Étude des effets anti-âge du calcitriol sur les cellules tueuses naturelles humaines in vitro Ⅱ

3. Résultats

Cette étude s'est concentrée sur les effets anti-âge du calcitriol sur les cellules NK. Les résultats ont montré que le calcitriola diminué l'expression de biomarqueurs liés au vieillissement, y compris CD16, TIM3, PD-1, KIR etaugmenté l'expression de NKG2A des cellules NK. ça aussiinhibe la prolifération des cellules NKetles arrêter en phase G1. Calcitrioldiminution de la libération de facteurs inflammatoirestels que IL-5, IL-13, IFN- et TNF- et avaient certainseffets antioxydants, ce qui pourrait contribuer à saeffets anti-âge.

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3.1 Le calcitriol a inversé l'expression des marqueurs de vieillissement de surface, ralenti l'amplification des cellules NK et maintenu les cellules NK en phase G1.

Les cellules NK sénescentes ont montré une expression élevée de biomarqueurs liés au vieillissement, tels que CD16, PD -1, TIM3 et KIR, et une faible expression de NKG2A. Nous avons constaté que les niveaux d'expression des biomarqueurs liés au vieillissement NKG2A (Figure 1a) (*P <0.05) augmentaient, tandis que l'expression de CD16 (Figure 1b), TIM3 (Figure 1c ), PD-1 (Figure 1d) et KIR (Figure 1e) (*P < 0,05) ont diminué après un traitement au calcitriol pendant 72 h. Les effets d'inversion étaient positivement corrélés à la concentration de calcitriol (Figure 1 supplémentaire).

Nous avons multiplié les cellules des échantillons de sang périphérique humain in vitro. Ensuite, nous avons isolé les cellules NK (CD{{0}}CD56 plus) par tri par billes magnétiques (figure 1f). Les cellules NK triées ont ensuite été cultivées avec différentes concentrations de calcitriol ou de rapamycine pendant 72 h. Les résultats de la coloration CCK8 ont montré que le taux de croissance des cellules NK traitées au calcitriol à haute concentration (10− [7] M) était plus lent que celui du groupe témoin négatif (NC) (*P < {{17 }}.05) (Figure 1g). De plus, le calcitriol régularise le cycle des cellules NK. Après un traitement au calcitriol pendant 48 h, les cellules NK ont montré un déplacement dépendant de la concentration élevée de calcitriol vers la phase G1 (* P < 0, 05), tandis que la proportion de cellules en phase G2 (# P < 0, 05) a diminué. La proportion de cellules NK traitées au calcitriol dans la phase S n'a montré aucun changement, quelle que soit la concentration de calcitriol (Figure 1h, Figure supplémentaire 2). Nous avons ensuite testé si cet arrêt de phase G1 dérivé du calcitriol induisait l'apoptose des cellules NK et avons constaté que le biomarqueur apoptotique des cellules NK, l'immunoglobuline des cellules T et le domaine du motif inhibiteur à base de tyrosine immunorécepteur (ITIM) (TIGIT), ne présentait aucun changement significatif (P > 0,05 , N.-É.) (figure 1i). Ces résultats impliquaient que l'ajout de calcitriol réduisait le taux de croissance des cellules NK, diminuait leur prolifération et induisait l'arrêt de la phase G1 des cellules NK au lieu de provoquer l'apoptose.

3.2 Le calcitriol a diminué la libération de cytokines inflammatoires dans les cellules NK et inhibé la cytotoxicité des cellules NK

L'inflammation est une inflammation chronique de bas grade. Il accélère le vieillissement des cellules NK, car les cellules NK participent à cette inflammation chronique. La figure 2a montre que les niveaux d'IL-5, IL-13, IFN- et TNF- ont significativement diminué dans tous les groupes par rapport au témoin négatif (*P < 0.05). L'IFN- et le TNF- sont des cytokines pro-inflammatoires bien connues, mais certaines études ont également montré les propriétés pro-inflammatoires de l'IL-5. Il a été rapporté que l'IL-13 contribue à différents types d'inflammation des muqueuses, tels que l'asthme allergique, la colite ulcéreuse, l'œsophagite à éosinophiles et plusieurs maladies liées à la fibrose.

