Suppression des lésions rénales associées à l'inflammation après la greffe à l'aide du nouveau capteur de radicaux libres PrC-210 chez le rat
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2,Maya M. Coumbe Gitter3et William E. Fahl1,3,*
Résumé:
Allogreffeun reintransplantation, qui déclenche le rejet de la cellule hôte et des anticorps duun rein, est un contributeur majeur aux lésions rénales lors de la transplantation. Ici, nous avons demandé si la PRC-210 supprimerait les dommages observés dans les greffes de rein par allogreffe. Des reins de rat brun de Norvège (BN) ont été perfusés in situ (solution UW) avec ou sans ajout de 30 mM de PrC -210, puis immédiatement transplantés chez des rats Lewis (LEW). 20 h plus tard, les reins BN transplantés et le plasma de rat LEW ont été analysés.Un reinl'histologie et les niveaux rénaux/sériques de plusieurs cytokines associées à l'inflammation ont été mesurés pour évaluer la pathologie rénale liée à l'inadéquation et l'efficacité protectrice de la PrC-210. Vingt heures après les greffes d'allogreffe : (i) des lésions histologiques importantes des tubules rénaux et une infiltration de cellules inflammatoires mononucléaires ont été observées dans les reins d'allogreffe ; (ii)un reinles mesures de la fonction (créatinine et BUN) étaient significativement élevées ; (iii) des changements significatifs dans les cytokines clés, c'est-à-dire le TIMP-1, le TNF-alpha et le MIP-3A/CCL20, et les taux de caspase activée par le rein ont été observés. Dans les reins et les rats receveurs traités par PRC-210-, (i) les lésions histologiques rénales (scores de Banff) et l'infiltration mononucléaire ont été réduites à des niveaux de fond non traités ; (ii) la créatinine et l'azote uréique ont été significativement réduits ; et (iii) les changements de caspase et de cytokine activées ont été significativement réduits, certains à l'arrière-plan. En conclusion, les résultats suggèrent que la PrC-210 pourrait fournir une protection d'organe largement applicable pour de nombreuses conditions de transplantation d'allogreffe ; il pourrait protéger les reins transplantés pendant et après toutes les étapes du processus de transplantation - du don d'organe, au transport, à la réimplantation et à l'inflammation postopératoire - afin de minimiser le rejet aigu et chronique.
Khéwordès: un reinallogreffe; rejet de rein; ischémie
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1. Introduction
L'insuffisance rénale terminale provoque plus de 1,2 million de décès par an dans le monde [1].Un reinLa transplantation est le traitement de choix pour les patients atteints d'insuffisance rénale terminale. Plus de 90 000 greffes de rein sont réalisées chaque année dans le monde.
Le processus de greffe, lui-même, induit des lésions cellulaires et organiques importantes au niveau duun rein, ce qui réduit la survie à long terme de l'organe. Les trois principales atteintes à un rein lors d'une greffe d'allogreffe sont (i) les dommages induits par les espèces réactives de l'oxygène et de l'azote (ROS et RNS) pendant l'ischémie froide (« stockage à froid) [2] », (ii) les dommages induits par les ROS lors de l'implantation (« lésion de re-perfusion ») [3], et (iii) l'inflammation post-allogreffe-transplantation, qui déclenche la réponse immunitaire innée et le rejet médié par les anticorps (ABMR) [4].
Les neutrophiles et les macrophages migrent dans le greffon endommagé dans les 6 h suivant la reperfusion et stimulent la synthèse des chimiokines dans les cellules dendritiques résidentes qui activent ensuite les lymphocytes T et recrutent des cellules immunitaires adaptatives. Une fois que ces cellules immunitaires infiltrent les cellules épithéliales du tubule proximal, elles produisent de la myéloperoxydase dans les neutrophiles et de la nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) oxydase dans les macrophages, qui contribuent toutes deux à la production locale de radicaux libres. Ces processus inflammatoires conduisent à une activation de la voie du complément et à un remodelage et une lyse cellulaires supplémentaires dans leun reinallogreffe [5]. L'ABMR peut résulter de l'un ou des deux allo-anticorps préformés contre la greffe ou du développement de novo d'un anticorps spécifique du donneur (dnDSA) [5–7]. La réponse inflammatoire aiguë (min/jours), passant à chronique (jours/semaines) dans l'allogreffe rénale, avec production continue de ROS et de cytokines inflammatoires, peut établir une réponse sévère et auto-entretenue qui provoqueun reindéfaillance d'organe.
