Abstrait

Les troubles d'hyperpigmentation cutanée, tels que le mélasma, les taches de rousseur et l'hyperpigmentation post-inflammatoire (PIH), sont fréquemment déclenchés par les rayons ultraviolets B (UVB), des lésions cutanées et une inflammation cutanée locale. Un dépôt excessif de mélanine altère l’apparence de la peau et influence négativement le bien-être psychologique du patient. Les agents dépigmentants conventionnels tels que l'hydroquinone ciblent principalement la tyrosinase avec une action monomode et comportent des risques de sécurité bien documentés. Les mélanges botaniques naturels multi-cibles sont apparus comme des alternatives prometteuses pour la formulation cosmétique fonctionnelle moderne.

Les glycosides phényléthanoïdes (PhG) sont des constituants bioactifs caractéristiques isolés deCistanche désertique, une plante médicinale bien connue des régions désertiques arides. Glabridine (Gla), un isoflavane prénylé extrait deGlycyrrhiza glabra, est largement reconnu comme un composé naturel très puissant pour éclaircir la peau. Cette recherche a systématiquement étudié les performances anti-hyperpigmentaires synergiques des PhG associées à la glabridine. Des tests biochimiques in vitro comprenant des tests d'inhibition de la tyrosinase, de DPPH et de suppression des radicaux libres ABTS⁺ ont été appliqués pour le criblage préliminaire du rapport de masse. Trois modèles cellulaires ont ensuite été construits : modèle de pigmentation des cellules de mélanome de souris B16F10 irradiées aux UVB ; modèle inflammatoire des kératinocytes HaCaT stimulés par les lipopolysaccharides (LPS) ; Modèle de stress oxydatif HaCaT induit par l’AAPH. Des indicateurs couvrant l'activité de la tyrosinase intracellulaire, la teneur en mélanine, la libération de cytokines pro-inflammatoires (IL-6, TNF-), l'activité enzymatique de la superoxyde dismutase (SOD) et de la catalase (CAT) ont été quantifiés. Le calcul de l'indice de combinaison (IC) a été mis en œuvre pour identifier quantitativement l'interaction synergique entre les deux extraits botaniques.

Parmi les proportions testées, les rapports de masse m(PhGs):m(Gla)=1:1, 5:1 et 10:1 présentaient une synergie importante de suppression de la tyrosinase et d'antioxydants. À une concentration totale de 0,4 g/L dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 6,8, les taux d'inhibition de la tyrosinase ont atteint 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1) et 88,06 % (10:1). Les pourcentages correspondants de piégeage des radicaux DPPH étaient de 89,44 %, 88,72 %, 88,10 % ; Les capacités de piégeage des radicaux cationiques ABTS⁺ ont atteint 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %. À une concentration de travail de 25 ug/mL, les trois formulations de composés ne présentaient aucune cytotoxicité significative envers les lignées cellulaires B16F10 et HaCaT. Le groupe mélangé 1:1 a généré une efficacité globale supérieure : l'activité résiduelle de la tyrosinase intracellulaire est tombée à 23,80 %, la teneur relative en mélanine a diminué à 30,90 %. De plus, les PhG/Gla (1:1) ont exercé la plus forte suppression sur la sécrétion d'IL-6 et de TNF et ont restauré au maximum l'activité des enzymes antioxydantes SOD et CAT. Les résultats expérimentaux ont confirmé que les PhG associés à la glabridine obtiennent des résultats antihyperpigmentaires synergiques par trois voies : inhiber la biosynthèse de la mélanine, atténuer l'inflammation cutanée et lutter contre le stress oxydatif. Le rapport de masse 1:1 offre des performances biologiques intégrées optimales. Cette étude fournit des preuves expérimentales soutenant l'application deCistancheMatériaux composites glycosides phényléthanoïdes-glabridine dans le développement de matières premières de soins de la peau blanchissants d'origine végétale et de beauté propre.