Cependant, la cytotoxicité des cellules NK implique principalement la libération de cytokines inflammatoires et la dégranulation des cellules. Nous avons marqué les cellules K562 avec DIO et co-cultivé les cellules DIO-K562 avec des cellules NK traitées au calcitriol pendant 4 h. Le pourcentage de cellules DIO plus PI plus était plus faible dans tous les groupes de rapport effecteur (E)/cible (T) que dans le témoin négatif (*P < 0.05) (Figure 2b, c). L'expression déduite du cluster de différenciation 107 (CD107) a indiqué une dégranulation plus faible (* P <0, 05) (Figure 2d). Ces résultats montrent l'inhibition de la fonction NK-killing par le calcitriol.

3.3 Le calcitriol a activé l'expression de SIRT1- ∆Exon8 et la voie SIRT1/pERK liée à l'anti-vieillissement

Pour étudier les effets anti-âge du calcitriol sur les cellules NK, nous avons détecté les voies de signalisation liées au vieillissement par immunotransfert. Une analyse Western blot a été réalisée pour évaluer les niveaux d'expression de VDR, SIRT1-∆Exon8, SIRT1 et PERK dans les cellules NK traitées au calcitriol. L'analyse statistique a montré que le calci triol activait l'axe VDR/SIRT1/pERK à des concentrations élevées. Pendant ce temps, le calcitriol a activé l'expression de SIRT1-∆Exon8 (*P < 0.05). (Figure 3a).

Figure 1. Phénotype lié au vieillissement, expansion cellulaire et analyse du cycle cellulaire des cellules NK. (ae) Les cellules NK humaines traitées avec du calcitriol ou de la rapamycine pendant 72 h ont montré les biomarqueurs cellulaires suivants : membre A du groupe 2 tueur naturel (NKG2A), cluster de différenciation 16 (CD16), immunoglobuline des lymphocytes T et protéine 3 contenant le domaine de la mucine ( TIM3) a programmé la mort cellulaire -1 (PD-1) et le récepteur tueur de type immunoglobuline (KIR), qui étaient liés au vieillissement. La rapamycine 50 nM (RAPA) a été utilisée comme contrôle positif. n=3 pour chaque groupe. *P < 0.05 et **P < 0.01 ont été comparés au groupe témoin négatif (NC). ( f ) Cellules NK (à droite) isolées à partir de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC, à gauche) par tri par billes magnétiques. ( g ) Analyse de la prolifération cellulaire mesurée par le kit de comptage cellulaire 8 (CCK8). ( h ) Effet du calcitriol ou de la rapamycine sur le cyce cellulaire dans les cellules nk triées après traitement pendant 72 h, wp 0.0, 0.05 et fp <0,05 ont indiqué le significatif différences dans les phases G1, S et G2, respectivement. Tous les groupes ont été comparés à NC, respectivement. n=3. ) Le pourcentage de lymphocytes T immunoglobulines et de cellules NK positives au domaine du motif inhibiteur (M) à base de tyrosine immunorécepteur après traitement au calcitriol ou à la rapamycine pendant 72 h. * p < 0, 05 et ** p < 0, 01 ont été comparés à NC. n=3.

3.4 Le calcitriol a résisté au vieillissement des cellules NK induit par le stress oxydatif in vitro

Il est largement admis que le vieillissement est causé par l'accumulation de dommages oxydatifs en raison du grand nombre de preuves trouvées au fil des ans [31]. Nous avons cultivé les cellules NK avec différentes concentrations de H2O2 pendant 24 h et avons constaté que 1{{1{{20}}}}0 μM était la concentration la plus proche de la dose létale médiane (DL50) (Figure 3b) . L'expression de TIM3 dans la population de cellules NK a augmenté par l'ajout de H2O2, tandis que l'expression a diminué après traitement au calcitriol (* P <0, 05) (Figure 3c). De plus, les cellules NK vieillissantes ont été colorées en bleu en présence de -galactosidase. Cette couleur bleue des cellules est une caractéristique spécifique des cellules sénescentes. L'analyse statistique a démontré que les cellules NK non traitées ont moins d'activité galactosidase cellulaire, tandis que les cellules NK exposées à H2O2 ont affiché une activité galactosidase élevée. Le calcitriol a réduit la population positive à la galactosidase, indiquant la présence de moins de cellules vieillissantes (* P <0, 05) (Figure 3d). Une diminution du potentiel membranaire mitochondrial a également été observée dans une variété de cellules vieillissantes de plusieurs espèces de mammifères. Nous avons évalué le potentiel membranaire mitochondrial des cellules NK dans cette étude. Les résultats statistiques ont montré que H2O2 diminuait significativement l'activité cellulaire des cellules NK par rapport à celle des cellules non traitées, tandis que le calcitriol augmentait les dommages causés par H2O2 (*P <0,05) (Figure 3e).

