Le CD169 rénal plus les macrophages résidents sont cruciaux pour la protection contre la candidose systémique aiguë
Mar 21, 2022
IntroductionLa candidose systémique est la quatrième infection nosocomiale courante du sang qui, selon les estimations, touche plus de 250 000 patients des unités de soins intensifs chaque année, malgré l'administration de pratiques d'hygiène dans les hôpitaux (Delaloye et Calandra, 2014 ; Kullberg et Arendrup, 2015). Bien que le traitement actuel de cette infection utilise principalement des médicaments antifongiques, le taux de mortalité chez les patients reste alarmant (40 à 60 %) (Delaloye & Calandra, 2014 ; Bassetti et al, 2018 ; Lamoth et al, 2018). Pourtant, aucun vaccin n'est cliniquement disponible à ce jour. Avec l'augmentation de la population de patients hospitalisés souffrant de maladies chroniques et l'émergence de cas de résistance aux antifongiques, la compréhension de l'immunité de l'hôte contre une telle infection sera importante dans le développement de l'immunothérapie pour améliorer ou compléter les interventions antifongiques actuelles (Armstrong-James et al, 2017 ; Desai et al, 2017 ; Bassetti et al, 2018). Largement connus comme les acteurs centraux de l'immunité antifongique invasive, les phagocytes, en particulier les phagocytes polymorphonucléaires (neutrophiles), utilisent divers mécanismes pour contrôler les infections fongiques, tels que la phagocytose, la libération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) et de protéines microbicides, et la formation de NETosis ( Borregaard, 2010 ; Mantovani et al, 2011). Le rôle central des neutrophiles dans l'immunité à Candida est encore souligné par l'association clinique de la neutropénie et des anomalies des neutrophiles en tant que facteurs prédisposants à la candidose systémique (Lehrer & Cline, 1969 ; Wisplinghoff et al, 2004 ; Pfaller & Diekema, 2007 ; Yapar, 2014) . Cependant, on en sait beaucoup moins sur les rôles des différents phagocytes mononucléaires dans cette infection in vivo, en partie en raison du manque d'outils disponibles pour délimiter les différents sous-ensembles de macrophages et de cellules dendritiques dans lereins,qui sont les principaux organes cibles des candidoses systémiques (Schraml et al, 2013 ; Gottschalk & Kurts, 2015).
Mots clés:un rein; lésion rénale; tissu rénal; fongique rénal; dommages rénaux; fonction rénale
CISTANCHE AMÉLIORE LA FONCTION RÉNALE/RÉNALE
L'importance des macrophages dans l'immunité invasive à Candida a, à notre connaissance, été démontrée pour la première fois par Lionakis et al (2013). Profitant des souris CX3CR1gfp/gfp, où leur nombre derénalpopulation de macrophages sont fortement réduites, Lionakis et al (2013) ont montré querénalles macrophages résidents sont les défenseurs cruciaux de première ligne contre l'assaut de C. Albicans (Lionakis et al, 2013). De plus, ces macrophages semblaient être impliqués dans la régulation du recrutement des neutrophiles vers lereinslors d'une infection à Candida (Kanayama et al, 2015). En plus de favoriser la clairance fongique, il a été rapporté que les macrophages jouent un rôle dansrénalréparation tissulaire (Tran et al, 2015). CD169, également connu sous le nom de Sialoadhésine ou lectine 1 de type immunoglobuline se liant à l'acide sialique (Siglec-1), a déjà été signalé comme étant un marqueur spécifique qui identifie les macrophages résidant dans les tissus (TRM) dans divers organes périphériques tels que les poumons , rate, foie etreins(Purnama et al, 2014 ; Karasawa et al, 2015 ; Gupta et al, 2016 ; Svedova et al, 2017). De façon intéressante,rénalLe CD169 plus les macrophages ont été associés à l'immunorégulation, soit vers la progression de l'immunopathologie, soit vers la résolution immunitaire, selon les modèles de maladie/blessure (Chavez-Galan et al, 2015). Cependant, on sait peu de choses sur le rôle fonctionnel in vivo de CD169 plus les macrophages dans l'immunité systémique à Candida. Ici, nous montrons querénalLes macrophages CD169 plus plus sont d'importants régulateurs immunitaires dans l'infection systémique aiguë à Candida. L'absence de CD169 plus plus de macrophages diminue la réponse IFN et la production de ROS neutrophiles dans lereins.En conséquence, les souris dépourvues de CD169 plus plus de macrophages succombent à une infection à Candida à faible dose, présentant une charge fongique extrêmement élevée et unerénalimmunopathologie.
Résultats
Les macrophages CD169 plus plus sont une sous-population de TRM rénauxPour étudier les TRM rénaux, nous avons exploité un modèle de souris transgénique CD169-DTR qui élimine spécifiquement les TRM lors du traitement par la toxine diphtérique (DT) en raison de leurs expressions CD169 (Purnama et al, 2014 ; Gupta et al, 2016 ; Chen & Ruedl , 2020). Outre CD169, un niveau d'expression élevé de F4/80 et un niveau intermédiaire de CD11b ont été utilisés dans notre autre analyse de cytométrie pour distinguer les TRM des autres sous-populations de macrophages (Sheng et al, 2015) (Fig 1A). Fait intéressant, seule une partie de la population derénalLes macrophages F4 / 80hi CD11bint ont été enlevés chez nos souris transgéniques CD 169- DTR traitées par DT (Fig 1A et B), suggérant une hétérogénéité de la population de macrophages F4 / 80hi CD11bint dans leun rein.Parallèlement à notre observation, Karasawa et al (2015) ont également souligné que seul un sous-ensemble desrénalLes TRM expriment le CD169 (Karasawa et al, 2015). En particulier, ils ont montré que les TRM CD169 plus plus se localisent principalement dans lerénalrégion médullaire, corroborant avec nos colorations d'immunofluorescence (Fig 1C).