Pour mieux comprendre les voies cellulaires et moléculaires impliquées dans la pathogenèse deun reininflammation et rejet d'allogreffe, nous avons développé et caractérisé un modèle de rat qui reproduit la plupart des critères cliniques de la réponse immunitaire innée, de l'ABMR et de la perte d'organes rénaux [8]. Ce modèle a été utilisé pour évaluer un certain nombre de nouvelles stratégies de greffe post-allogreffe.
Les deux approches actuellement reconnues pour réduire la réponse immunitaire aiguë et à long terme contre leun reinl'allogreffe sont : (i) d'augmenter les chances de trouver un donneur compatible, et (ii) d'éliminer les anticorps préexistants contre leun reinallogreffe en utilisant des protocoles de désensibilisation [9,10].
Dans le travail décrit dans ce manuscrit, nous avons demandé si une troisième approche pour supprimer la sévérité de l'inflammation aiguë et à plus long terme serait bénéfique. Nous avons administré le piégeur de radicaux libres à action immédiate, PRC-210, à la fois à l'allogreffe implantéeun reinet au rat receveur, pour déterminer si les dommages ROS associés à l'inflammation peuvent être supprimés. Bien que le concept de suppression des ROSin associés à l'inflammationun reinla greffe n'est pas nouvelle, l'utilisation ici du nouveau PRC-210 ROSscavenger à action immédiate l'est. Évacuation et inactivation immédiates et chroniques des radicaux libres générateurs d'inflammation et générés dans l'allogreffe nouvellement transplantéeun reinwould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95 % de dommages à l'ADN chez les témoins non protégés [16]. Dans deux études antérieures sur la transplantation rénale de rongeurs [16, 17], il a été démontré que la PRC -210 supprime les lésions rénales induites par les ROS induites pendant (i) 30 h de stockage au froid [17] et (ii) les lésions de reperfusion lors de l'implantation [16 ] aux niveaux de fond, éliminant ainsi deux sources importantes de lésions des reins transplantés. Il a également été démontré que la molécule PRC-210 supprime les lésions induites par les radicaux libres dans plusieurs autres paramètres d'organes [15,18]. Ainsi, nous avons émis l'hypothèse que PrC-210 devrait également être capable de protéger une allogreffe contre le stress oxydatif généré par les processus de rejet (i) cellulaires et (ii) médiés par les anticorps qui produisent des radicaux libres comme sous-produit.
Pour explorer cette hypothèse, nous avons développé un nouveau modèle de rat qui évitait l'induction d'événements ischémiques et de reperfusion majeurs et administrait la PrC-210 à la fois avant et après l'implantation. Les reins de rats bruns ont été rincés avec une solution UW contenant PrC-210 et immédiatement transplantés dans des receveurs syngéniques de rats Lewis. Le temps d'ischémie froide a été pratiquement éliminé. Immédiatement l'implantation suivante, et pendant 8 h aprèsun reinimplant, les rats receveurs ont reçu des injections systémiques de PrC-210 à des doses qui permettraient une élimination continue des radicaux libres dans l'implant transplantéun rein. Les reins et le plasma sanguin transplantés ont ensuite été récoltés 20 h après la transplantation pour permettre la mesure de la PrC -210- conférée (i) suppression des sous-produits inflammatoires et (ii)un reinprotection.
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2. Matériels et méthodes
2.1. Animaux
Des rats Lewis et BN mâles adultes (200–250 g) ont été achetés chez Envigo (Indian-napolis, IN, USA) et hébergés dans l'animalerie de l'Université du Wisconsin à Madison, WI, USA. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux politiques de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Wisconsin. L'entretien de la santé des animaux, y compris les décès d'animaux, la température ambiante, les cycles lumière/obscurité de 12 h et le nettoyage des cages, entre autres tâches d'hygiène, ont été effectués quotidiennement par le personnel de soins aux animaux. La nourriture et l'eau étaient disponibles à volonté. Cette recherche a été approuvée de manière prospective par la School of Medicine and Public Health Institutional Animal Care and Use Committee de l'Université du Wisconsin (Animal Protocol #M005204). Tous les groupes contenaient 4 à 6 animaux.