Figure 2. Effets du calcitriol sur les fonctions des cellules NK. ( a ) Analyse de la cytokine libérée par les cellules NK traitées au calcitriol en 48 h. b) Les résultats du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ont montré des cellules K562 mortes marquées par 3, 3 - octadécyl-oxacarbocyanineDlO) et de l'iodure de propidium (P). Les cellules K562 ont été co-cultivées avec différents ratios de cellules Nk traitées au calcitriol pendant 4h. (C) Analyse FACS des cellules K562 mortes dans des tests de destruction. ( d ) Les effets de dégranulation des cellules Nk traitées dans les tests de destruction. n=3 pour chaque groupe. *p < 0.05 et **p < 0,01 ont été comparés à NC

3.5 Le calcitriol a résisté à l'apoptose des cellules NK induite par le stress oxydatif in vitro

Ensuite, nous avons mesuré le nombre de cellules apoptotiques. Les résultats de la cytométrie en flux ont montré qu'un traitement avec 100 μM H2O2 pendant 24 h entraînait une apoptose significative des cellules NK. Cependant, le traitement au calcitriol a diminué le rapport apoptotique (* P <0, 05) (Figure 4a). Tous les résultats ci-dessus ont démontré la résistance du calcitriol contre le stress oxydatif causé par H2O2. Cependant, nous avons détecté des protéines apoptotiques dans les cellules NK sous stress oxydatif. Avant le traitement avec H2O2, du calcitriol 10− [7] M a été ajouté aux cellules NK pendant 24 h. Les niveaux de protéines liées à l'apoptose, caspase-3 p17 et caspase-3 p20, ont augmenté de manière significative après le traitement avec H2O2. Le calcitriol a diminué l'apoptose dérivée de H2O2- et a régulé à la baisse l'expression de la caspase-3, p17 et caspase-3 p20 (*P < 0,05) (Figure 4b). Ces résultats indiquent que le calcitriol résiste à l'apoptose induite par H2O2.

Figure 3. Leeffets anti-âgede calcitriol sur les cellules NK. ( a ) L'expression du récepteur de la vitamine D (VDR), de la sirtuine 1 (SIRT1), de la SIRT 1- ∆Exon8 et de la protéine kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (pERK) dans les cellules NK a été détectée par analyse Western blot après traitement au calcitriol pendant 48 h. La glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) a été utilisée comme contrôle de charge. Diagramme à barres illustrant les résultats du transfert Western (n=3). *P < 0.{{10}}5 et **P < 0.01 ont été comparés à NC (n=3). (b) Courbe dose-mortalité des cellules NK après traitement au peroxyde d'hydrogène (H2O2) pendant 24 h. ( c ) Pourcentage de cellules TIM3 présentant une expression élevée après traitement avec 100 μM H2O2 pendant 24 h. ( d ) Les résultats de la coloration et de l'analyse de la -galactosidase associée à la sénescence. Les cellules sénescentes ont été colorées en bleu et indiquées par des flèches rouges. Barre d'échelle, 50 μm. ( e ) Les cellules NK ont été colorées avec du Hoechst et de la chlorométhyl-X-rosamine (CMXRos) pour déterminer l'emplacement des cellules et le potentiel de la membrane mitochondriale. Les cellules vieillissantes et apoptotiques étaient Hoechst plus CMXRos- et indiquées par des flèches blanches. Barre d'échelle, 50 μm. L'analyse statistique a montré l'intensité de fluorescence relative. *P < 0,05 et **P < 0,01 ont été comparés au groupe H2O2 dans les figures C, D et E (n=3).

Figure 4. Les effets anti-apoptotique du calcitriol sur les cellules NK. (a) Effets anti-apoptotiques du calcitriol dans les lésions induites par H2O2-. L'analyse FACS a montré le pourcentage de cellules NK apoptotiques après traitement avec 100 μM H2O2 pendant 24 h. ( b ) Les niveaux d'expression de la caspase -3 p20 et de la caspase -3 p17 dans les cellules NK ont été détectés par analyse Western Blot après traitement avec 100 μM H2O2 pendant 24 h. GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. Diagramme à barres illustrant les résultats du transfert Western (n=3). *P < 0,05 a été comparé au groupe H2O2.