Ici, nous avons noté que les TRM CD169 plus ablatés expriment des niveaux modérément inférieurs de F4/80 et CD11b (F4/80 plus plus CD11b plus ), alors que les TRM non atténués expriment des niveaux comparativement plus élevés de F4/80 et CD11b (F4/80 plus plus plus CD11b plus plus ). Cependant, ces deux populations de TRM sont indiscernables chez les souris WT (Fig 1A). Par conséquent, sur la base des TRM ablatés et non atténués, nous les avons largement sous-catégorisés en Fraction I (Fr I) (CD169 plus plus F4/80 plus plus CD11b plus) et Fraction II (Fr II) (CD169 plus F4/80 plus plus plus CD11b plus plus ) populations (Fig. 1A et B). Il convient de noter que la réduction notable, mais non significative, de la population Fr II chez les souris CD169-DTR indique également qu'une partie de la population Fr II exprime CD169. Le profil d'ablation TRM chez la souris CD 169- DTR est cohérent avec l'expression du transcrit CD169, dans laquelle la population Fr I exprime un niveau significativement plus élevé de CD169 par rapport à la population Fr II (Fig 1D). De manière correspondante, des niveaux plus élevés de facteur de croissance humain de type EGF se liant à l'héparine (HB-EGF), le récepteur du DT, ont été observés dans Fr I par rapport aux TRM Fr II, expliquant leur sensibilité au traitement DT (Fig 1E).
CISTANCHE AMÉLIORE L'INSUFFISANCE RÉNALE/RÉNALE
L'absence de CD169 rénal plus plus de macrophages a grandement compromis la résistance de l'hôte contre la candidose disséminéePour évaluer l'importance des macrophages CD169 plus plus, des souris CD169-DTR et WT ont été provoquées par voie intraveineuse avec une faible dose de 5 × 104 ufc de C. Albicans, et leur survie a été surveillée pendant 18 jours. Au cours de l'infection, les souris ont été traitées en continu avec du DT pour assurer une ablation continue de la population Fr I chez les souris CD 169- DTR (Fig S1). Une réduction partielle des macrophages Fr I a également été observée chez les souris WT infectées au jour 3 après l'infection (pi) (Fig 1F), ce qui pourrait être le résultat d'une nécroptose des macrophages, un événement qui a été signalé lors d'infections pathogènes (Lai et al , 2018 ; Cao et al, 2019). À l'inverse, l'ablation complète des macrophages Fr I chez les souris CD169-DTR était principalement due à l'apoptose induite par le traitement DT. Néanmoins, le nombre de macrophages Fr I chez les souris CD169-DTR était systématiquement et sensiblement inférieur à celui des souris WT tout au long de l'infection. En revanche, le nombre total de macrophages Fr II était comparable entre les souris infectées WT et CD169-DTR (Fig 1F, panneau de droite). Par conséquent, les souris CD169-DTR, dépourvues de Fr I TRM, étaient nettement plus vulnérables que les souris WT lorsqu'elles étaient confrontées à une infection systémique à Candida (Fig 1G).
Les souris CX3CR1gfp/gfp ont déjà été utilisées pour interroger la fonction deun reinTRM en raison de sa perte totalerénalF4/80 plus CD11b plus population (Lionakis et al, 2013). La comparaison entre les souris CX3CR1gfp/gfp et CD169-DTR permet donc de comprendre les conséquences fonctionnelles entre la population de perte partielle et totale de TRM rénaux. Pour ce faire, nous avons infecté des souris CD169-DTR, CX3CR1gfp/gfp et WT avec 5 × 104 ufc de C. Albicans. Semblable à ce qui avait été rapporté précédemment, les souris CX3CR1gfp / gfp présentaient une absence totale de TRM rénaux (populations Fr I et II), tandis que les souris CD 169- DTR présentaient une perte plus distinctive de la population Fr I (Fig S2A et B ). De même, l'absence de macrophages Fr I et II a rendu les souris CX3CR1gfp / gfp très sensibles à la candidose systémique (Fig S2C), avec une charge fongique rénale extrêmement élevée dès le jour 1 pi par rapport aux WT et CD infectés {{20 }} Souris DTR (Fig S2D). En revanche, les souris CD169-DTR ont affiché une mortalité plus faible que les souris CX3CR1gfp/gfp (Figs 1G et S2C), et leurrénalla charge fongique n'était significativement plus élevée que chez les souris WT infectées au jour 10 (Fig 2A et B). Étant donné que les souris CD169-DTR et CX3CR1gfp/gfp traitées au DT manquent de TRM dans d'autres organes (Hochheiser et al, 2013 ; Gupta et al, 2016 ; Lee et al, 2018), nous avons évalué les charges fongiques dans plusieurs organes périphériques , C'est,un rein,cerveau, cœur, poumons, foie et rate chez des souris infectées WT, CD169-DTR et CX3CR1gfp/gfp au jour 1 pi Curieusement, chez les souris CD169-DTR et CX3CR1gfp/gfp, reins étaient les seuls organes présentant une charge fongique nettement plus élevée que le reste des organes étudiés (Fig S2D). La quantité élevée de charge de Candida dans les reins CX3CR1gfp/gfp au jour 1 réaffirme les résultats rapportés par Lionakis et al (2013), dans lesquelsrénalLes TRM sont vitaux pourrénaldéfense de première ligne contre l'infection systémique à Candida (Lionakis et al, 2013).