2.2. Matériaux
La synthèse de l'aminothiol PrC-210 HCl, une molécule préclinique, a été décrite séparément [19,20]. Les cristaux de PrC-210 HCl (3-(methylamino)-2-(methyl monomethyl)propane-1- thiol) sont stockés sous atmosphère d'azote à −20 ◦C, et même avec la routine Après décongélation, utilisation et réentreposage, la PrC -210 cristalline est complètement stable pendant plus de 4 ans par analyse par spectrométrie de masse. D'autres réactifs chimiques ont été obtenus auprès de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA). La solution de préservation d'organes UW a été achetée auprès de Bridge to Life, Columbia, SC, États-Unis.
2.3. Procédure chirurgicale et expérimentale
La procédure de transplantation utilisée dans ces expériences est illustrée à la figure 1. Chez le rat donneur de BN, après double ligature de l'aorte, ligature de l'artère et de la veine rénales droites, et section chirurgicale de la veine rénale gauche, le rat gaucheun reina été perfusé in situ en utilisant 5 ml de solution UW à température ambiante (sur une période de 15 s). Le perfusat était soit une solution UW seule (pour les groupes "0 h" et "20 h sans traitement"), soit une solution UW avec PrC cristallin -210, pour atteindre 30 mM [17], avait été ajouté, dissous immédiatement, puis ajusté au pH de la solution UW de départ de 7,4 en ajoutant 0,0619 µL de NaOH 5N par µmol de sel de PrC-210 HCL (FW : 220). La demi-vie du thiol PrC-210 (forme active) est d'environ 3,5 h dans des solutions de pH physiologique telles que la solution UW et le sang humain [14]. Après perfusion in situ, le BN gaucheun reina été enlevé chirurgicalement puis suturé par anastomose franche des vaisseaux et de l'uretère dans le site rénal gauche libéré du rat receveur LEW. Le bon LEWun reina été ligaturé et enlevé juste avant. Cinq minutes après la fermeture chirurgicale du rat LEW, le rat a reçu une dose systémique de PrC{{0}} (121 ug PrC-210 HCl par g de poids corporel, ce qui équivaut à 0.24 X dose maximale tolérée) par injection intrapéritonéale. Comme le montre le schéma de la figure 1, le rat a également reçu des doses d'injection intrapéritonéale de PrC-210 (0,24 MTD) plus de 4 h et plus de 8 h après la greffe. Les rats ont été euthanasiés plus de 20 h après la greffe, etreinset des échantillons de plasma ont été prélevés pour analyse. Il y avait un minimum de cinq rats dans chaque groupe de traitement.
2.4. Mesures de l'urée sérique et de la créatinine
L'urée et la créatinine ont été mesurées dans des échantillons de sérum à l'aide de la technologie Catalyst One Analyzer (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, USA).
2.5. Essais d'immunosorbants liés aux enzymes
Les tests ont été effectués comme décrit dans les protocoles du kit ELISA (Rat TIMP-1, Cat# RTM- 100 ; Rat MIP3-A, Cat# DY540 ; Rat TNF-alpha, Cat# RTA{ {5}} ; Systèmes de R&D, Minneapolis, MN, États-Unis). Brièvement, des dilutions de plasma de rat ont été ajoutées à des plaques pré-enduites, incubées pendant 2 h à 37 О C. Un anticorps conjugué à la biotine spécifique de la protéine testée a ensuite été ajouté et incubé pendant 1 h à 37 О C, lavé, conjugué à l'avidine. de la peroxydase de raifort a été ajoutée, suivie d'un lavage et d'un ajout de substrat TMB. La réaction a été incubée pendant 10 à 30 min, arrêtée avec de l'acide sulfurique et lue à 450 nm.
