des phénotypes mentionnés ci-dessus, nous avons effectué une analyse histologique du cerveau et des ovaires sans trouver de différences entre les ctns-/- et les poissons zèbres de type sauvage. De plus, nous avons évalué la longueur et le poids corporels des ctns-/- et des poissons zèbres de type sauvage à 18 mois et nous avons constaté une augmentation du poids corporel des poissons ctns-/-zèbres, tandis que nous avons constaté une augmentation de la longueur corporelle des poissons ctns-/-zèbres des deux sexes par rapport au type sauvage (Figure supplémentaire S1).

3. Débat

Au cours des dernières décennies,cystinoseest passé d'une maladie mortelle de l'enfance à un trouble métabolique traitable avec lequel les patients peuvent survivre jusqu'à l'âge adulte et atteindre un âge avancé [21,22]. Une survie plus longue des patients a révélé de nouveaux phénotypes de maladie et soulevé de nouvelles questions concernant la pathogenèse et les effets à long terme des thérapies. À cet égard, l'étude de modèles animaux adultes de cystinose devient de plus en plus pertinente.

Dans la présente étude, nous avons étudié les fonctions rénale et extrarénale manifestations de cystinose chez un modèle de poisson zèbre adulte de 18 mois, ce qui correspond à l'âge humain de 40 à 50 ans [23,24]. Tout d'abord, nous avons validé que le modèle de poisson zèbre adulte ctns−/− présente l'accumulation de cystine dans tout le corps et dans divers organes. Dans leun rein, au niveau histologique, nous avons observé des signes de dommages aux PTEC reflétés par la présence de nombreuses gouttelettes éosinophiles de type hyaline, de vacuoles cytoplasmiques et d'une perte partielle des bordures en brosse. De plus, le poisson zèbre mâle ctns−/− a développé une hypertrophie glomérulaire. Enfin, nous avons montré que l'expression de la caspase 3 clivée était augmentée dans la PTEC rénale du poisson ctns-/-zèbre, indiquant que l'apoptose est impliquée dans la pathogenèse de la cystinose néphropathique chez le poisson zèbre. Depuiscystinoseles patients présentent également extrarénal manifestations, nous avons étudié l'effet de la mutation ctns−/− dans d'autres organes dans notre modèle de poisson zèbre. Fait intéressant, nous avons constaté que la mutation ctns-/-provoquait une altération de l'anatomie de la peau et affectait la fertilité, l'activité locomotrice et les yeux.

Les lysosomes sont les sites de la digestion intracellulaire et sont considérés comme les coordinateurs vitaux du métabolisme cellulaire [25]. Étant une maladie de surcharge lysosomale, la principale caractéristique decystinoseest l'accumulation de cystine lysosomale [26,27]. Fait intéressant, nous avons trouvé une augmentation de 54- fois de la cystine dans le corps entier du 18- mois de cystinose poisson zèbre par rapport au type sauvage, alors que, dans notre étude précédente [10], les larves de poisson zèbre cystinose à 6 jours après la fécondation présentaient un 13- fois augmenté. Dans l'ensemble, ces données suggèrent que la cystine s'accumule au cours de la vie chez le poisson zèbre à cystinose. Les analyses par chromatographie liquide et spectrométrie de masse ont confirmé que, parmi tous les organes,un reinsont le site de prédilection pour l'accumulation de cystine. Un gonflement lysosomal et des gouttelettes éosinophiles hyalines à l'intérieur des lysosomes ont été rapportés dans les PTEC chargés de cystine [28,29] et, dans les biopsies humaines, les cristaux de cystine apparaissent sous forme d'espaces de forme polymorphe dans les macrophages interstitiels et le cytoplasme des PTEC [27]. Dans les tissus humains, l'accumulation et la cristallisation de la cystine est un processus cumulatif se produisant au cours de la vie. En ligne, les cristaux de cystine n'ont pas été détectés chez le poisson ctns-/-zèbre au stade larvaire [10] alors que, dans nos expériences pilotes, nous avons constaté que la forme polymorphe des cristaux de cystine apparaît à l'âge de 3 et 6 mois et est clairement visible à l'âge de 18-mois, suggérant une aggravation progressive des effets de la cystinoseun rein.