D'autre part, lerénalla charge fongique chez les souris CD169-DTR était significativement inférieure à celle des souris CX3CR1gfp/gfp, mais pas nettement supérieure à celle des souris WT infectéesreinsau jour 1 pi (Fig S2D). Étant donné que la population Fr II reste relativement intacte chez les souris CD169-DTR (Fig S2A et B), nous nous sommes demandé si la résistance accrue observée chez les souris CD169-DTR, par rapport aux souris CX3CR1gfp/gfp, était principalement en raison des macrophages rénaux Fr II restants qui fonctionnent pour empêcher la plupart des C. Albicans d'envahir les tubules rénaux, une zone où très peu de cellules immunitaires ont été détectées pendant l'état d'équilibre. À cette fin, nous avons surveillé la charge fongique de divers organes chez les souris WT et CD169-DTR aux jours 1, 3, 6 et 10 pi (Fig 2). Ici, nos données ont montré la dépendance restreinte aux reins de CD169 plus plus les macrophages dans la clairance fongique, car tous les organes étudiés, à l'exception des reins, chez les souris CD 169- DTR ont été débarrassés de C. Albicans au jour 10 pi (Fig 2A) . Fait intéressant, malgré la perte du sous-ensemble Fr I, la charge fongique chez les souris DTR CD 169- a augmenté de la même manière que les souris WT infectées (jours 0 à 6) (Fig 2A et B), suggérant des rôles minimes du CD169 rénal plus plus macrophages pour déclencher une défense de première ligne contre cette infection. La disparité de la charge fongique rénale entre les souris CD169-DTR et WT n'a été détectée qu'au jour 10 pi, où la charge fongique des reins appauvris en CD169- a continué d'augmenter, alors que celles des souris WT semblaient être contenue ou dégagée (Fig 2B). Par conséquent, nos données démontrent le rôle indispensable de CD169 plus plus des macrophages dans l'immunité rénale à Candida, mais probablement avec peu de contribution à la défense rénale de première ligne contre une telle infection. De manière frappante, étant donné que les souris CX3CR1gfp / gfp manquaient à la fois de macrophages Fr I et Fr II et affichaient une sensibilité accrue dès le jour 1 pi (Fig S2), nous avons émis l'hypothèse que Fr II CD169 plus les macrophages sont principalement responsables du mécanisme inné critique du champignon rénal précoce. contrôler.
Des souris CD169-DTR ont souffert de lésions rénales irréversibles et progressives lors d'une infection à CandidaParce que les reins étaient les seuls organes où C. Albicans s'est accumulé pendant l'infection (Fig 2A), nous avons ensuite effectué un examen histopathologique des coupes colorées à l'acide périodique Schiff (PAS) (Fig 2C) et H&E (Figs 3A et S3) obtenues. à partir de reins WT et CD169-DTR infectés aux jours 3, 6 et 10 pi Au jour 3, des signes de lésions rénales et d'hémorragies ont été observés dans les reins CD169-DTR (Fig S3A). Au jour 6, les reins WT infectés présentaient des signes mineurs de lésions tubulaires et endothéliales, tandis que les reins CD169-DTR infectés présentaient des hémorragies plus graves et une nécrose tubulaire (Fig S3B). Dans les reins infectés WT et CD169-DTR, la plupart des C. Albicans semblaient s'accumuler dans le bassinet du rein (Fig 2C). Il convient de noter qu'il y avait une accumulation de leucocytes in situ à la fois dans WT et
CD169-reins DTR, suggérant que la croissance incontrôlée de C. Albicans dans les reins CD169-DTR n'est pas due à l'absence de recrutement de leucocytes (Figs 2C et 4A). Au jour 10, l'intégrité structurelle des reins CD169-DTR s'est détériorée, accompagnée de l'apparition de tissus fibrotiques (Figs 3A et S3C). Plus précisément, l'élargissement de l'espace de Bowman et la perte importante de cellules épithéliales tubulaires et d'amas de leucocytes dans la lumière de certains tubules rénaux des reins CD 169- DTR étaient clairement visibles (Fig 3A). En revanche, au jour 10, la plupart des régions rénales des reins WT semblaient rester intactes, indiquant une guérison après une infection précoce (Figs 3A et S3C). Parallèlement aux analyses histologiques rénales, nous avons évalué le niveau de molécule de lésion rénale -1 (Kim-1) dans le rein infecté WT et CD169- DTR, une protéine transmembranaire de type -1 où son expression n'est augmentée qu'en cas de lésion des tubules rénaux (Ichimura et al,
1998 ; Han et al, 2002 ; Bonventre, 2009). Nos données ont montré que l'expression de Kim-1 dans les reins des souris CD169-DTR infectées était considérablement plus élevée que dans le WT infecté au jour 10 pi (Fig 3B). De plus, l'intégrité de la muqueuse endothéliale dans les reins des souris CD169-DTR était significativement affaiblie, comme en témoigne une plus grande quantité de bleu d'Evan retenu dans les reins CD169-DTR (Fig 3C). Il a déjà été démontré que CD169 plus les macrophages sont anti-inflammatoires, l'absence de ces macrophages entraînant une sur-inflammation lors d'une infection bactérienne ou d'une lésion d'ischémie-reperfusion (Karasawa et al, 2015 ; Svedova et al, 2017). Conformément à ces modèles, les reins des souris CD169-DTR étaient associés à des niveaux d'inflammation plus élevés (c'est-à-dire TNF-, G-CSF et M-CSF) et la fonction rénale s'est avérée considérablement compromise lorsque
L'absence de CD169 rénal plus plus de macrophages n'a pas altéré le recrutement de cellules effectrices lors d'une infection à CandidaÉtant donné que la clairance inefficace de Candida dans les reins CD{{0}}DTR pourrait être due au manque de recrutement de cellules effectrices, nous avons surveillé l'infiltration neutrophile et monocytaire dans les reins des souris WT et CD169-DTR aux jours 0, 1, 3, 6 et 10 pi Semblable à nos observations histologiques (Fig 2C), l'absence de macrophages rénaux CD169 plus plus Fr I n'a pas affecté le recrutement des leucocytes au cours de l'infection (Fig 4A). Au lieu de cela, les reins CD169-DTR étaient associés à une expression plus élevée de chimiokines attirant les neutrophiles et les monocytes (par exemple, CXCL1, CXCL2 et CCL2) et des molécules d'adhésion cellulaire (par exemple, ICAM-1) (Fig 4B et C). L'augmentation du niveau de chimiokines dans le rein CD169-DTR, potentiellement due à la croissance effrénée de C. Albicans, est corrélée à une quantité élevée d'infiltration de cellules immunitaires du jour 6 au jour 10 pi En revanche, il y avait peu de signes de C. Albicans dans les reins WT et les cellules immunitaires ont été largement éliminées au jour 10 pi (Figs 2B et 4A). Ainsi, nos données suggèrent que le CD169 rénal plus les macrophages n'étaient pas les principaux acteurs du recrutement des cellules effectrices, en particulier des neutrophiles, lors d'une infection à Candida.