2.6. Réseau de cytokines de rat Proteome Profiler
Les dosages ont été effectués essentiellement comme décrit dans le protocole du produit. Brièvement, le plasma a été incubé avec des membranes de nitrocellulose tachetées d'anticorps de capture et de contrôle. Après incubation, les membranes ont été lavées et incubées avec de la streptavidine HRP. Contrairement au protocole, nous avons utilisé SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, USA; Cat # 34094) pour la détection chimioluminescente, car il a donné un signal plus fort. Les transferts ont été visualisés sur un système FotoDyne gel doc.
2.7. Histologie
Fixé au formol (10 % de formol), inclus en paraffine,reinsont été coupés en tronçons de 5 um. Les lames ont été déparaffinées, réhydratées du xylène à travers une série graduée d'éthanol à l'eau, puis traitées comme décrit ci-dessous. Les diapositives ont été numérisées à l'aide d'un objectif 20- dans un scanner de diapositives de pathologie numérique Aperio. Toutes les lames H&E ont été examinées par le Dr Weixiong Zhong, MD, PhD, pathologiste transplantologue, et notées pour PTC, glomérulite (g), vascularite (v)/artérite intimale, inflammation interstitielle (I) et coloration C4d, selon Banff 2009 [21].
Séparément, les diapositives ont reçu un numéro en aveugle et des images numériques non superposées des tubules rénaux ont été prises à l'interface entre la moelle et le cortex à partir de chaque diapositive H/E. On a pris soin de ne pas inclure les lumières et les glomérules des gros vaisseaux. Quantification automatisée des pixels rouges et bleus dans chaque 10-un reinl'image a été réalisée à l'aide d'une macro personnalisée écrite dans le logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
consulté le 13 avril 2021). Les pixels rouges reflétaient l'épaisseur tubulaire proximale, y compris la bordure en brosse. Les noyaux ont été quantifiés dans le canal bleu. Le rapport des pixels nucléaires bleus aux tubules rouges a fourni un score d'infiltration inflammatoire pour l'infiltration de globules blancs dans le post-transplantation.reins. Les scores ont été moyennés et tracés à l'aide de Graphpad Prism.
2.8. Activité enzymatique caspase activée
Activité des caspases 3 et 7 activées dansun reinLes surnageants d'homogénat ont été déterminés à l'aide du substrat fluorescent Apo-ONE (Promega, Madison, WI, USA) [16]. Brièvement, décongeléreinsont été mélangés avec un excès de tampon de lyse 8- fois contenant 50 mM de Na HEPES, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 1 mM d'EDTA, 10 mM de DTT, 10 % de glycérol et homogénéisés à 4 °C pendant 30 s avec un homogénéisateur de tissus Omni . L'homogénat de rein a été centrifugé à 4ОC (16,000- g) dans une microcentrifugeuse Eppendorf pendant 20 min. Les surnageants ont été immédiatement testés pour l'activité caspase et la teneur en protéines par la méthode de Bradford en utilisant de l'albumine de sérum bovin comme standard. Le dosage de la caspase activée a été effectué comme suit : 5 uL de surnageant (~40 ug de protéine surnageante) ont été dilués à un volume total de 50 uL avec le tampon de lyse ci-dessus, ont été mélangés avec 50 uL du substrat Apo-ONE non dilué dans le puits d'une plaque de 96 puits noire et opaque pour initier la réaction de 60 min. Les plaques ont été secouées à 200 RPM à 37 О C pendant 60 min. Le clivage du peptide substrat de la caspase DEVD a été mesuré en utilisant un lecteur de plaque fluorescente BMG Clariostar à une longueur d'onde d'excitation de 499 nm et une longueur d'onde d'émission de 521 nm. Un standard de caspase a été inclus dans chaque expérience.
2.9. Mitochondries de rein de rat
La fraction mitochondriale purifiée a été préparée à partir de rat homogénéiséreinspar une technique de centrifugation standard [22]. Les mitochondries purifiées ont été mises en suspension dans du tampon 0.15 M Tris HCl, pH 7,4.