Mots-clés: Cistanche désertiqueles glycosides phényléthanoïdes; la glabridine; effet synergique; antihyperpigmentation; antioxydant; anti-inflammatoire ; matières premières botaniques cosmétiques

1. Introduction

Une accumulation excessive de mélanine dans les couches épidermiques entraîne des phénotypes de pigmentation cutanée hétérogènes, notamment le mélasma, les éphélides et l'hyperpigmentation post-inflammatoire (PIH)Google pour.... De multiples facteurs extrinsèques et intrinsèques contribuent à la surproduction pathologique de mélanine. L’irradiation ultraviolette UVB représente le principal déclencheur environnemental ; les traumatismes cutanés et les réponses inflammatoires locales chroniques amplifient encore les troubles pigmentaires. Il est bien établi que les interférences entre les kératinocytes épidermiques et les mélanocytes dominent la progression pigmentaire. Lors d'une stimulation externe, les kératinocytes activés libèrent des espèces réactives de l'oxygène (ROS) et des médiateurs pro-inflammatoires. Ces molécules de signalisation diffusent et agissent sur les mélanocytes adjacents, régulant positivement l'activité catalytique de la tyrosinase, accélérant la synthèse de mélanine et favorisant le transport des mélanosomes vers les kératinocytes, produisant finalement des lésions pigmentées visibles à la surface de la peau. En conséquence, une intervention efficace contre l’hyperpigmentation ne peut pas se concentrer uniquement sur l’inhibition de la tyrosinase. Les stratégies thérapeutiques multimodales devraient couvrir simultanément l’inhibition de la mélanogenèse, l’intervention anti-inflammatoire et la neutralisation du stress oxydatif.

Les actifs synthétiques éclaircissants traditionnels tels que l’hydroquinone offrent une efficacité dépigmentante principalement par suppression directe de la tyrosinase. Néanmoins, les mécanismes à cible unique limitent les performances pratiques, et l’application topique à long terme d’hydroquinone peut déclencher une irritation cutanée, une dermatite de contact et des risques potentiels pour la sécurité, limitant ainsi la portée de l’utilisation de qualité cosmétique. Les bioingrédients naturels d’origine végétale suscitent un intérêt croissant de la part des formulateurs de cosmétiques et des consommateurs en raison de leurs profils doux et de leurs actions pharmacologiques multivoies. Les mélanges composés de différents extraits botaniques sont capables de produire des effets biologiques synergiques, améliorant l'efficacité globale tout en réduisant les exigences de dosage efficace, ce qui ouvre de nouvelles directions techniques pour la recherche sur les matières premières cosmétiques anti-pigmentationGoogle

Cistanche désertique, communément appelé « ginseng du désert », est une plante tonique classique de la médecine traditionnelle chinoise. Les investigations phytochimiques modernes révèlent que les glycosides phényléthanoïdes (PhG) constituent sa principale fraction pharmacologiquement active, l'échinacoside et l'actéoside étant les composés représentatifs. Les recherches pharmacologiques publiées démontrent que les PhG possèdent une solide capacité antioxydante, une bioactivité anti-inflammatoire et un potentiel inhibiteur modéré de la tyrosinase, ce qui implique des perspectives d'application prospectives dans les matériaux de soins dermatologiques. La glabridine est un composé isoflavonoïde caractéristique isolé deGlycyrrhiza glabraracine, bien connue dans l'industrie cosmétique sous le nom d'« or blanchissant ». Il supprime puissamment la mélanogenèse et module simultanément les cascades inflammatoires cutanées. Du point de vue théorique de la médecine traditionnelle,Cistanchenourrit l'essence des reins et tonifie le yang, tandis que les racines de réglisse tonifient la rate et éliminent les toxines thermiques. L'utilisation combinée est conforme aux principes de compatibilité des composés des thérapies dermatologiques à base de plantes.

L'hypothèse mécaniste soutient que la combinaison PhGs-glabridine pourrait réguler la pigmentation de la peau via des modes multi-cibles et multi-voies : inhiber conjointement la fonction catalytique de la tyrosinase pour couper l'origine de la génération de mélanine ; éteindre l'accumulation d'espèces réactives de l'oxygène ; restreindre la libération excessive de facteurs pro-inflammatoires, de manière à interrompre l'amplification du signal médié par les ROS et les cytokines pour l'activation des mélanocytes. À ce jour, peu d’articles de recherche ont systématiquement rapporté une évaluation synergique de l’antihyperpigmentation pour ce mélange binaire.