Les neutrophiles dans les reins CD169-DTR génèrent une production de ROS plus faibleEnsuite, nous avons cherché à savoir si l'absence de CD169 plus plus de macrophages avait un impact négatif sur la réponse candidacide de l'hôte dans les reins. À cette fin, nous avons évalué la quantité de neutrophiles et de monocytes producteurs de ROS dans les reins WT et CD169-DTR infectés au jour 6 pi, le jour où les reins WT et CD169-DTR présentaient une charge fongique similaire et infiltration cellulaire (Figs 2B et 4A). Fait intéressant, nous avons observé une quantité inférieure de neutrophiles producteurs de ROS, mais pas de monocytes, dans les reins CD 169- DTR par rapport au WT (Fig 5A et B). De même, ces neutrophiles dans les reins CD169-DTR ont généré des niveaux de ROS significativement inférieurs à ceux du WT, ce qui suggère une capacité de destruction des neutrophiles plus faible (Fig 5C et D).
Nous avons ensuite cherché à déterminer si la diminution de la fonction candidacide dans les reins CD169-DTR était due à la viabilité réduite des neutrophiles. Étonnamment, les reins infectés WT et CD 169- DTR ont montré une proportion similaire d'annexine V de PIneg plus apoptotique et de PI plus annexine V plus neutrophiles morts (Fig 5E et F). Cela indique que la viabilité des neutrophiles n'est pas l'un des facteurs contribuant à leur fonction candidacide compromise dans les reins CD169-DTR L'expression rénale de l'IFN était significativement plus faible en l'absence de CD169 plus plus de macrophages L'association d'une clairance inefficace de Candida et d'une diminution des ROS niveaux dans les neutrophiles des reins CD169-DTR nous ont incités à étudier le niveau d'expression de l'IFN dans les reins infectés WT et CD169- DTR au jour 6 pi Cette cytokine est connue pour protéger contre la candidose invasive en potentialisant capacité candidacide des neutrophiles (Diamond et al, 1991; Kullberg et al, 1993; Stevenhagen & van Furth, 1993; Nader-Djalal & Zadeii, 1998). Curieusement, nous avons observé une diminution de l'expression de l'IFN rénal dans les reins CD169-DTR infectés par qPCR (Fig 6A), ainsi que par une autre analyse de cytométrie (Fig 6B).
Les cellules productrices d' IFN sont limitées à une chaîne légère kappa CD19int plus une population de cellulesEnsuite, nous avons tenté de délimiter le type de cellules immunitaires qui produisent l'IFN au jour 6 pi (Fig 7A). À notre grande surprise, ces cellules productrices d'IFN sont Ly6CintLy6Glo, F4/80loCD11blo, MHCII plus CD11clo, CD49bnegCD3neg et CD8negCD4neg, ce qui indique qu'elles ne sont pas des lymphocytes T, des APC classiques et des granulocytes. Au lieu de cela, ces cellules productrices d'IFN, qui sont réduites distinctement dans les reins CD169-DTR infectés (Fig 7B), expriment MHCII, la chaîne légère kappa et CD19int, suggérant une population de type cellule B (Fig 7A) . Parce que les cellules NK sont des modulateurs importants pour potentialiser les mécanismes antifongiques des phagocytes par la sécrétion d'IFN dans les infections à Candida (Bhatnagar et al, 2010; Costantini et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al, 2014), nous avons enfin cherché à réaffirmer si Les cellules NK sont nécessaires pour réguler la production d'IFN dans cette infection. À cette fin, nous avons immunodéplété les cellules NK in vivo et évalué le niveau d'expression de l'IFN dans les reins infectés aux jours 2 et 6 pi Nos données ont révélé que la déplétion des cellules NK n'affectait pas la production d'IFN ni la quantité de cellules productrices d'IFN ( Fig S4A–C).
Discussion
Les TRM induisent des réponses innées importantes dans diverses maladies infectieuses et sont généralement reconnus comme des populations F4/80hi et CD11b plus. La sialoadhésine, également connue sous le nom de CD169, a été mise en évidence comme n'étant exprimée que par un sous-ensemble de TRM dans le rein (Karasawa et al, 2015) ; cependant, il n'y a pas eu de rapport ultérieur sur le CD169 rénal plus TRM. Nos données confirment les découvertes récentes selon lesquelles les TRM rénaux ne sont pas homogènes et ils peuvent être largement sous-catégorisés en deux sous-ensembles, à savoir, F4/80 plus plus
CD11b plus (CD169 plus plus ) TRM et F4/80 plus plus plus CD11b plus plus (CD169 plus ) TRM. En utilisant des souris CX3CR1gfp/gfp et CD169-DTR, nous avons conclu que CD169 plus plus TRM et CD169 plus TRM sont indispensables pour l'immunité systémique à Candida, où chaque sous-ensemble présente des fonctions différentielles dans l'immunité rénale à Candida. Plus précisément, CD169 plus TRM semble être vital pour contrôler l'excroissance rénale de C. albicans au stade ultérieur de l'infection, tandis que CD169 plus TRM semble être crucial dans la défense rénale de première ligne en limitant la croissance fongique au stade initial de l'infection. De même, l'absence de CD169 plus plus TRM a entraîné une nette réduction de la production de ROS dans les neutrophiles et l'IFN rénal. Des investigations supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les mécanismes de la fonction du CD169 rénal plus plus TRM dans le contrôle de la croissance fongique et de la production d'IFN.