Pour déterminer si l'ajout de PrC{{0}} exogène supprime la fragmentation induite par les ROS de l'ADN mitochondrial [22], dans un volume de réaction de 25 uL (dans un tube PCR), nous avons ajouté : 1{{29} } uL de mitochondries purifiées, 5 uL de dilution PrC-210 ou d'eau (PrC-210 a été ajouté 10 min avant le générateur Fe plus plus plus ADP plus H2O2 ●OH) et 10 uL contenant FeCl2 (2,5 mM ; FW : 127), sel de sodium d'adénosine 5'-diphosphate (10 mM ; FW : 427) et H2O2 (0,003 % de concentration finale). Après 20 min à 37 О C, 10 uL de la réaction ont été mélangés avec 5 uL de colorant de charge de gel 6- contenant 0,3 % de SDS ; les tubes sont restés dans de l'eau à 60 ° C pendant 1 min, 10 ul ont ensuite été chargés dans un puits d'un gel d'agarose TAE à 1%, et après 60 min à 60 volts, les gels ont été colorés et photographiés. Un minimum de trois répétitions a été effectué pour chaque point d'analyse pour permettre une comparaison statistique.
2.10. Analyses statistiques
Les données sont exprimées en moyennes plus /一 MST. Les tests t de Student ont été utilisés pour déterminer la différence statistique et les valeurs p à l'aide du logiciel GraphPad Prism 7.03. les valeurs de p inférieures à 0,05 ont été considérées comme significatives.
3. Résultats
3.1. PrC-210 Suppression de la pathologie de l'allogreffe rénale
A 20h post-greffe, l'histologie du BN grefféreins(Figure 2A–D) traité avec la solution UW seule a clairement montré une augmentation des scores de Banff pour la tubulite et la capillarite péritubulaire (flèches rouges et jaunes); les scores de pathologie additionnés sont présentés dans le panneau E. BNreinsperfusé avec PrC{{0}}contenant la solution UW et recevant des doses systémiques intrapéritonéales post-implantation de PrC-210 (Figure 2D) a montré une pathologie inflammatoire clairement supprimée du rein et des scores de Banff supprimés pour la tubulite et péritubulaire capillarite égale aux scores de Banff du groupe BN témoin « 0 h » (Figure 2E). L'administration de PrC-210 a conféré des réductions significatives des marqueurs de lésions rénales de la créatine (p=0.032) et de l'urée (p=0.046).
3.2. Niveaux de caspase activés dans les reins post-transplantation
Niveaux de caspase activée dans le BNun reinles homogénats ont été significativement réduits dans l'allogreffe BNreinsqui n'ont pas été exposés au traitement PrC{{0}} pendant les 20 h suivant la greffe (Figure 5). La perfusion de reins BN avec une solution UW contenant de la PrC-210- et une greffe chez des rats Lewis ayant reçu des doses systémiques de PrC-210 ont entraîné la même activité de caspase activée que celle observée dans les reins témoins "0 h".
3.3. Niveaux de cytokines inflammatoires après une allogreffe de rein BN
Dans les expériences de dépistage,un reinhomogénéiser les surnageants de 0 h témoins et 20 h sans traitementreinsont été criblés avec le réseau de cytokines Proteome Profiler 29 pour détecter les niveaux d'expression altérés, associés à l'inflammation, des cytokines et des chimiokines 20 h après la greffe. Comme le montrent les deux encarts de micropuces de la figure 6, des changements ont été observés dans TIMP-1, TNF-alpha et MIP-3a/CCL20. Des plaques ELISA individuelles ont ensuite été utilisées pour quantifier ces changements dans les homogénats rénaux et les sérums, incluant désormais également les rats traités avec PrC-210. Les niveaux de TIMP -1 et de TNF-alpha ont augmenté 20 h après la greffe et, dans les deux cas, leurs niveaux ont diminué en présence de PrC -210 (Figure 6A–C). Les niveaux de MIP-3a/CCL20 ont augmenté à 20 h, mais ils ont augmenté de manière significative plus élevée chez les rats traités avec PrC-210-(Figure 6D).