Cet article vise à explorer les effets biologiques combinatoires entreCistancheglycosides phényléthanoïdes et glabridine. Des expériences biochimiques in vitro d’inhibition des enzymes et de criblage des radicaux ont été mises en œuvre en premier. Trois modèles cellulaires représentatifs imitant le dépôt de pigments, l'inflammation cutanée et les dommages oxydatifs ont été construits pour une évaluation multidimensionnelle de l'efficacité. La méthodologie de l'indice de combinaison a été appliquée pour quantifier les interactions de synergie ou d'antagonisme. Notre objectif était de déterminer le rapport massique optimal du composé, de clarifier les mécanismes fonctionnels triples et de fournir un support de données expérimentales pour le développement de matières premières cosmétiques naturelles synergiques éclaircissantes pour la peau.

2. Matériels et méthodes

2.1 Réactifs, souches cellulaires et instruments de laboratoire

La lignée cellulaire de mélanome de souris B16F10 (STCC20013G‑1) a été achetée auprès de Saierbio Co., Ltd. Les kératinocytes épidermiques humains immortalisés HaCaT (iCell‑h066) ont été obtenus auprès d'iCell Bioscience Inc.Cistancheles glycosides phényléthanoïdes (PhG) et la glabridine (Gla) ont été fournis commercialement par Shaanxi Tianxingjian Biochemical Technology Co., Ltd. La tyrosinase de champignon, l'arbutine, la L‑tyrosine, la L‑DOPA, le DPPH, le sel de diammonium ABTS, l'acide L‑ascorbique (vitamine C), l'AAPH, le LPS, le Triton X‑100, le DMSO et d'autres réactifs chimiques de qualité analytique proviennent du courant dominant. vendeurs de réactifs biochimiques. Les consommables pour la culture cellulaire comprenaient du milieu DMEM riche en glucose, du sérum fœtal bovin et une solution mixte pénicilline-streptomycine. Des kits de test ELISA ciblant les kits de détection de l'IL-6 humaine, du TNF-, de la CAT et de la SOD totale ont été achetés auprès des fabricants de biotechnologie correspondants.

L'équipement de laboratoire clé comprenait un lecteur de microplaques pleine longueur d'onde Multiskan FC, un incubateur Heracell 371 CO₂ (Thermo Fisher) ; Nettoyeur à ultrasons KQ‑200VDB ; bain-marie à température constante ; Four de séchage par soufflage DHG‑9246A ; Instrument d'irradiation ultraviolette KN4006B UVB avec un rayonnement de sortie de 8 mW/cm².

2.2 Préparation de la solution échantillon

Des solutions mères de PhG et de glabridine ont été préparées dans un tampon PBS pH 6,8 ou un solvant éthanol-eau à 50 % (v/v), diluées en série aux concentrations de travail : 0,001 g/L, 0,005 g/L, 0,025 g/L, 0,1 g/L, 0,4 g/L, 0,8 g/L, 1,2 g/L, 1,6 g/L, 2,0 g/L. Neuf groupes composites ont été configurés à une concentration massique totale fixe de 0,4 g/L avec des proportions massiques variées m(PhGs) : m(Gla)=40 :1, 20 :1, 10 :1, 5 :1, 1 :1, 1 :5, 1:10, 1:20, 1:40, désignés comme PhGs/Gla (40 :1) à PhGs/Gla (1 :40).

Pour les tests d'expérimentation cellulaire, des échantillons de poudre ont été dissous dans un milieu DMEM sans sérum pour préparer une série de solutions à concentration de travail.

2.3 Essais biochimiques in vitro

2.3.1 Test d'inhibition de la tyrosinase

50 μL de solution échantillon, 50 μL de PBS pH 6,8 et 50 μL de solution de substrat 1 g/LL-tyrosine ont été ajoutés séquentiellement dans chaque puits sur une microplaque à 96 puits. La pré-incubation s'est déroulée dans un bain-marie à 37 degrés pendant 10 minutes. Par la suite, 50 µL de solution de tyrosinase de champignon à 0,4 g/L (200 U/mL) ont été complétés et l’incubation s’est poursuivie à 37 degrés pendant 10 min. L'arbutine a fonctionné comme substance de contrôle positif, le contrôle à blanc a adopté un tampon PBS de pH 6,8. La valeur d'absorbance a été mesurée sous une longueur d'onde de 490 nm sur un lecteur de microplaques. Formule de calcul du taux d'inhibition de la tyrosinase :

Taux d'inhibition de la tyrosinase (%)={1 − [(A_reaction − A_reaction-control) / (A_blank − A_blank-control)]} × 100 %

Où : A_réaction : absorbance contenant un échantillon, un substrat, du PBS et de la tyrosinase ; A_reaction‑control : absorbance de l'échantillon, du substrat et du PBS sans enzyme ; A_blank : absorbance du substrat, du PBS et de la tyrosinase ; A_blank‑control : absorbance uniquement pour le substrat et le tampon PBS.

