Étude sur les effets thérapeutiques et les mécanismes de l'extrait de Cistanche Deserticola sur la sarcopénie induite par la dexaméthasone chez la souris

Abstrait:Cette étude a exploré leseffet thérapeutique de l'extrait de Cistanche deserticola (CdE)sur la sarcopénie induite par la dexaméthasone (Dex) chez la souris et le mécanisme d'action possible. Premièrement, les composants pharmacodynamiques et les cibles importantes du Cistanche ont été étudiés par pharmacologie en réseau, et les voies ont été enrichies pour prédire le mécanisme d'action du CdE. Lors d'expérimentations animales, 50 souris KM ont été divisées au hasard en 5 groupes (groupe témoin, groupe modèle Dex, groupe à dose élevée de CdE, groupe à dose moyenne de CdE et groupe à faible dose de CdE). À l'exception du groupe témoin, les autres groupes ont reçu une injection sous-cutanée pour induire une sarcopénie après 42 jours, et les trois groupes de traitement ont reçu simultanément différentes doses de CdE par voie orale. Au cours de l’expérience, le poids des animaux, leur capacité d’exercice et leur composition corporelle ont été régulièrement testés. Après le sacrifice des animaux, le coefficient musculaire des membres postérieurs a été calculé et des tests histologiques et d'expression génique associés ont été effectués. Les résultats de pharmacologie de réseau montrent que le CdE peut traiter la sarcopénie en régulant positivement les voies de signalisation liées à IGF-1. Les résultats des expérimentations animales montrent que le CdE inverse de manière significative la diminution de la teneur en viande maigre et du coefficient musculaire provoquée par le Dex, améliore la capacité d'exercice, réduit la teneur en graisse, améliore l'état histologique des muscles, régule positivement IGF-1, MyoD et MyoG et régule négativement l'expression d'Atrogin-1 et MuRF-1. Le CdE a un effet thérapeutique sur l'atrophie musculaire induite par le Dex et peut améliorer la morphologie histologique musculaire, et son mécanisme d'action peut être l'activation de la voie de signalisation IGF-1.

Mots-clés : Extrait de Cistanche deserticola; la dexaméthasone; sarcopénie; pharmacologie de réseau ; IGF-1 chemin

 

 

bénéfice de l'échinacoside

 

1. Matériels et méthodes

1.1 Réactifs

Les réactifs suivants ont été utilisés dans cette étude :

Injection de phosphate de sodium de dexaméthasone(Numéro de lot . 040191147) – Shanxi Ruicheng Kelong Veterinary Medicine Co., Ltd.

Solution saline normale(Lot n° L220092407) – Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.

Éthanol anhydre, xylène, paraformaldéhyde, etglutaraldéhyde– Groupe pharmaceutique national chinois

Acide chlorhydrique(CAS : 7647-01-0) – Chengdu Kelon Chemicals Co., Ltd.

Solution de coloration à l'hématoxyline– Wuhan Servicebio Biological Technology Co., Ltd.

Solution de colorant à l'éosine– Hefei Bomei Biological Technology Co., Ltd.

Kit d'encastrement en résine époxy 812, acétate d'uranyle– Société SPI

Kit d'extraction d'ARN Molpure®, Kit PrimeScript RT, Prémélange TB Green™ Ex Taq™ II– YEASEN Biotechnology et Takara Biomedical Technology Co., Ltd.

3 principes actifs de la cistanche

 

1.2 Instruments

Principaux équipements utilisés :

NK-10 jauge push-pull analogique– Wenzhou Weidu Instrument Co., Ltd.