3.4. PrC-210 Protection des mitochondries rénales du rat
Fonction mitochondriale soutenue pendant et aprèsun reingreffe est nécessaire à la survie de l'organe greffé. Les ROS générées pendant l'ischémie associée à la greffe, l'ischémie-reperfusion et l'inflammation post-implant peuvent toutes affecter les performances et la survie des mitochondries rénales. En raison du rôle mitochondrial important, nous avons isolé les mitochondries des reins de rat et déterminé si la PrC-210 à des concentrations pharmacologiques réalisables pouvait protéger ces organites d'une insulte aux ROS.
Dans la figure 7, rat purifiéun reinles mitochondries ont été incubées avec un générateur ●OH [23]. Après la brève réaction, nous avons observé une fragmentation significative des ROS de l'ADN mitochondrial du rein de rat. Suite à l'insulte ROS, une aliquote des mitochondries a été solubilisée dans un tampon de chargement de gel contenant du SDS, et l'ADN mitochondrial a été séparé et "dimensionné" en utilisant la chromatographie sur gel d'agarose (Figure 7). L'insulte ROS a clairement réduit la taille moyenne de l'ADN mitochondrial du rein du rat (piste b), et l'ajout de PrC-210 aux mitochondries a empêché la rupture de l'ADN (pistes c–g) dans un PrC-210 manière dépendante de la concentration.
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4. Discussion
Allogreffeun reinla transplantation, qui déclenche le rejet inné du rein par les cellules et les anticorps de l'hôte, est un contributeur majeur à court et à long termeun reindommages pendant la greffe, et la fonction de greffe retardée associée est observée dans jusqu'à 50 % des reins transplantés. Nous avons entrepris cette étude pour déterminer si la PrC-210 serait efficace pour supprimer la gravité des dommages induits à la suite d'une allogreffe de rein dans un modèle de rat qui élimine en grande partie le temps d'ischémie de la greffe et son stress oxydatif associé. Notre hypothèse était que cette approche devrait nous permettre de voir l'impact de la PrC-210 sur l'insulte inflammatoire post-transplantation avec une interférence ischémique minimale.
L'augmentation du TNF-alpha et l'importante infiltration mononucléaire démontrent que la transplantation rénale par allogreffe induit une inflammation aiguë prononcée dans les 20 h suivant la transplantation, et cela a été corrélé avec les dommages des cellules tubulaires rénales observés dans leun reinhistologie (scores de Banff). Le TNF-alpha est principalement produit par les macrophages activés et est une protéine de signalisation cellulaire impliquée dans l'inflammation aiguë. Il est étroitement associé à la pathogenèse du rejet aigu et chronique d'allogreffe [24].
Contrairement aux résultats ci-dessus dans le BN non traitéreins, PrC-210 administré dans le cadre de la solution UW et administré par voie systémique chez les rats post-transplantation a réduit à la fois le taux de TNF-alpha et l'infiltration rénale par les cellules mononucléaires, qui sont tous deux des signes d'inflammation aiguë réduite. La PrC-210 a réduit les lésions rénales, comme le montrent les scores histologiques de lésions rénales (scores de Banff), à des niveaux de fond non traités et a abaissé les niveaux des scores fonctionnels de pathologie rénale, de la créatinine et de l'urée.
L'inflammation des reins BN non traités était associée à une augmentation à la fois du TIMP-1 et du MIP-3A/CCL20. En comparaison, nous avons vu que le traitement PrC-210 réduisait significativement le niveau de TIMP-1 et augmentait significativement le niveau de MIP-3A/CCL20.
L'inhibiteur tissulaire de la métalloprotéinase-1 (TIMP-1) est un régulateur important de la synthèse et de la dégradation de la matrice extracellulaire (ECM). L'accumulation excessive d'ECM est le principal mécanisme pathologique du développement de la fibrose pendant et après une lésion rénale aiguë. Il n'y a pratiquement aucune expression de TIMP-1 en temps normalun reintissu [25], une observation qui est corroborée dans notre figure 6A, B, mais TIMP-1 est connu pour être exprimé dans les reins lésés, principalement dans les cellules épithéliales tubulaires rénales, la membrane basale tubulaire rénale et le cytoplasme de l'interstitiel cellules. L'augmentation de l'expression de TIMP-1 était positivement corrélée à la détérioration simultanée de la fonction rénale [26]. Les rats traités avec PrC-210 ont montré une réduction profonde des niveaux de TIMP-1 (p=0.001), à la fois dans l'homogénat de rein et dans le plasma ; cela implique que PrC-210 exerce un fort effet protecteur contre la réorganisation induite par la transplantation de la matrice extracellulaire rénale.