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Pour évaluer les modifications histologiques des glomérules, nous avons mesuré les surfaces de la capsule de Bowman, de la touffe glomérulaire et de l'espace de Bowman de ctns-/-zebrafish sur des coupes colorées au PAS. Nous avons constaté que les ctns−/−zebrafish développaient une hypertrophie glomérulaire, suggérant une hyperfiltration. Les lésions glomérulaires légères observées chez le poisson zèbre pourraient être attribuées à la capacité de régénération du poisson zèbreun rein, pouvant ajouter de nouveaux néphrons, ainsi que réparer des néphrons existants [30].

En plus des dommages histologiques, il a été démontré que l'accumulation de cystine active la protéine kinase C déclenchant l'apoptose dans les PTEC [12]. Ainsi, nous avons évalué l'expression clivée de caspase-3 dans PTEC et nous avons constaté que le ctns-/-zebrafish présentait une augmentation de caspase-3 et de fragmentation nucléaire. La présence de caspase clivée -3 a été principalement trouvée dans les cellules qui ont accumulé les vacuoles cytoplasmiques, suggérant que l'apoptose a lieu dans le PTEC lésé. Un mécanisme supplémentaire pouvant expliquer l'augmentation de l'apoptose pourrait être la présence d'espèces réactives de l'oxygène en raison de la réduction du glutathion associée à l'accumulation de cystine [31]. Cependant, d'autres études sont nécessaires pour évaluer si ce mécanisme se produit également chez les ctns-/-zebrafish.

Bien quereinssont les premiers organes les plus touchés,cystinoseest une maladie multi-systémique dans laquelle divers organes, tels que la peau, les gonades, les yeux et les muscles sont impliqués. D'après la littérature, il est connu que les patients atteints de cystinose présentent fréquemment un vieillissement cutané prématuré, des cheveux blonds et une couleur de peau claire [13]. Ce dernier phénotype est dû à l'implication des cystinos dans le transporteur dans la régulation de la synthèse de la mélanine [32] et dans le maintien d'une pigmentation plus foncée grâce au transporteur de cystéine nouvellement découvert MFSD12 [33]. De manière passionnante, notre modèle de poisson zèbre adulte ctns-/- présentait un motif de peau hypopigmentée et tachetée et montrait une distribution altérée de la mélanine qui n'a pas été observée au stade larvaire [10].

En outre,cystinoseprovoque l'infertilité chez les hommes, tandis que les femmes sont connues pour être fertiles [14]. Des données récentes suggèrent que l'infertilité pourrait être due à une dégénérescence testiculaire progressive, entraînant une altération de la qualité du sperme, ou à une obstruction dans une partie indéterminée du système excréteur masculin. Les structures obstruées pourraient affecter la qualité du sperme, en particulier dans les régions où les conduits ont un très petit diamètre, par exemple, le retetestis[16]. Chez le poisson zèbre, les spermatozoïdes des processus géniques sont très similaires à ceux des mammifères ; cependant, l'une des principales différences est que la spermatogenèse se produit dans les kystes [34]. Dans notre étude, nous avons trouvé une augmentation des spermatozoïdes dans le kyste spermatogène du poisson ctns-/-zèbre, cependant, nous n'avons pas trouvé de signes de dégénérescence testiculaire. Par conséquent, le phénotype décrit pourrait suggérer une obstruction au niveau des testicules qui entraîne une moindre libération de spermatozoïdes dans l'environnement, mais des études supplémentaires sont nécessaires pour confirmer cette hypothèse. Au niveau fonctionnel, la diminution du nombre d'œufs et la diminution des œufs fécondés semblent refléter une altération de la fertilité des ctns−/−zebrafish.

Une autre manifestation clinique decystinose, touchant généralement les patients à partir de la deuxième décennie de la vie, est la myopathie, caractérisée par une fonte musculaire et une faiblesse [1]. Fait intéressant, nous avons constaté que les poissons zèbres ctns-/-adultes présentent une activité locomotrice réduite par rapport au témoin, ce qui suggère une fonction musculaire altérée. Il convient de noter que ce phénotype n'était pas présent chez les larves [10], ce qui suggère qu'il affecte le poisson ctns-/-zèbre au cours du dernier stade de la maladie. Malgré cela, aucune différence histologique visible n'a été détectée dans les muscles. La diminution de l'activité locomotrice pourrait être due à un dysfonctionnement mitochondrial qui n'a pas pu être détecté par des études histologiques de routine [35–37]. Par conséquent, une caractérisation complète des mitochondries chez le poisson zèbre à cystinose nécessite une évaluation plus approfondie.