Nos données ont montré que le rein est le principal organe cible où C. albicans persiste, ce qui est cohérent avec les rapports précédents qui indiquent l'importance de l'immunité rénale dans la candidose disséminée expérimentale et la mortalité subséquente des souris (Spellberg
et al, 2003 ; MacCallum & Odds, 2005 ; Lionakis et al, 2011 ; Navarathna et al, 2012, 2019 ; Hebecker et al, 2016). En particulier, malgré l'ablation des TRM dans tous les organes périphériques chez les souris CD 169- DTR, les reins sont restés le seul organe avec C. Albicans persistant, soulignant ainsi le rôle distinctif des TRM rénaux dans l'immunité systémique à Candida. Bien que le rein soit le principal organe cible, cela ne se reflète peut-être pas de manière cohérente chez les homologues humains, mais on pense toujours que l'immunité rénale fait partie intégrante de la résistance de l'hôte contre cette infection, car une infection rénale grave à Candida a été observée chez des patients immunodéprimés (Lionakis, 2014; Xu et Shinohara, 2017). La croissance incontrôlée de C. albicans dans les reins a déjà été attribuée au recrutement lent ou retardé de cellules myéloïdes innées (Lionakis et al, 2011). Cependant, dans notre modèle d'infection, nous avons observé une infiltration fonctionnelle de cellules immunitaires dans les reins de souris WT. De plus, CXCL1 et CCL2 dans les reins WT infectés ont été décrits comme étant détectables dès 12 h après l'infection, ce qui favorise le recrutement rapide de cellules myéloïdes innées (MacCallum et al, 2009). Il a également été rapporté que le recrutement de cellules immunitaires était régulé par les macrophages, les CD, les cellules épithéliales et endothéliales (Netea et al, 2002 ; Tuite et al, 2004 ; Tran et al, 2015). Plus précisément, il a été démontré que les macrophages recrutent des neutrophiles au stade précoce de l'infection via l'expression de CXCL2 (Kanayama et al, 2015 ; Xu & Shinohara, 2017). Néanmoins, les souris CD169-DTR présentaient un recrutement cellulaire similaire aux reins que celui des souris WT, ce qui suggère que l'orchestration de l'infiltration cellulaire n'est pas initiée ou assistée par CD169 plus plus TRM.
Récemment, Karasawa et al (2015) ont rapporté un petit sous-ensemble de monocytes rénaux Ly6Clo résidant dans le système vasculaire qui exprime CD169 (Karasawa et al, 2015) et, avec CD169 plus macrophages, jouent un rôle essentiel dans la prévention de l'inflammation excessive dans l'ischémie rénale. lésion de reperfusion. Des TRM associés aux vaisseaux ont également été décrits dans d'autres organes tels que l'intestin (Honda et al, 2020) et le tissu adipeux (Silva et al, 2019), où ils soutiennent le tonus et l'intégrité vasculaires (données non publiées) ; par conséquent, les monocytes/TRM associés aux vaisseaux pourraient potentiellement avoir un rôle similaire dans le rein et contribuer à la progression de la candidose systémique. La compréhension des macrophages rénaux a été limitée en raison du manque d'outils disponibles et de marqueurs phénotypiques pour délimiter ces phagocytes mononucléaires (Gottschalk & Kurts, 2015 ; Kurts et al, 2020). Malgré les tentatives de comprendre les macrophages rénaux par le biais d'études de traçage de lignée et de transcription (Hochheiser et al, 2013 ; Cao et al, 2015 ; Munoz et al, 2019 ; Liu et al, 2020 ; Salei et al, 2020), beaucoup moins a été connu pour les fonctions des sous-ensembles de TRM rénaux dans des contextes de maladies infectieuses. Bien que les macrophages rénaux se soient déjà révélés capables de limiter directement la croissance et l'invasion de C. albicans dans les tubules rénaux, nos données suggèrent que le sous-ensemble CD169 plus plus TRM ne participe pas à ces mécanismes de protection précoces (Marcil et al, 2002; Lionakis et al, 2013 ; Munoz et al, 2019). Au lieu de cela, les données des souris CX3CR1gfp/gfp suggèrent que le sous-ensemble CD169 plus TRM est la principale population effectrice pour fournir une défense rénale initiale contre l'agression de C. Albicans.
Les neutrophiles sont les cellules effectrices innées intégrales de l'immunité à Candida (Fulurija et al, 1996; Aratani et al, 1999; Netea et al, 2015), et les patients souffrant de neutropénie et d'anomalies des neutrophiles courent un risque plus élevé de candidose invasive (Lionakis & Netea, 2013). L'importance de la voie effectrice de la destruction oxydative est soulignée par les découvertes selon lesquelles la maladie granulomateuse chronique et le déficit en myéloperoxydase, où la production de ROS est défectueuse dans les neutrophiles, altèrent la destruction de C. albicans chez les patients et les souris (Aratani et al, 1999, 2002, Lehrer & Cline, 1969). De même, l'absence de CD169 plus plus de TRM qui a conduit à une réduction significative des ROS plus les neutrophiles, et étonnamment pas des monocytes, suggère que la croissance incontrôlée de C. Albicans rénal était probablement due à la capacité de destruction fongique réduite des neutrophiles.
CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE
L'importance de l'IFN dans la candidose systémique a été bien décrite dans un modèle murin expérimental, dans lequel la déficience en IFN chez les souris knock-out augmente leur sensibilité à cette infection (Balish et al, 1998 ; Cenci et al, 1998 ; Kaposzta et al, 1998). De plus, il a été démontré que l'administration d'IFN augmente la capacité phagocytaire et fongique des neutrophiles et des macrophages, ce qui à son tour améliore la résistance des patients contre la candidose invasive (Djeu et al, 1986; Malmvall & Follin, 1993; Marodi et al, 1993 ). Dans notre modèle de souris épuisant le TRM, nous avons systématiquement observé une régulation négative de l'IFN rénal en l'absence de CD169 plus plus TRM, ce qui suggère l'implication de CD169 plus plus TRM dans l'initiation ou le maintien de l'expression de l'IFN. Bien que le rôle protecteur de l'IFN dans la candidose disséminée soit évident, la réponse protectrice médiée par l'IL 17- dans ce modèle a été principalement controversée (Balish et al, 1998 ; Lavigne et al, 1998 ; MacCallum, 2009 ; Kashem et al, 2015 ; Mengesha & Conti, 2017). Néanmoins, l'immunité médiée par l'IL17-est connue pour être essentielle pour la candidose buccale et cutanée (Conti & Gaffen, 2010 ; Netea et al, 2015 ; Mengesha & Conti, 2017). Dans notre modèle, l'ablation de CD169 plus plus TRM n'a pas affecté le niveau d'expression de l'IL17. En fait, nous n'avons pas observé beaucoup d'expression d'IL17 dans les reins WT infectés (données non présentées). Semblable à nos observations, LeibundGut-Landmann et al (2007) ont signalé une quantité significativement plus élevée d'IFN que d'IL17 chez les souris WT infectées (LeibundGut-Landmann et al, 2007), indiquant que l'immunité médiée par l'IFN est plus prononcée dans la candidose systémique. Une autre étude qui a corroboré le rôle bénéfique de l'IFN dans l'immunité à Candida était la protection induite par le transfert adoptif de cellules Th1 productrices d'IFN, mais pas de cellules Th17 productrices d'IL17-, contre la candidose systémique (Kashem et al, 2015).