La chimiokine MIP-3a/CCL20 active le récepteur CCR6, qui s'exprime notamment sur les cellules T régulatrices (Tregs). CCL20 est exprimé par les cellules endothéliales et interstitielles tubulaires et est également régulé positivement dans les reins présentant une lésion rénale aiguë. La voie CCL20-CCR6 joue un rôle vital dans le recrutement des cellules T médiées par les Treg dans le rein, et il a été décrit que les Tregs ont un rôle positif dansun reinla réparation, la tolérance à la greffe et la survie rénale. Le blocage par anticorps de la voie CCL20-CCR6, ainsi que l'utilisation de souris déficientes en CCR6- dans les cas aigusun reinexpériences de blessures, ont montré une augmentation de la gravité de l'insuffisance rénale et de la mortalité [27]. Cela suggère que cliniquement, l'amélioration de la voie CCL20-CCR6 et l'activation des Treg peuvent être une voie thérapeutique possible pour limiter les maladies aiguës et chroniques.un reinblessure [28]. Dans notre étude (Figure 6D), le niveau de MIP-3a/CCL20 était significativement plus élevé chez les rats traités avec la PrC-210-que chez les rats non traités. Nous supposons que c'est l'une des raisons à la fois du (i) recrutement significativement plus faible de cellules mononucléaires dans les reins (figure 3C) et (ii) des lésions rénales significativement réduites (figure 2) chez les rats traités au PrC -210- .
La fonction mitochondriale rénale normale et, surtout, les atteintes à celle-ci pendant les étapes de stockage du rein, d'implantation et d'inflammation post-implantatoire sont des déterminants importants des lésions des ROS et de l'insuffisance rénale pendant la greffe. Il était donc significatif qu'il ait été démontré que la PrC-210 conférait une suppression complète de la fragmentation de l'ADN mitochondrial (Figure 7) à des concentrations (2 à 4 mM) qui ont été atteintes dans le plasma de souris et de rats ayant reçu une injection intrapéritonéale ou intrapéritonéale. systémique orale 0.5 doses MTD de PrC-210 qui ont été tolérées sans toxicité détectable [29].
Dans nos études antérieures liées à la transplantation rénale [16,17], nous avons observé des augmentations substantielles de la caspase activée dans les reins exposés à des lésions d'"ischémie froide" et d'"ischémie-reperfusion". Ces insultes induites par l'ischémie aux reins ont été réduites à l'arrière-plan par un traitement avec PrC-210 (Figure 8). Dans les études de ce manuscrit (Figure 5), dans lesquelles l'ischémie froide et l'ischémie-reperfusion ont été essentiellement éliminées par transplantation immédiate, il n'y a pas eu d'augmentation de la caspase activée dans les reins transplantés. Au lieu de cela, la caspase activée a été significativement réduite à plus de 20 h chez les témoins "sans traitement médicamenteux", et le traitement PrC -210 a complètement éliminé cette réduction de caspase chez les rats de plus de 20 h et a maintenu le niveau de caspase stable. Notre interprétation de ces résultats intéressants est qu'en l'absence de toute agression significative des radicaux libres induite par l'ischémie par les ROS et les RNS à la post-transplantationreins, il n'y a pas de marqueurs de mort cellulaire et d'apoptose associés comme les caspases activées. Au contraire, dans ces allogreffes rénales, les signaux inflammatoires des cytokines et chimiokines nouvellement exprimées régulent désormais le métabolisme cellulaire, ce qui inclut l'influence de la voie de l'apoptose. La littérature décrit que la surexpression de TIMP -1 conduit à la suppression de l'apoptose [26]. Nos résultats de caspase (Figure 5) confirment cet effet TIMP -1 décrit, et ils impliquent que TIMP -1 est important dans la régulation de la physiopathologie des dommages cellulaires après une allogreffe rénale. Pour corroborer la suppression antérieure de PrC-210 de l'expression de TIMP-1 (Figure 6A, B), le traitement PrC-210 a complètement supprimé le changement de caspase, en maintenant les niveaux de caspase au même niveau que celui observé dans les reins témoins "0 h". Étant donné que les niveaux réduits de PrC -210 TIMP sérique -1 à plus de 20 h (Figure 6B) reflètent avec précision la suppression significative de l'allogreffe : (i) apoptose (Figure 5), (ii) pathologie histologique (Figures 2 et 3) et (iii) l'infiltration de cellules inflammatoires (Figure 3), nous prévoyons que la surveillance des taux sériques de TIMP-1 chez les receveurs d'allogreffes rénales humaines sera un moyen logique de surveiller l'efficacité clinique de la PrC-210 dans les futurs essais cliniques .