4. Discussion

L'interaction à long terme entre l'inflammation et le stress oxydatif est un facteur important du vieillissement. De plus, l'inflammation et le stress oxydatif sont synergiques [32]. L'excès de ROS généré par le stress oxydatif attaque les cellules du corps. Au cours de ce processus, des facteurs inflammatoires sont libérés par le système immunitaire activé pour tuer les cellules anormales, ce qui conduit à une nouvelle génération de ROS. Le manque de calcitriol peut provoquer des maladies auto-immunes, des maladies métaboliques chroniques et des tumeurs. Cependant, on sait peu de choses sur les effets anti-âge du calcitriol sur le système immunitaire, en particulier sur les cellules NK.

Dans cette étude, nous avons étudié les effets anti-âge du calcitriol sur les cellules NK. Nous avons constaté que le calcitriol augmentait l'expression de NKG2A, tout en diminuant l'expression de KIR in vitro. La sous-population CD56−CD16 plus des cellules NK, dont on sait qu'elle est liée à l'inflammation chronique, est significativement augmentée chez les personnes âgées [33]. Par conséquent, la réduction de l'expression de CD16 induite par le calcitriol pourrait être attribuée à son effet anti-inflammatoire. TIM-3 et PD-1 ont été signalés comme étant les récepteurs inhibiteurs et de déplétion des cellules NK. Notre étude a montré que le cal citriol réduisait à la baisse les niveaux d'expression de TIM-3 et PD-1 et empêchait l'apoptose des cellules NK.

De plus, le calcitriol a inhibé l'expansion des cellules NK et maintenu la population de cellules NK en phase G1 in vitro. Cependant, les cellules en phase S ne sont pas affectées. Le TIGIT, qui est connu comme un facteur de contrôle des cellules NK, est resté inchangé. Ces résultats indiquent que la Figure 4. Les effets anti-apoptotique du calcitriol sur les cellules NK. (a) Effets anti-apoptotiques du calcitriol dans les lésions induites par H2O2-. L'analyse FACS a montré le pourcentage de cellules NK apoptotiques après traitement avec 100 μM H2O2 pendant 24 h. ( b ) Les niveaux d'expression de la caspase -3 p20 et de la caspase -3 p17 dans les cellules NK ont été détectés par analyse Western blot après traitement avec 100 μM H2O2 pendant 24 h. GAPDH a été utilisé comme contrôle de charge. Diagramme à barres illustrant les résultats du transfert Western (n=3). *P < 0,05 a été comparé au groupe H2O2. Le calcitriol BIOINGÉNIÉ 6851 n'a pas entraîné la mort des cellules NK, mais il a seulement ralenti le taux d'expansion des cellules NK.

Il est bien connu que l'inflammation conduit à l'immunosénescence [34,35]. De plus, nous avons constaté que le calcitriol réduisait les niveaux d'IL-5, IL-13, IFN- et TNF- dans les cellules NK. La cytotoxicité des cellules NK est en partie médiée par la libération de facteurs inflammatoires [36]. De plus, il y avait une diminution de la mortalité des cellules tumorales K562 et de la dégranulation des cellules NK. Ces résultats sont conformes à nos attentes. La rapamycine est un médicament bien connu qui réduit le taux métabolique pour prévenir le vieillissement[37] qui est utilisé comme contrôle positif dans cette étude. Elle entraîne une immunosuppression et augmente le risque potentiel de tumeur et de charge tumorale. Ce fardeau a été confirmé dans des modèles murins de cancer du sein [38]. On ne sait pas si le calcitriol présente des effets similaires à la rapamycine. D'autres études animales et cliniques devraient être réalisées pour vérifier leurs effets sur le corps humain.

Enfin, nous avons étudié les effets du calcitriol sur la sénescence antioxydante. Le resvératrol, un médicament anti-âge bien connu, peut réguler négativement la voie NF-κB en activant l'axe SIRT1/PERK. Cette régulation à la baisse s'est également avérée bénéfique dans les troubles neurodégénératifs et les maladies cardiovasculaires [39]. La désacétylation de SIRT1 est associée au contrôle métabolique et à la biogenèse mitochondriale. Dans ce type de régulation, des niveaux élevés de SIRT1 peuvent favoriser l'accumulation de coactivateur gamma -1 alpha (PGC-1) du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes (PGC-1) dans le noyau, ce qui entraîne la transcription de gènes nécessaires à la fonction mitochondriale [40]. En outre, SIRT1 supprime la cible mammifère de la voie de signalisation de la rapamycine (mTOR), qui peut protéger les nerfs et résister au vieillissement cérébral chez la souris [41]. Dans cette étude, nous avons identifié une voie de régulation similaire pour le calcitriol. Le calcitriol a activé SIRT1 via VDR et a augmenté l'axe SIRT1/pERK.