Analyseur de composition corporelle QMR06-060H– Société Niumag

Microscope trinoculaire numérique BA 210– Groupe Motic

JEM-1400 Microscope électronique à transmission FLASH– JEOL, Japon

Système PCR en temps réel QuantStudio™ 3– ThermoFisher Scientifique

 

1.3 Analyse pharmacologique en réseau

Étudier les composés actifs et les mécanismes potentiels deCistanche tubuleusedans le traitement desarcopénie, a pharmacologie de réseauapproche a été utilisée :

Composés actifsdeCistanche tubuleuseont été examinés à l'aide duBase de données pharmacologiques des systèmes de médecine traditionnelle chinoise (TCMSP), avec des seuils de :

Biodisponibilité orale (OB) supérieure ou égale à 30 %

Ressemblance au médicament (DL) Supérieur ou égal à 0,18

Composé supplémentaire etinformations sur la ciblea été récupéré de :

PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)

SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch)

Gènes liés à la maladie de la sarcopénieont été obtenus à partir de :

DisGeNET(http://www.disgenet.org)

Cartes génétiques(https://www.genecards.org)

Analyse des interactions protéine-protéine (IPP)a été réalisée via leBase de données STRING(https://string-db.org).

A réseau d'interaction composé-cible-gènea été construit en utilisantCytoscape 3.2.1.

Enrichissement fonctionnela été réalisée en utilisant :

DAVID(https://david.ncifcrf.gov) pourOntologie des gènes (GO)

KEGG(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) pour l'analyse des voies

Les résultats ont été visualisés viaOutil en ligne de bioinformatique(https://www.bioinformatics.com.cn/)

cistanche tubuleuse

1.4 Préparation deCistanche tubuleuseExtrait (CdE)

LeCistanche tubuleusel'extrait a été préparé comme suit :

Des tranches d'herbes brutes (lot n° Y221217) ont été achetées auprès dePièces de décoction MTC du Sichuan Co., Ltd., et authentifié par le professeur Yang Wenyu de l'Université de Xihua.

1 kg de séchéCistanche tubuleusea été pulvérisé et passé dans untamis de 40 mailles.

A Rapport matériau/liquide 1:20a été utilisé avecSolution éthanol-eau à 50 %.

Le mélange étaittrempé pendant 30 min, suivi deextraction par ultrasonsà55 degrés, 250 W, pour40 min.

Des extraits ont étécentrifugé, filtré et concentré sous pression réduiteà 60 degrés jusqu'à obtenir une pâte épaisse (densité 1,2) à l'aide d'un évaporateur rotatif.

L'extrait concentré a étélyophilisé sous vide, ce qui donne une finaleefficacité d'extraction de 40%.

 

1.5 Conception expérimentale sur les animaux

Un total de50 souris KM mâles de qualité SPF, âgé de 6 semaines et pesant(22 ± 2) g, ont été utilisés dans cette étude (Animal License No.SCXK [Chuan] 2023-030). Toutes les procédures animales ont suivi lesRèglement sur l'administration des animaux de laboratoiredélivré par le ministère de la Science et de la Technologie de la République populaire de Chine et ont étéapprouvé par le comité d'éthique animale de l'université de Xihua(N° d'approbation : XH-2023-02-01).

Conditions de logement :Température (26 ± 1 degrés), humidité (50 ± 10 %), cycle lumière/obscurité de 12 h, libre accès à la nourriture et à l'eau.

Après 7 jours d'acclimatation, les souris ont étérépartis au hasard en 5 groupesen fonction du poids corporel.

Le poids corporel a été enregistré quotidiennement et les conditions de santé générales telles que le comportement, l'état de la fourrure et la consommation alimentaire ont été surveillées.

Groupes de traitement et posologiessont détaillés dansTableau 1.

Surjours 40 à 42, tests de fonction motrice(force de préhension et natation) ont été réalisées.

Surjour 43, après 12 heures de jeûne, le poids corporel et la composition corporelle ont été enregistrés. Les souris ont ensuite été anesthésiées à l'éther et sacrifiées. Les muscles squelettiques bilatéraux des membres postérieurs ont été rapidement disséqués et pesés.

Legastrocnémien gauchea été coupé longitudinalement et fixé dans3% de glutaraldéhydeet4% de paraformaldéhyde, respectivement.

Legastrocnémien droita été gelé à −80 degrés pendantanalyse qPCR.

Mots-clés SEO :modèle animal de sarcopénie, souris KM, expérience d'atrophie musculaire, évaluation de la fonction musculaire, recherche animale éthique

avantages de l'actéoside

1.6 Mesure de la composition corporelle et de l’indice musculaire

Poids corporela été enregistré quotidiennement tout au long de l’expérience.