Dans nos travaux à ce jour [16,17], nous avons montré que la PrC-210 est capable de protéger les reins greffés contre les agressions de l'ischémie froide et de l'ischémie-reperfusion. Dans cette étude, nous voyons maintenant que PrC-210 protège également les reins d'allogreffe des insultes inflammatoires non ischémiques qui se produisent après l'implantation rénale. PrC-210 réduit significativement les niveaux de cytokines inflammatoires aiguës, telles que le TNF-alpha, et supprime l'expression de la chimiokine TIMP-1. Ces deux événements, et potentiellement soutenus par une expression supplémentaire de CCL20, devraient : (i) réduire les lésions rénales de l'allogreffe, (ii) supprimer le recrutement des lymphocytes T dans le rein et (iii) supprimer l'activation des cellules innées et système immunitaire adaptatif. Dans la figure 8, nous résumons ces résultats pour étayer le rôle que nous pensons que la PrC- 210 peut jouer dans la transplantation rénale humaine ; il supprime : (i) les dommages causés par les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les espèces réactives de l'azote (RNS) à l'ischémie froide [17],
(ii) des lésions ROS d'ischémie-reperfusion à l'arrière-plan [16], et (iii) des lésions inflammatoires d'allogreffe substantiellement, dans certains cas, à l'arrière-plan. Étant donné que le principal mécanisme d'action de PrC-210 pour PrC-210 consiste à piéger les radicaux libres d'oxygène et d'azote, cela implique que ces radicaux libres contribuent de manière importante aux lésions rénales observées dans des conditions non ischémiques, c'est-à-dire l'inflammation associée à l'allogreffe étudiée dans ce manuscrit.
En résumé, cela suggère que PrC-210 pourrait fournir une protection d'organe largement applicable pour de nombreuses conditions de transplantation d'allogreffe ; il pourrait protéger les reins greffés pendant et après toutes les étapes du processus de transplantation - du don d'organe, au transport, à la réimplantation et à l'inflammation postopératoire - afin de minimiser le rejet aigu et chronique.
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Les contributions de l'auteur:NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV et MMCG ont participé à la réalisation de la recherche et à l'analyse des données ; TRG et NAW ont participé à la conception de la recherche et à l'analyse des données ; Le WEF et le TRG ont participé à la conception de la recherche, à la réalisation de la recherche, à l'analyse des données et à la rédaction de l'article. Tous les auteurs ont lu et accepté la version publiée du manuscrit.
Financement:Cette recherche a été financée par l'UW Institute for Clinical and Translational Research et accorde UL1TR002373 à UW ICTR du NIH/NCATS, American Society of Transplant Surgeons (133 AAA1552), American College of Surgeons (133 AAB2176), et accorde un soutien au WEF (# R03CA176799).
Déclaration du comité d'examen institutionnel : cette recherche a été approuvée de manière prospective par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'école de médecine et de santé publique de l'Université du Wisconsin (protocole animal #M005204).
Déclaration de disponibilité des données :Les données de l'étude sont entièrement disponibles dans ce manuscrit. Conflits d'intérêts : Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts.
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