2.3.2 Détermination du piégeage des radicaux libres DPPH

La poudre de DPPH a été dissoute dans de l'éthanol anhydre pour préparer 0,2 mmol/L de liquide de travail DPPH. Les PhG, la glabridine et la substance de référence de vitamine C ont été dissoutes dans un solvant éthanol-eau à 50 % pour former des solutions mères à gradient de concentration. Des échantillons de mélange binaire avec neuf rapports de masse ont été mélangés uniformément. Chaque puits a reçu 100 μL de liquide d’échantillon plus 100 μL de solution de travail DPPH. Après mélange minutieux, la microplaque est conservée à l'abri de la lumière et à température ambiante pendant 30 min. La lecture de l'absorbance a été enregistrée à λ = 517 nm. La vitamine C a servi de contrôle positif, chaque groupe expérimental a répété 3 répétitions biologiques. Formule du taux de récupération du DPPH :

Taux de récupération du DPPH (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A₁ : absorbance de l'échantillon + fluide de travail DPPH ; A₂ : absorbance de 50 % d'éthanol + fluide de travail DPPH ; A₃ : absorbance de la solution échantillon mélangée à 50 % de solvant éthanol.

2.3.3 Test de piégeage des radicaux cationiques ABTS⁺

Une solution mère d'ABTS à 7,4 mmol/L et une solution de persulfate de potassium à 2,6 mmol/L ont été mélangées à parts égales, incubées dans un environnement sombre pendant 12 h pour produire un réactif de travail ABTS⁺ stable. Les solutions d'échantillon ont été configurées selon les protocoles décrits dans la section 2.3.2. 40 μL de solution échantillon et 160 μL de liquide de travail ABTS⁺ ont été pipetés dans des puits de microplaques. Après 6 minutes d'incubation à l'abri de la lumière à température ambiante, l'absorbance a été mesurée à 734 nm. Formule du taux de suppression des radicaux ABTS⁺ :

Taux de récupération ABTS⁺ (%)={1 − [(A₁ − A₃) / A₂]} × 100 %

A₁ : absorbance de la solution échantillon plus la solution de travail ABTS⁺ ; A₂ : absorbance de l'eau déminéralisée mélangée au réactif de travail ABTS⁺ ; A₃ : valeur d'absorbance pour la solution échantillon mélangée à un solvant d'eau déminéralisée pure.

2.4 Procédures de culture cellulaire

Les cellules de mélanome B16F10 et les kératinocytes HaCaT ont été cultivés dans un milieu DMEM riche en glucose additionné de 10 % de sérum fœtal-bovin et de 1 % de pénicilline-streptomycine. Paramètres de l'incubateur : 37 degrés, 5 % de fraction volumique CO₂, humidité relative 70 %. Le passage des cellules et le rafraîchissement du milieu ont été effectués en fonction de la densité de croissance cellulaire observée au microscope optique inversé. Les cellules en phase de croissance logarithmique ont été collectées pour un ensemencement ultérieur sur des plaques de culture à 96 puits.

2.5 Établissement de trois modèles fonctionnels cellulaires

2.5.1 Modèle de pigmentation B16F10 induite par les UVB

Après 1 heure de prétraitement avec le milieu d'échantillon correspondant, la surface de la couche cellulaire a été recouverte de tampon PBS. L'intensité de l'irradiation UVB a été fixée à 8 mW/cm², la distance d'irradiation à 3 cm et la durée d'irradiation à 110 s. Le groupe normal a reçu un milieu identique sans intervention de rayonnement UVB. Le groupe témoin modèle a obtenu un prétraitement au PBS suivi d'une exposition à dose égale d'UVB sans supplémentation d'échantillon.