En plus des phénotypes mentionnés ci-dessus, plusieurs études ont montré que les patients atteints de cystinose présentent également des symptômes oculaires tels que la photophobie et le blépharospasme [1], la cornée étant l'une des parties les plus touchées de l'œil, entraînant une accumulation de cristaux de cystine et une épaisseur accrue [20]. Cependant, on sait peu de choses sur les causes de l'augmentation de l'épaisseur de la cornée. Par exemple, il a été suggéré que le phénotype décrit est dû à un dysfonctionnement subclinique des cellules épithéliales et/ou endothéliales conduisant à un stromalœdème [20]. Dans notre étude, nous avons constaté que l'affichage du poisson zèbre ctns-/-adulte augmente l'épaisseur de la couche stromale de la cornée, ce qui indique que notre modèle montre des signes de dysfonctionnement de la cornée chezcystinose.

Cistanche pourun reinfonction

L'une des principales lacunes à combler pour une compréhension globale decystinoseest l'absence d'un modèle animal qui récapitule complètement la maladie humaine. Plusieurs modèles de souris ont été développés, montrant une accumulation de cystine mais ne reproduisant pas la totalitérénalphénotype [8,26]. Plus précisément, la souris C57BL/6 présentait une accumulation de cystine dans plusieurs organes, qui augmente avec l'âge [8]. De plus, le modèle murin C57BL/6 présente des lésions tubulaires proximales à partir de l'âge de 6 mois. De même, dans notre modèle, les lésions tubulaires proximales s'aggravent avec le temps. Cependant, au niveau glomérulaire, le modèle de souris C57BL/6 présentait un phénotype normal, tandis que notre modèle de poisson zèbre adulte présentait une hypertrophie glomérulaire. De plus, le modèle de souris C57BL/6 ne parvient pas à imiter la fertilité altérée observée chez l'homme, tandis que le modèle de poisson zèbre ctns-/- présente des kystes spermatogènes enrichis en spermatozoïdes et une diminution de la production d'œufs. Au niveau oculaire, la souris [38] et le modèle ectns−/−zebrafish présentent des anomalies oculaires. Au contraire, au niveau cutané, ce modèle murin ne montre pas d'altération de la production de mélatonine [8], qui apparaît dans le modèle poisson zèbre adulte sous la forme d'un schéma cutané hypopigmenté. Enfin, au niveau comportemental, notre modèle de poisson zèbre ctns−/− présente une diminution de l'activité locomotrice, qui peut être due à une altération de la fonction mitochondriale ou à un effet secondaire de l'augmentation de poids chezcystinosepoisson zèbre. Dans l'ensemble, il semble que notre modèle de poisson zèbre ctns−/− récapitule mieux la maladie humaine. Récemment, Shimizu et al. a établi une nouvelle mutation congénique Ctnsugl dans une souche de rat qui présentaitrénallésions et cristaux de cystine dans les lysosomes duun reincortex [7]. Cependant, une caractérisation plus détaillée du modèle fait encore défaut. Par conséquent, il est urgent de développer et de caractériser de nouveaux modèles fonctionnels qui récapitulent la maladie humaine.

En conclusion, nous avons démontré que notre modèle adulte de poisson zèbre ctns−/− reproduit plusieurs phénotypes humains de bac à cystine peut être utile pour étudier la pathogenèse de la maladie chez l'adulte et pour tester les effets à long terme de nouveaux médicaments pour corriger les fonctions rénales et extra-rénales.rénalmanifestations.

4. Matériels et méthodes

4.1. Maintenance et élevage du poisson zèbre

Le poisson zèbre a été manipulé et entretenu conformément aux réglementations sur le bien-être animal de la KU Leuven (approbation éthique n°142/2019). Pour cette étude, nous avons inclus le poisson zèbre ctns-/- à l'âge de 18 mois et le poisson zèbre témoin de type sauvage dans les deux sexes. Les détails de la génération du ctns-/-zebrafish ont été décrits dans notre étude précédente [10].