Comme première étape vers la découverte de la corrélation intrigante entre le CD169 plus le TRM, l'IFN et les neutrophiles, notre expérience pilote a cherché à révéler la source cellulaire de l'IFN dans notre modèle. Les cellules NK, étant les premières productrices d'IFN-, se sont avérées capables de reconnaître C. Albicans et de potentialiser la destruction fongique des neutrophiles par la sécrétion d'IFN et de GM-CSF (Bhatnagar et al, 2010; Bar et al, 2014; Voigt et al, 2014 ; Whitney et al, 2014 ; Dom´ınguez-Andres et al, 2017 ´ ). De plus, il a été démontré que 5 à 10 % des cellules NK produisent de l'IFN dans les reins infectés par Candida (Whitney et al, 2014). À notre grande surprise, nous n'avons pas observé d'IFN plus de cellules NK ni de régulation à la baisse de l'IFN en l'absence de cellules NK dans notre modèle. Cet écart observé pourrait être dû à l'évaluation des cellules productrices d' IFN à différents moments. Plus précisément, nous avons évalué la production d'IFN au jour 6 pi, un moment beaucoup plus tardif par rapport au groupe de Whitney, c'est-à-dire 16 h pi. Par conséquent, les cellules NK peuvent ne pas être impliquées dans le maintien de la production d'IFN pour cette infection. Fait intéressant, Murciano et al ont rapporté que les levures C. Albicans tuées inhibent la libération d'IFN par les cellules NK (Murciano et al, 2006). Une autre raison probable de l'écart pourrait être la méthode expérimentale utilisée pour étudier la sécrétion d'IFN. Dans cet article, la monésine, un inhibiteur de la sécrétion de protéines, a été administrée directement aux souris et la production d'IFN cellulaire a ensuite été évaluée sans incubation cellulaire ex vivo. En revanche, dans l'étude de Whitney et al (2014), avant l'IFN
analyses, les cellules rénales ont d'abord été préparées et incubées en culture avec un inhibiteur de la sécrétion de protéines pendant 7 h (Whitney et al, 2014). Étonnamment, d'autres sous-ensembles lymphoïdes et myéloïdes étudiés dans notre étude, en particulier CD169 plus plus TRM, ne semblent pas non plus exprimer l'IFN, malgré des études faisant état d'une sécrétion directe d'IFN par les macrophages (Bogdan & Schleicher, 2006). Au lieu de cela, nos données suggèrent que les principaux producteurs d'IFN sont limités à une population de cellules de type B. Curieusement, une sous-population similaire de cellules B innées produisant de l'IFN a été signalée comme étant vitale pour réguler et initier une réponse immunitaire innée précoce des infections bactériennes intracellulaires (Bao et al, 2014 ; Krocova et al, 2020). De plus, d'autres travaux antérieurs ont révélé que les cellules B matures, lorsqu'elles sont amorcées par des cellules T et stimulées par des agents pathogènes ou des ligands TLR, peuvent sécréter de l'IFN (Gray et al, 2007 ; Lund & Randall, 2010). Bien qu'il ne soit pas rare que l'axe lymphocytes B-IFN dans les infections microbiennes, des études futures soient nécessaires de toute urgence pour établir un profil complet de cette population de type IFN rénal plus lymphocytes B et identifier sa relation avec CD169 plus plus TRM dans le rein. En résumé, nous concluons que les TRM rénaux peuvent être sous-classés en deux populations principales en fonction de l'expression de CD169. Plus important encore, ces deux sous-ensembles abritent des fonctions protectrices non redondantes dans la candidose disséminée, qui donnent un aperçu de la base cellulaire de l'immunité innée protectrice de l'hôte contre C. Albicans. Ces révélations devraient être utiles dans la conception future des interventions thérapeutiques.
Matériaux et méthodes
SourisDes souris transgéniques CD169-DTR ont été générées dans notre laboratoire dans un fond génétique BALB/c comme décrit précédemment (Purnama et al, 2014), puis croisées avec C57BL/6 pendant 10 générations. Les souris CX3CR1gfp/gfp ont été achetées auprès du Jackson Laboratory. Des souris transgéniques CD169-DTR C57BL/6, ainsi que des souris WT C57BL/6, ont été élevées et maintenues dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques dans l'animalerie de l'Université technologique de Nanyang (NTU). Des souris mâles (âgées de 7 à 10 semaines) ont été utilisées pour l'infection à Candida. Toutes les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux sous le numéro ARF-SBS/NIE A-0380AZ.
Infection à C. albicansLa souche SC5314 de l'isolat clinique C. Albicans a été cultivée sur une plaque d'extrait de levure-peptone-dextrose (YPD) pendant 24 h à 30 degrés, suivie de 16 à 18 h dans un milieu YPD. La suspension de C. albicans a été centrifugée, lavée et comptée. Pour l'infection, 5 × 104 ufc de C. albicans ont été injectés par voie iv à chaque souris. Pour le traitement au rIFN, les souris infectées ont été traitées quotidiennement avec 10 000 U d'IFN recombinant (R&D Systems). Les souris ont été surveillées et pesées quotidiennement au cours de l'infection. La DT d'ablation à médiation par la toxine diphtérique et à médiation par les anticorps (10 ng/g de poids corporel) a été préparée dans du PBS additionné de 1 % de sérum de souris. Les souris CD169-DTR et WT ont été administrées par voie ip avec DT selon le schéma d'infection (Fig S1)
Pour l'épuisement des cellules NK, les souris ont reçu par voie ip 100 ug d'anticorps anti-NK1.1 de souris (PK136; Invivomab) par jour.