De plus, nous avons constaté que le calcitriol régulait à la hausse l'expression de SIRT1-∆Exon8. Les contraintes sont connues comme un facteur de régulation à la hausse de SIRT1-∆Exon8. Bien que SIRT1-∆Exon8 lui-même affiche une activité de désacétylation réduite de p53, il exerce un effet de désacétylation additif sur p53 lorsqu'il est exprimé avec SIRT1 pleine longueur [42]. Cet effet indique la fonction anti-apoptotique du calcitriol sur les cellules NK. Cependant, le rôle de SIRT1-∆Exon8 dans les voies liées à l'âge reste à mieux comprendre. Étant donné que le déclin de SIRT1 pourrait être dû à des dommages oxydatifs [43], nous avons établi un modèle de cellules NK vieillissantes in vitro en utilisant H2O2. Le vieillissement oxydatif induit par H2O2 a augmenté l'expression de TIM3 ainsi que l'activité de la -galactosidase dans les cellules NK. Nous avons constaté que le calcitriol résistait aux dommages oxydatifs et maintenait l'activité mitochondriale et la viabilité cellulaire des cellules NK tout en empêchant l'apoptose cellulaire. Cependant, le calcitriol n'a pas encore été identifié comme un médicament anti-âge en médecine clinique, car des preuves supplémentaires sont nécessaires concernant les effets anti-âge de ce médicament in vivo. En résumé, nous avons fourni des preuves préliminaires pour impliquer les effets anti-âge du calcitriol sur les cellules NK in vitro. Nous pensons que les effets de ce médicament devraient être explorés plus avant dans de futures études animales et cliniques.

5. Conclusion

Dans cette étude, nous avons démontré laeffets anti-âgede calcitriol sur les cellules NK. Le calcitriol a inversé l'expression debiomarqueurs du vieillissementsur les cellules NK. Il a ralenti l'amplification des NK et les a maintenus en phase G1. De plus, le calcitriol a inhibé la libération de cytokines inflammatoires et la dégranulation régulée à la baisse des cellules NK. L'activation de l'axe SIRT1-∆Exon8 et VDR/ SIRT1/pERK par le calcitriol pourrait être le principal mécanisme de l'effet anti-âge du calcitriol basé sur tout ce qui précède. Enfin, le calcitriol a résisté à la sénescence oxydative des cellules NK in vitro. D'autres études devraient se concentrer sur la recherche animale et clinique.

Points forts

(1) Le calcitriol a diminué l'expression de biomarqueurs liés au vieillissement, notamment CD16, TIM3, PD-1, KIR, et a augmenté l'expression de NKG2A des cellules NK. (2) Le calcitriol a été capable d'inhiber la prolifération des cellules NK et de les arrêter en phase G1. (3) Le calcitriol a diminué la libération des principaux facteurs inflammatoires tels que IL-5, IL-13, IFN- et TNF- des cellules NK.(4) L'effet anti-âge du calcitriol sur les cellules NK peut être atteint par la voie du signal Sirt1- pERK.

Remerciements Nous tenons à remercier tous les membres du personnel de notre groupe pour leur soutien et le Comité d'innovation scientifique et technologique de Shenzhen pour leur soutien financier à cette étude.

Financement Ce travail a été soutenu financièrement par le Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (JCYJ20170412155231633), le Shenzhen Key Medical Discipline Construction Fund (No. SZXK062), Chengdu Wecistanche Biotech et le Sanming Project of Medicine à Shenzhen (No. SZSM202011010) ; Comité d'innovation scientifique et technologique de Shenzhen [JCYJ20170412155231633] ; Fonds de construction de la discipline médicale clé de Shenzhen [No. SZXK062] ; Projet Sanming de médecine à Shenzhen [No. SZSM202011010].

Approbation éthique Toutes les procédures ont été approuvées par le comité d'éthique de l'hôpital populaire de Shenzhen Luohu (ZLNK 12/2019, Shenzhen, Chine). Un consentement éclairé a été obtenu pour l'expérimentation avec des échantillons humains.

Déclaration de divulgation Tous les auteurs ont approuvé la soumission de ce manuscrit. Les auteurs déclarent qu'ils n'ont pas d'intérêts financiers concurrents ou de relations personnelles connus qui auraient pu influencer le travail rapporté dans cet article.

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