4.2. Mesure de la cystine

Les niveaux de cystine ont été mesurés chez le poisson zèbre (poisson mâle de type sauvage, n=3et ctns−/−poisson mâle, n=3) et la quantité a été exprimée en nmol/mg de protéines. Tout d'abord, les poissons zèbres ont été sacrifiés par immersion dans du méthanesulfonate de tricaïne MS-222 (300 mg/L), puis des échantillons de tissus ont été soniqués en présence de 200 µL de N-éthylmaléimide 5 mM (NEM, St. Louis, MO, USA, Sigma-Aldrich E3876) dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (PBS), pour un maximum de 200 mg de tissu pour chaque lysat. Par la suite, 100 µL d'acide sulfosalicylique à 12 % (SSA) ont été ajoutés à chaque homogénat, et les échantillons ont été centrifugés à 12 000 g pendant 10 min à 4 °C. Les surnageants contenant de la cystine ont été stockés à -80◦C jusqu'au moment de l'analyse, tandis que les culots ont été dissous pendant une nuit à 4◦C dans 300 µL de NaOH 0,1 M et conservés à -80◦C jusqu'à ce que la protéine soit mesurée à l'aide du kit de réactifs Pierce BCA Protein Assay. Par la suite, la quantité (nmol) de cystine a été normalisée à la quantité (mg) de protéine de chaque échantillon. Ensuite, 50 µL du surnageant contenant de la cystine ont été dopés avec 50 µL de la solution d'étalon interne (Cystine d6) et vortexés pendant 5 s ; puis le mélange a été extrait avec 200 µL d'acétonitrile, vortexé pendant 30 s, puis centrifugé à 16,000 g pendant 9 min. Les analyses par chromatographie liquide et spectrométrie de masse ont été réalisées par un UHPLC Agilent1290InfinityII6470 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, USA) équipé d'une source ESI-JET-STREAM fonctionnant en mode ions positifs (ESI plus). Le logiciel utilisé pour contrôler cet équipement et analyser les données était MassHunter (Poste de travail Agilent Technologies, Barcelone, Espagne). La colonne de séparation utilisée était InfinityLab Poroshell 120 HILIC 1,9 µm 100 x 2,1 mm (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA).

4.3. Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine et à l'acide périodique

Poisson zèbre (poisson femelle de type sauvage, n=3 ; poisson mâle de type sauvage, n=3 ; ctns−/−poisson femelle, n=3 ; ctns−/−poisson mâle, n=3) ont été sacrifiés par immersion dans du méthanesulfonate de tricaïne MS -222 (300 mg/L), après quoi le poisson zèbre entier a été fixé dans du paraformaldéhyde tamponné à 4 % (PFA à 4 %) à 4 °C pendant 1 semaine . Après avoir été lavés deux fois avec du PBS, les poissons zèbres ont été transférés dans une solution d'EDTA (100 mM, pH=8) pour la décalcification pendant encore 1 semaine, suivie d'une inclusion dans de la paraffine. Des tissus de poisson zèbre inclus en paraffine ont été coupés (4- µm d'épaisseur) sur un microtome Leica (LeicaBiosystems, Wetzlar, Allemagne). Les coupes ont été colorées avec H&E et PAS selon les protocoles standards.

Pour les études histologiques des yeux de poisson zèbre (poisson femelle de type sauvage, n=3 et ctns-/-poisson femelle, n=3), les yeux ont été énucléés et fixés dans du PFA à 4 % à température ambiante pendant 4 h. L'intégration suivante dans un milieu à température de coupe optimale (Tissue-Tek® VIP® ; Sakura Finetek, Japon), des cryosections de 10- µm ont été réalisées (Cryostar NX70, Thermofisher Scientific, Tokyo, Japon). Les coupes ont été colorées avec H&E selon les protocoles standards. Les images ont été réalisées avec un microscope à fond clair Leica (Leica DM6, Wetzlar, Allemagne).

4.4. Immunohistochimie (coloration caspase clivée-3)

Des sections avec le tissu de poisson zèbre fraîchement coupé ont été déparaffinées et réhydratées. Les sections ont été soumises à une récupération d'antigène induite par la chaleur en utilisant un tampon citrate 10 mM (pH=6). Après blocage avec 5 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans du dPBS, les sections ont été incubées avec de la caspase anti-clivée de lapin -3 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA, dilution 1:200) suivie d'une solution anti-lapin -Envision, anticorps secondaire marqué au HRP (Dako Products, Agilent, Santa Clara, CA, USA). Comme témoin négatif, un sérum de lapin normal a été utilisé. La diaminobenzidine (DAB, DAKO, Glostrup, Danemark) a été utilisée comme chromogène. Par la suite, les coupes ont été contre-colorées avec H&E, déshydratées et montées.