Analyses de la charge fongiqueLe cerveau, le cœur, les poumons, le foie, les reins et la rate ont été récoltés aux moments d'infection indiqués, pesés et hachés avant d'être incubés avec 1 mg/ml de collagénase D dans un milieu de digestion pendant 1 h à 37 degrés. Les échantillons ont été remis en suspension à plusieurs reprises jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'agrégats visibles. Une dilution en série a été réalisée et plaquée sur des plaques YPD. Les plaques ont été incubées pendant 48 h à 30 degrés. Les UFC ont été déterminées par comptage manuel des colonies. La charge fongique a été exprimée en UFC par gramme d'organe.
Collecte de tissus, traitement et isolement d'une suspension unicellulaireLes reins ont été récoltés, hachés et incubés avec 1 mg/ml de collagénase D dans un milieu de digestion pendant 1 h à 37 degrés. Les reins hachés ont été pipetés de haut en bas à plusieurs reprises jusqu'à ce qu'il n'y ait plus d'agrégats visibles. Après centrifugation à 330 g pendant 5 min, les culots cellulaires ont été remis en suspension avec 5 ml de Percoll à 35 % (GE Healthcare Life Science) et centrifugés à 600 g pendant 15 min. Les surnageants ont été jetés et les culots cellulaires ont été remis en suspension avec 5- ml de tampons de lyse RBC. Après la lyse, les suspensions cellulaires ont été centrifugées et remises en suspension avec IMDM 2 %. Les suspensions unicellulaires ont été stockées à 4 degrés jusqu'à leur utilisation ultérieure. Pour le comptage des cellules, de petites aliquotes de suspensions cellulaires, prémélangées avec du bleu trypan, ont été comptées à l'aide d'un hémocytomètre. Pour le tri cellulaire, des suspensions unicellulaires de rein ont été incubées avec du rat anti-souris CD16/32 (2.4G2, 1 mg/ml), suivi d'anticorps fluorescents FL contre les antigènes de surface de souris CD45 (30F11), F4/80 (BM8), et CD11b (M1/70). Les cellules colorées ont été lavées une fois et passées à travers un filtre 40-μm avant d'être triées sur un trieur de cellules 4-laser BD FACSAria II (BD Bioscience).
Analyses par cytométrie en flux Des suspensions unicellulaires ont été incubées avec du rat anti-souris CD16/32(2.4G2, 1 mg/ml) à 4 degrés pendant 15 min (1:100) dans du tampon FACS (PBS additionné de 2 % de FCS) pour bloquer les récepteurs Fc. Pour la coloration des antigènes de surface, les cellules ont été incubées avec des anticorps conjugués au fluorochrome contre les souris CD45 (30F11), F4/80 (BM8), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) et Ly6C (HK1.4) à 4 degré pendant 20 min. Les cellules colorées ont été lavées une fois et remises en suspension dans un tampon FACS pour l'acquisition sur un BD LSRFortesssa X-20 à cinq lasers (BD Biosciences). Pour la détection de la cytokine intracellulaire IFN , des suspensions unicellulaires de rein ont été préparées à partir de souris traitées avec de la monensine, un inhibiteur de la sécrétion de protéines, conformément au protocole (Sun et al, 2009). En bref, chaque souris a reçu une injection iv de 250 ul de PBS contenant 100 ug de monensine (M5273; Sigma-Aldrich), 5 h avant l'isolement d'organe et la préparation ultérieure de suspensions monocellulaires de rein. Les cellules ont été incubées avec un anticorps de rat anti-souris CD16/32 suivi d'une coloration avec des anticorps fluorescents contre l'antigène de surface de souris CD45 (30F11), CD11b (M1/70), F4/80 (BM8), Ly6G (1A8), Ly6C (HK1 .4), CD3ε (145-2C11), CD49b (HMa2), CD19 (1D3), CD4 (GK1.5), CD8 (53.6–7), CD11c (N418), MHCII (M5/114.15.2 ), et la chaîne légère lg κ (RMK-45). Les cellules colorées ont été lavées une fois avec un tampon FACS suivi d'une fixation (PFA à 2 %) et d'une perméabilisation (saponine à 0,05 %) avant d'être incubées avec un anticorps anti-IFN (1:500 ; BioLegend) dans une solution de saponine à 0,05 %. Les cellules colorées ont été lavées une fois et remises en suspension dans un tampon FACS pour l'acquisition sur un BD LSRFortesssa X-20 à cinq lasers (BD Bioscience). Pour la détection de la mort cellulaire et de l'apoptose, des suspensions unicellulaires de rein ont d'abord été incubées avec un anticorps anti-souris CD16/32 de rat, puis colorées avec des anticorps fluorescents contre l'antigène de surface CD45 (30F11), CD49b (HMa2), CD3ε ({{101 }}C11), CD11b (M1/70), Ly6G (1A8) et Ly6C (HK1.4). Les cellules colorées ont été lavées une fois avec un tampon FACS et un tampon de liaison à l'annexine V 1x (BioLegend) avant d'être incubées avec de l'annexine V conjuguée au FITC conformément aux instructions du fabricant (BioLegend). Les cellules colorées ont été lavées une fois et remises en suspension dans un tampon d'annexine V 1 × contenant de l'iodure de propidium (PI, 1 ug / ml) avant l'acquisition sur un BD LSRFortessa X -20 à cinq lasers (BD Bioscience).