2.5.2 Modèle d'activation inflammatoire HaCaT médié par le LPS

Les cellules HaCaT ont été pré-incubées avec le milieu DMEM de l'échantillon de test pendant 24 h. Ensuite, la solution de lipopolysaccharide LPS a été complétée pour atteindre la concentration finale de 20 ug/mL, et la co-culture a duré encore 24 h. Les cellules du groupe modèle ont été provoquées par le LPS sans prétraitement de l'échantillon. Le groupe normal maintenait une culture moyenne complète ordinaire.

2.5.3 Modèle de stress oxydatif HaCaT déclenché par l’AAPH

Les cellules ont reçu une pré-incubation d'échantillon de 24 heures. Le réactif AAPH a été ajouté au milieu de culture, concentration finale de 25 mmol/L, poursuivant une incubation de 24 h. Le groupe modèle-témoin a été stimulé par l'AAPH sans intervention d'échantillon. Le groupe témoin normal a grandi dans des conditions moyennes normales.

Tous les groupes de modèles cellulaires contenaient trois puits techniques répétés.

2.6 Test de cytotoxicité (méthode CCK‑8)

La suspension cellulaire a été ajustée à une densité de 1 × 10⁴ cellules/mL et inoculée dans des microplaques à 96 puits. Après l'adhérence des cellules, un milieu d'échantillon à gradient de concentration a été administré et l'incubation s'est poursuivie pendant 24 h, 48 h et 72 h. Le réactif de détection CCK‑8 mélangé avec du milieu DMEM frais (fraction volumique 10 %) a remplacé l'ancien milieu, l'incubation s'est poursuivie pendant 60 min. Le lecteur de microplaques a mesuré l'absorbance à une longueur d'onde de 450 nm. Formule de calcul du pourcentage relatif de viabilité cellulaire :

Viabilité cellulaire (%)=[(A_sample − A_blank) / (A_0 − A_blank)] × 100 %

A_sample : absorbance des cellules contenant le puits, du réactif CCK‑8 et du milieu d'échantillon ; A_blank : absorbance pour le milieu de culture plus CCK‑8 sans cellules ensemencées ; A_0 : absorbance des cellules et du réactif CCK‑8 cultivés avec un milieu vierge (pas d'échantillons à tester).

2.7 Quantification de l’activité tyrosinase intracellulaire

Après 48 heures de traitement d'établissement du modèle, le surnageant cellulaire a été éliminé. La monocouche cellulaire a été lavée deux fois avec du PBS pH 7,4 . 50 μL d'une solution de lyse Triton X-100 à 1 % a été ajoutée par puits. La microplaque a été congelée au réfrigérateur à -80 degrés pendant 30 minutes, puis décongelée à température ambiante pour une rupture complète de la membrane cellulaire. Le traitement de préchauffage à 37 degrés a duré 5 minutes. Un substrat L‑DOPA (10 mmol/L, 10 μL) a été complété. La microplaque a été incubée pendant 1 h dans un incubateur à CO₂. L'absorbance a été détectée à 475 nm pour calculer l'activité relative de la tyrosinase intracellulaire.

2.8 Mesure de la teneur en mélanine intracellulaire

La méthode de clivage NaOH a été adoptée pour la détection de la teneur en mélanine. Après l'intervention du modèle de 72 h, le surnageant de culture a été retiré, les cellules rincées deux fois à l'aide d'un tampon PBS . 100 μL d'une solution aqueuse de NaOH à 1 mol/L contenant 10 % de DMSO ont été ajoutées. La microplaque a été incubée dans un four à 90 degrés pendant 60 minutes pour une dissolution complète de la mélanine. L'absorbance a été lue à 490 nm pour calculer le pourcentage relatif de la teneur en mélanine.

2.9 Détection des indicateurs de facteurs inflammatoires et d’enzymes antioxydantes

Après 48 heures de traitement du modèle, les cellules HaCaT ont été grattées et collectées, centrifugées pour récolter le surnageant cellulaire. Des kits ELISA commerciaux ont été utilisés pour la détermination quantitative des concentrations de cytokines pro-inflammatoires IL-6 et TNF. Pour les tests sur les enzymes antioxydantes, les culots cellulaires ont été soumis à des cycles répétés de congélation et de décongélation pour obtenir une fragmentation cellulaire. Condition de centrifugation : 12 000 tr/min, 4 degrés, 10 min. La fraction surnageante a été collectée pour analyser la vitalité de la SOD et la teneur en enzyme CAT conformément aux spécifications opérationnelles du kit.