Traitement de la maladie rénale : Cistanche

4.5. Coloration au bleu de toluidine et TEM

Poisson-zèbrerénalles tissus (poisson zèbre mâle de type sauvage, n=3 et poisson zèbre mâle ctns−/−, n=3) ont été récoltés et fixés dans le tampon de fixation EM (1,5 % de glutaraldéhyde/1 % de paraformaldéhyde) pendant 24 h . Par la suite, les tissus rénaux ont été post-fixés avec 2,5 % de glutaraldéhyde/1,2 % d'acroléine dans un tampon de fixation (0.1 mol/L de cacodylates, 0.1 mol/L de saccharose, pH 7,4) et 1 pour cent de tétroxyde d'osmium, et incorporé dans de la résine. Des coupes semi-fines (0.5-µm d'épaisseur) ont été colorées au bleu de toluidine. Les coupes ultrafines ont été colorées avec de l'acétate d'uranyle. Les images ont été collectées à l'aide d'une microscopie électronique à transmission JEM -1200 EX (JEOL Ltd, Tokyo, Japon) avec différents grossissements.

4.6. Analyse d'images numériques

Les lames colorées ont été numérisées à l'aide d'un Philips Ultra-Fast Scanner 1.6 RA (Philips, Eindhoven, Pays-Bas)

4.6.1. Analyse de l'hypertrophie glomérulaire

Pour analyser l'hypertrophie glomérulaire chez le poisson zèbre, les surfaces (µm2) de la capsule de Bowman, de l'espace de Bowman et de la touffe glomérulaire ont été mesurées sur des lames colorées au PAS. Tous les glomérules disponibles par section ont été inclus et mesurés à l'aide du logiciel ImageJ. La moyenne des mesures de chaque poisson zèbre a été utilisée pour l'analyse statistique.

4.6.2. Caspase clivée-3 Analyse d'expression

Twoobserversscoredthecleavedcaspase-3expressioninthetubulesofeachzebrafish. The semiquantitative score was conducted on the three randomized tubular fields in each zebrafish(20×magnification). Thepercentageofcaspase-3positivearearelativetothetotal area of tubules was scored as 1 (negative staining), 2 (1–10% positive staining), 3 (10%–25% positive staining), 4 (>25 % de coloration positive). La moyenne du score de chaque poisson zèbre a été utilisée pour l'analyse statistique.

4.6.3. Épaisseur de l'analyse du stroma cornéen

L'épaisseur du stroma cornéen du poisson zèbre (grossissement 10x) a été mesurée aux mêmes distances du centre de l'œil en utilisant le logiciel ImageJ sur le poisson zèbre. Pour chaque image, n=7 mesures à différents endroits de la section de l'œil (centre, milieu, périphérie) ont été prises le long de la cornée à des intervalles de 100 µM. La moyenne des mesures a été utilisée pour l'analyse statistique.

4.7. Étude de fertilité

La fertilité a été évaluée en accouplant des poissons zèbres femelles et mâles (poisson mâle de type sauvage, n=4 et poisson femelle de type sauvage, n=6 et poisson ctns−/−mâle, n=4 et ctns−/−poisson femelle, n=6) dans un bac de ponte. Le lendemain matin, une heure après la lumière, les embryons ont été collectés et le nombre total d'œufs produits a été enregistré. Les œufs fécondés ont été examinés et comptés à partir des œufs non fertiles en utilisant la microscopie optique. L'élevage a été effectué n=7 fois par semaine d'affilée. Deux expériences n'ayant entraîné aucune production d'œufs simultanément chez les poissons de type sauvage et ctns-/-zebrafish ont été exclues.