Avant le sacrifice,composition corporelle(masse maigre et masse grasse) a été mesuréedeux fois, et levaleur moyennea été enregistré.

Après le sacrifice,muscle squelettique du membre postérieura été pesé.

Leindice de masse musculairea été calculé à l'aide deFormule Cuadros [11]:

Indice musculaire (%)=Masse musculaire/Poids corporel × 100
(Équation 1)

Mots-clés SEO :masse maigre chez la souris, calcul de l'indice musculaire, analyseur de composition corporelle, biomarqueurs de la sarcopénie

 

1.7 Tests de fonctionnement du moteur

Pour évaluerfonction musculaire, les tests suivants ont été réalisés entre les jours 40 et 42 :

Test de natation :

Chaque souris étaitpesé, et uncharge (5% du poids corporel dans une feuille de plomb)était fixé au tiers distal de la queue.

Les souris ont été placées dans unrécipient avec de l'eau à 25 degrés, à une profondeur supérieure ou égale à 30 cm.

Temps de baignadea été enregistré depuis l'entrée jusqu'à ce que la souris ne puisse plus flotter et commence à couler.

Chaque souris a été testée une fois par jour pour3 jours consécutifs, et lemoyennea été considéré comme le résultat final.

Test de force de préhension :

Réalisé à l'aide d'unjauge push-pull manuelle.

Chaque souris a été testéecinq fois, avec un150 secondes de reposentre les épreuves.

Lecoefficient de force de préhensiona été calculé pour normaliser le poids corporel :

Coefficient de force de préhension = Force de préhension/poids corporel (N/kg)
(Équation 2)

Mots-clés SEO :test d'endurance en natation, force de préhension chez les rongeurs, mesures de performance musculaire, modèle de souris sarcopénie

 

1.8 Analyse histologique

Pour évaluer lechangements morphologiques dans le tissu musculaireaprès un traitement avecCistanche tubuleuseextrait (CdE) :

Coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E)a été réalisée sur des tissus fixés dans4% de paraformaldéhyde.

Les coupes ont été observées sous unmicroscope optique, etsurface transversale des fibres musculairesa été analysé à l'aideImageJlogiciel.

Pouranalyse ultrastructurale, muscles fixés dans3% de glutaraldéhydeont été post-fixés dans1% de tétroxyde d'osmium, déshydraté dans l'acétone et incorporé dansRésine Ep812.

Sections semi-finesétaient tachés debleu de toluidine for positioning.

Sections ultra finesétaient tachés deacétate d'uranyle et citrate de plomb, et observé avec unMicroscope électronique à transmission JEM-1400FLASH.

Largeur des fibres musculairesa été mesuré à l’aide d’ImageJ.

Mots-clés SEO :histologie des muscles squelettiques, protocole de coloration HE, microscopie électronique dans la recherche musculaire, analyse de la morphologie des fibres musculaires

liste des avantages de la cistanche

1.9 Analyse de l'expression génétique

Pour enquêter surmécanismes moléculairesde CdE dans la sarcopénie :

Tissus musculaires gelésont été mécaniquement rompus sous azote liquide.

L'ARN total a été extrait en utilisantRéactif TRIpureselon les instructions du fabricant.

L'ADNc a été synthétisé avec unkit de transcription inverse, etqPCRa été réalisée à l'aide d'unThermo Scientific PikoRealsystème.

GAPDHa été utilisé comme gène de référence interne.

Séquences d'amorces pourgènes liés aux musclessont répertoriés dansTableau 2.

Mots-clés SEO :qPCR pour les gènes de l'atrophie musculaire, gène de référence GAPDH, extraction d'ARN du muscle, expression génique dans la sarcopénie

 

1.10 Analyse statistique

Les données expérimentales ont été analysées à l'aideANOVA unidirectionnelle, suivi deTest de comparaison multiple de Dunnett.

A Valeur P < 0,05a été considérée comme statistiquement significative.

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées à l'aideSPSS23.0.

Données histomorphométriquesont été analysés à l'aideImageJlogiciel.

Mots-clés SEO :analyse statistique dans les études pharmacologiques, SPSS dans la recherche biomédicale, ANOVA dans les études animales, analyse musculaire ImageJ