2.10 Analyse de l'indice combiné (IC)

L'algorithme d'indice de combinaison (CI) de Chou‑Talalay a été mis en œuvre pour évaluer l'interaction synergique/additif/antagoniste entre les PhG et la glabridine dans le cadre des tests d'inhibition de la tyrosinase et d'antioxydants :

CI=D₁/DX₁ + D₂/DX₂

D₁ and D₂: individual mass‑concentration of PhGs and glabridin inside compound solution, when reaching fixed biological‑effect level X. DX₁ and DX₂: required mass‑concentration for single PhGs or glabridin to produce identical X‑level biological effect. CompuSyn software completed CI‑value computation. Evaluation criteria: CI >1 représente une interaction antagoniste ; CI ≈ 1 signifie effet additif ; CI< 1 indicates significant synergistic‑enhancement effect.

2.11 Analyse statistique

Les résultats des mesures expérimentales ont été exprimés en valeur moyenne ± écart type (moyenne ± écart-type). Le logiciel GraphPad Prism 9.5.0 a effectué des calculs statistiques. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) a été utilisée pour la comparaison multigroupe. Valeur P< 0.05 was regarded as statistically significant difference; P < 0.01 marked significant difference; P < 0.001 stood for extremely significant statistical difference.
 

3. Résultats et discussion

3.1 Performances d'inhibition de la tyrosinase in vitro des échantillons de PhG, de glabridine et de mélanges binaires

Half‑inhibitory concentration IC₅₀ values for single‑component PhGs PBS solution, glabridin PBS solution and positive‑control arbutin were (2.192 ± 0.038) g/L, (1.376 ± 0.025) g/L and (0.101 ± 0.003) μg/mL respectively. In‑vitro tyrosinase‑suppressing potency sequence: arbutin > glabridin >PhG.

À une concentration totale de 0,4 g/L pour la solution composée de PBS, PhGs/Gla (10 : 1), PhGs/Gla (5 : 1), PhGs/Gla (1 : 1) ont délivré un taux d'inhibition de la tyrosinase de 88,06 %, 92,93 %, 94,37 %. Les ratios 5:1 et 1:1 dépassaient l'efficacité d'inhibition des PhG à un seul composant (36,92 %) et de la glabridine à un seul composant (92,71 %) pour correspondre à la concentration massique totale. Le groupe 1:1 a atteint une ampleur d'inhibition comparable à celle du contrôle positif arbutine. Selon les résultats du calcul de la valeur CI : m(PhGs):m(Gla) allant de 40:1 à 1:1 CI généré< 1, confirming obvious synergistic enhancement on tyrosinase‑suppression. Conversely, proportion series from 1:5 up to 1:40 gave CI >1, manifestant une interaction antagoniste.

Les groupes hydroxyle phénoliques constituent le principal fragment fonctionnel de la capacité inhibitrice de la tyrosinase. Les PhG contiennent des fragments structurels ortho‑dihydroxyphényles capables de chélater les ions cuivre dans la poche catalytiquement active de la tyrosinase, empêchant ainsi de manière compétitive la liaison substrat-enzyme. Le squelette isoflavane de la glabridine porte des groupes 2‑OH et 4‑OH sur son cycle B, structurellement analogue au cycle hydroxyle aromatique L‑tyrosine/L‑DOPA, permettant une occupation compétitive du domaine du site actif de l'enzyme. Après le mélange des composés, la quantité cumulée d’hydroxyles phénoliques augmente ; pendant ce temps, deux molécules peuvent s'attacher à des sites de liaison distincts de la protéine tyrosinase, amplifiant conjointement l'efficacité inhibitrice.

3.2 Activité antioxydante anti-radicalaire des échantillons testés

DPPH‑scavenging IC₅₀ data: PhGs (21.135 ± 1.164 μg/mL), glabridin (55.537 ± 5.230 μg/mL), Vitamin C positive reference (2.852 ± 0.252 μg/mL). DPPH radical‑quenching‑ability ranking: Vitamin C > PhGs >glabridine. Les PhG sont abondants dans les groupements caféoyl et 3,4-dihydroxyphényléthanol, avec des systèmes à double liaison conjuguée renforçant les performances de neutralisation des radicaux libres. La structure flavonoïde de la glabridine fournit également des groupes hydroxyle et une architecture d'anneaux conjugués étendue pour stabiliser les électrons non appariés des espèces réactives de l'oxygène.