Essai de détection de ROSLes suspensions unicellulaires ont été lavées et incubées avec 2,5 ug/ml de H2DFFDA, avec ou sans 100 ug/ml de zymosan, pendant 60 min à 4 degrés ou 37 degrés. Les cellules ont ensuite été lavées deux fois avec IMDM 2% et colorées avec des anticorps marqués au fluorochrome à 4 degrés pendant 20 min. Les cellules colorées ont été lavées et remises en suspension dans un tampon FACS contenant du PI pour l'acquisition sur un BD LSRFortessa X-20 à cinq lasers (BD Bioscience). Les données ont été normalisées sur la base des cellules correspondantes incubées à 4 degrés.
Créatinine sériqueDes sérums sanguins ont été prélevés sur des souris au jour 10 pi Les taux de créatinine sérique ont été quantifiés à l'aide du kit ELISA Cr (créatinine) de souris (Elabscience), conformément aux instructions du fabricant.
Dosage au bleu d'EvansLa perméabilité des vaisseaux sanguins a été évaluée conformément à Radu et Chernoff (2013). En bref, des souris WT et CD169-DTR non infectées et infectées ont reçu une injection intraveineuse de 200 ul de 0,5 % de bleu Evans/PBS. 30 min plus tard, les souris ont été euthanasiées et leurs organes ont été prélevés, pesés et incubés dans du formamide à 100 % dans des tubes de microcentrifugeuse pendant 48 h. Le formamide infusé de bleu Evans (0,5 ml) a été transféré dans des cuvettes jetables en polystyrène sans transférer aucun morceau de tissu. Les absorbances à 610 nm ont été enregistrées, et ces valeurs ont été normalisées par le poids des organes.
Analyses histologiquesPour la coloration par immunofluorescence, les reins récoltés ont été inclus dans un composé à température de coupe optimale (OCT Tissue Tek) et stockés à -80 degrés. Des sections de 6-µm ont été coupées et fixées dans de l'acétone pendant 10 à 15 min. Les sections ont été incubées avec le bloc Fc pendant 20 min, lavées et incubées avec des anticorps fluorescents FL pendant 1 h. Les sections lavées ont ensuite été montées avec un milieu de montage fluorescent DAKO FL. Les images ont été obtenues à l'aide d'un microscope Nikon Eclipse 80i à un grossissement d'objectif de 20 ×. Pour les colorations H & E et PAS, les souris abattues ont été perfusées avec 4% de PFA (Sigma-Aldrich). Les reins récoltés ont été incubés dans 4 % de PFA pendant 24 h à température ambiante, déshydratés et inclus dans de la paraffine (Paraplast Plus ; Leica). Les blocs inclus dans la paraffine ont ensuite été sectionnés en sections de 6- μm. Les coupes ont été déparaffinées dans du xylène pendant 20 min et réhydratées. Pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E), les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline en solution de Mayer modifiée (Abcam) et contre-colorées avec de l'éosine (Sigma-Aldrich). Après clarification au xylène, les coupes ont été montées avec du DPX Mountant (SigmaAldrich). Pour la coloration au PAS, les coupes ont été incubées avec une solution d'acide périodique (Abcam), lavées et colorées avec la solution de Schiff (Abcam). Après cela, les sections ont été contre-colorées avec de l'hématoxyline en solution de Mayer modifiée (Abcam). Après clarification avec du xylène, les coupes ont été montées avec un milieu de montage DPX (Sigma-Aldrich). Les images ont été obtenues à l'aide du microscope Eclipse 80i (Nikon) avec les logiciels Digital Sight DS-U3 (Nikon) et NIS-Elements D (Nikon) à des grossissements de 4 × 10 ×, 20 × et 100 ×.
PCR quantitative en temps réelLes reins récoltés ont été immédiatement homogénéisés dans du TRIzol (Thermo Fisher Scientific) à l'aide d'un homogénéisateur (CAT X360). Les ARN ont été extraits selon les instructions du fabricant (kit RNAsimple Total RNA ; Tiangen Biotech Ltd). La synthèse d'ADNc simple brin à partir de l'ARN purifié a été réalisée conformément aux instructions du fabricant (Promega M-MLV reverse transcriptase). La PCR en temps réel a été réalisée selon les instructions du fabricant en utilisant le protocole Primerdesign Precision FAST (Primerdesign Ltd). Les séquences d'amorce étaient les suivantes : CXCL1 ; Avant : ACTGCACCCAAACCGAAGTC, Rév. : TGGGGACACCTTTTAGCATCTT. CXCL2 ; Avant : ACAGAAGTCATAGCCACTCTC, Rév. : CCTTGCCTTTGTTCAGTATC. CCL2 ; Avant : CATCCACGGTTGTGCTCA, Rév. : GATCATTCTTGCTGGTGAATGAGT. TNF-; Avant : TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG, Rév. : GGTCTGGGCCATA GAACTGA. G-CSF; Avant : GTGCTGCTGGAGGCAGTTGT, Rév. : TCGGGATCCCCAGAGAGT. GM-CSF; Avant : GCATGTAGAGGCCATCAAAGA, Rév. : CGGGTCTGCACACATGTTA. M-CSF ; Avant : GGTGGAACTGCCAGTA TAGAAAG, Rév. : TCCCATATGTCTCCTTCCATAAA. IL10; Avant : CAGAGCCACATGCTCCTAGA, Rév. : TGTCCAGCTGGTCCTTTGTT. ICAM-1 ; Avant : AGTCCGCTGTGCTTTGAG, Rév. : AGGTCCAGCTCCACACT. VCAM-1 ; Avant : TCTTACCTGTGCGCTGTGAC, Rév. : ACTGGATCTTCAGGGAAT GAGT. KIMM-1 ; Avant : AGATACCTGGAGTAATCACACTGAAG, Rév. : TGA TAGCCACGGTGCTCA. CD169; Avant : GCTGATACTGGCTTCTACTTCT, Rév. : AGGTGGTCAGGTCTGGAGTAA. IFN-; Avant : CACGGCACAGTCATTGAAAG, Rév : CCAGTTCCTCCAGATATCCAAG. -actine; Avant : AAGGCCAACCGTGAAAAGAT, Rév. : CTGTGGTACGACCAGAGGCATACA. hHB-EGF; Avant : ATGACCACACAACCATCCTG, Rév. : CCAGCAGACAGACAG ATGACA