4.8. Activité locomotrice

Poisson zèbre (poisson femelle de type sauvage, n=6 ; poisson mâle de type sauvage, n=6 ; ctns−/−poisson femelle, n=6 ; ctns−/−poisson mâle, n=6) ont été placés dans les logements réguliers et, après un temps d'adaptation de 5 min, ont été filmés pendant 5 min. L'enregistrement vidéo a été exécuté à l'aide d'une GoPro® HERO 7 placée au-dessus du réservoir, offrant ainsi une vue de dessus du poisson nageant. La résolution et la fréquence d'images ont été réglées respectivement sur 1080p (1920×1080) et 30 fps. Les vidéos ont été analysées avec le Tracker.ai pour suivre les trajectoires des poissons zèbres individuels tout au long de l'expérience. Les trajectoires ont ensuite été analysées avec un code python personnalisé pour dériver la vitesse locomotrice moyenne (pixel/sec) dans chaque groupe [39].

Cistanche-rénal

4.9. Mesures du poids corporel et de la longueur

Des poissons zèbres ont été euthanasiés par immersion dans 300 mg/Loftricaïneméthanesulfonate MS-222. Après vérification de l'absence de réponse aux stimuli externes, les poissons zèbres euthanasiés ont été placés sur un mouchoir en papier et séchés. La longueur du poisson zèbre euthanasié a été évaluée à l'aide d'un pied à coulisse, mesurant du bout de la bouche au pédoncule caudal. Le poids du poisson zèbre euthanasié a été évalué avec une balance analytique.

4.10. Analyses statistiques

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide de SPSS (IBM, New York, NY, USA) et GraphpadPrism (GraphPadSoftware, LaJolla). Les données de deux groupes ont été analysées à l'aide d'un test t non apparié avec correction de Welch, bilatéral. Les données de deux variables indépendantes catégorielles ont été analysées avec une ANOVA à deux voies avec le test de la différence la moins significative de Fisher (PLSD). Les différences avec p < 0.05="" ont="" été="" considérées="" comme="" statistiquement="">

4.11. Étude de fertilité

Pour la comparaison des taux de production d'œufs entre le poisson de type sauvage et le poisson zèbre ctns-/-, une analyse de régression de Poisson utilisant des équations d'estimation généralisées avec des erreurs standard robustes pour tenir compte de la corrélation des taux avec les expériences a été effectuée. Pour la comparaison de l'offre de cotes, les œufs utilisés entre les œufs de type sauvage et ctns-/-zebrafishAlogistical analyse de régression à l'aide d'équations d'estimation généralisées avec des erreurs standard robustes pour tenir compte de la corrélation des cotes dans les expériences ont été effectuées.

Documents supplémentaires : Les éléments suivants sont disponibles en ligne sur https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms22179398/s1.

Contributions des auteurs : Conceptualisation, SPB, JH, LvdH, HJB, EL ; méthodologie, SPB, JH, LDG, HT, TN, PB, SC, BG ; logiciels SPB, JH, LDG, HT, TN ; validation, SPB, JH, LDG, PB, LvdH, HJB et EL ; analyse formelle, SPB, JH, LDG, HT, TN ; enquête, LvdH, HJB, EL; ressources, HJB et EL ; conservation des données, SPB, JH, LDG, LvdH, HJB, EL ; rédaction—préparation du projet original SPB, JH; rédaction—révision et édition, LvdH, HJB, EL; visualisation, LvdH, HJB, EL ; supervision, PdW, LvdH, HJB, EL ; gestion de projets, LvdH, HJB, EL ; financement acquisition, HJB, EL Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.

Financement : les auteurs aimeraient reconnaître le fonds interne de la KULeuven C1 Grant à E.L. (C14/17/113), The China Scholarship Council Grant to JH (CSC n◦ 201508500109), et la bourse postdoctorale FWO à LDG (12I3820N).

Déclaration du comité d'examen institutionnel : l'étude a été menée conformément aux directives de la déclaration d'Helsinki et approuvée par le comité d'éthique de la KU Leuven n.142/2019. Remerciements : Nous tenons à remercier : Didier Cagnini pour l'évaluation de l'histologie du cerveau chez les poissons zèbres ctns−/− et de type sauvage, KathleeenLambaerts, FrédéricHendrickx et KimvanKelst pour leur soutien et leur assistance constants dans les installations aquatiques de la KU Leuven, Peter Neeskens pour le support technique du TEM, et Ron Wolterbeek pour l'analyse statistique.

Conflitsd'intérêts : Les auteursdéclarentaucunconflitd'intérêts. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude ; dans la collecte, l'analyse ou l'interprétation des données ; dans la rédaction du manuscrit, ou dans la décision de publier les résultats.

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