Trois groupes de composés prometteurs, PhGs/Gla (1 : 1), (5 : 1), (10 : 1) présentaient d'excellentes performances de piégeage du DPPH et de l'ABTS⁺. Le taux de piégeage ABTS⁺ a presque atteint 100 %, indiquant une élimination presque complète des radicaux libres des cations. Différents rapports de masse produisent des états d'interaction moléculaire variés entre deux molécules, conduisant à des disparités dans le statut d'exposition aux groupes hydroxyles et à une divergence dans l'ampleur de la synergie antioxydante.

3.3 Évaluation de la cytotoxicité des PhG, de la Glabridine et des préparations mélangées

Les tests de cytotoxicité CCK‑8 ont démontré que les PhG dans un champ de concentration de 62,5 ~ 500 ug/mL et la glabridine entre 6,25 ~ 25 ug/mL n'ont pas déclenché de réduction évidente de la viabilité pour les lignées cellulaires B16F10 et HaCaT. Dans des conditions de concentration massique totale de 25 ug/mL, trois groupes de composés PhGs/Gla (1:1, 5:1, 10:1) ont maintenu une viabilité cellulaire élevée, ne montrant aucun effet cytotoxique détectable contre les deux souches cellulaires. Par conséquent, 25 ug/mL ont été sélectionnés comme concentration de travail sûre pour une évaluation ultérieure de la fonction cellulaire. Pour les groupes à agent unique, les doses faibles/moyennes/élevées de PhG ont été définies comme étant 125 ug/mL, 250 ug/mL, 500 ug/mL ; Dosage faible/moyen/élevé de glabridine : 6,25 ug/mL, 12,5 ug/mL, 25 ug/mL.

3.4 Influence sur l'activité de la tyrosinase intracellulaire et la teneur en mélanine dans les cellules B16F10 stimulées par les UVB

Après traitement par irradiation UVB, le groupe modèle B16F10 a présenté une élévation statistiquement significative de l'activité de la tyrosinase intracellulaire et de l'accumulation de mélanine (P< 0.001), verifying successful construction of cellular pigmentation‑model. Both single‑agent PhGs and glabridin reduced tyrosinase‑activity and melanin level following concentration‑dependent tendency.

À une concentration totale unifiée de 25 ug/mL, les groupes composés présentaient des résultats biologiques supérieurs par rapport à leurs homologues à un seul composant. Parmi trois ratios, PhGs/Gla (1:1) a produit un effet optimal : l'activité tyrosinase intracellulaire résiduelle n'est que de 23,80 %, la teneur relative en mélanine est tombée à 30,90 %. La comparaison statistique a révélé une différence significative par rapport aux groupes composés 5:1 et 10:1. La proportion de 1 : 1 a manifesté une amplification synergique importante pour restreindre la biosynthèse de mélanine à l’intérieur des cellules mélanocytaires.

L'irradiation UVB provoque une cascade de signalisation mélanogène intrinsèque aux mélanocytes, régulant positivement l'expression du facteur de transcription MITF et induisant en outre une surexpression de la protéine tyrosinase. Les résultats de nos expériences cellulaires ont validé que les PhG combinées à la glabridine pouvaient efficacement inverser l'activation de la tyrosinase induite par les UVB et réduire la production de mélanine.

3.5 Effet anti-inflammatoire sur les kératinocytes HaCaT provoqués par le LPS

La stimulation du LPS a fortement augmenté la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires d'IL-6 et de TNF dans le groupe modèle HaCaT (P< 0.001), proving inflammatory‑model replication success. Individual PhGs and glabridin suppressed cytokine release in concentration‑dependent manner.

When comparing three compound ratios at 25 μg/mL, anti‑inflammatory potency sequence was PhGs/Gla (1:1) > PhGs/Gla (5:1) >PhG/Gla (10:1). La formulation 1:1 a généré une réduction maximale de la libération d'IL-6 et de TNF, dépassant l'effet inhibiteur obtenu par l'application séparée de PhG ou de glabridine.

Explication du mécanisme moléculaire : le fragment phénolique-hydroxyle du PhG élimine les radicaux libres déclencheurs d'inflammation ; de plus, les PhG peuvent interférer avec les cascades de signalisation intracellulaire NF-κB et MAPK pour restreindre la transcription des gènes pro-inflammatoires. La glabridine inhibe la phosphorylation des kinases JNK et p38 activées par le stress, bloquant ainsi la transduction du signal inflammatoire en aval. Une seule substance peut simplement supprimer partiellement l’activation des voies du signal inflammatoire. La combinaison binaire intervient simultanément sur plusieurs nœuds au sein du réseau de signalisation inflammatoire, obtenant ainsi des performances anti-inflammatoires synergiques.

L’inflammation cutanée constitue un facteur critique en amont de l’apparition d’une PIH. Les cytokines inflammatoires sécrétées par les kératinocytes agissent comme des messagers de signalisation paracrine, stimulant les mélanocytes adjacents pour accélérer la production de mélanine et le transfert de mélanosomes. Une atténuation efficace de l’inflammation épidermique est essentielle pour prévenir et améliorer les lésions d’hyperpigmentation. Par conséquent, l’avantage anti-inflammatoire du composé PhGs-glabridine confère une valeur supplémentaire pour l’application de matériaux cosmétiques anti-pigmentants.

3.6 Capacité de régulation des enzymes antioxydantes dans des conditions de stress oxydatif induit par l'AAPH

Le groupe modèle de stress oxydatif AAPH a montré un déclin évident de la vitalité intracellulaire des enzymes antioxydantes SOD et CAT (P< 0.001). Treatment with PhGs or glabridin alone could partially restore SOD and CAT activity. Among compound‑ratio groups, PhGs/Gla (1:1) displayed most powerful capability to elevate SOD and CAT enzyme level inside HaCaT cells.

La peau exposée aux rayons ultraviolets génère de grandes quantités d’espèces réactives à l’oxygène. L’excès de ROS oxyde non seulement directement les biomolécules liées à la synthèse de mélanine, mais active également plusieurs voies de signalisation mélanogène. Le système antioxydant-enzyme endogène (SOD, CAT) constitue une barrière de défense majeure pour éliminer les ROS intracellulaires. Lorsque le stress oxydatif dépasse la capacité antioxydante intrinsèque, l’accumulation de ROS accélère la progression de la pigmentation. Le composé PhGs-glabridine non seulement élimine directement les radicaux libres via une réaction chimique phénolique-hydroxyle, mais répare également le fonctionnement du système cellulaire antioxydant-enzymatique, soulageant ainsi les dommages causés par le stress oxydatif dans deux dimensions. Différents rapports de masse modifient le modèle d'interaction moléculaire entre deux molécules naturelles, entraînant une divergence dans l'efficacité finale de régulation des antioxydants.

3.7 Discussion globale sur le mécanisme d’antihyperpigmentation synergique

Le processus pathologique de l’hyperpigmentation cutanée forme un réseau de signalisation complexe : l’irradiation UVB agit à la fois sur les mélanocytes et les kératinocytes environnants. Les kératinocytes libèrent des ROS et des cytokines pro-inflammatoires. Ces biosignaux activent en outre les mélanocytes, régulent positivement l'activité de la tyrosinase, stimulent la biosynthèse de la mélanine et facilitent le transport des mélanosomes vers les kératinocytes épidermiques, conduisant finalement à un dépôt visible de pigments à la surface de la peau. En conséquence, l’inhibition de la tyrosinase à cible unique ne peut pas inverser complètement la pigmentation pathologique. La stratégie d'intervention multivoie doit intégrer l'inhibition de la mélanogenèse, l'anti-inflammation et la protection antioxydante.

Nos résultats expérimentaux ont démontré que les PhG combinées à la glabridine permettent une intervention multimodale contre l'hyperpigmentation :

Supprime directement l'activité catalytique de la tyrosinase à l'intérieur des mélanocytes pour inhiber la source de biosynthèse de la mélanine ;

Inhibe la sécrétion excessive de cytokines pro-inflammatoires par les kératinocytes, coupant ainsi le signal de stimulation inflammatoire paracrine vers les mélanocytes ;

Élimine l’excès d’espèces réactives de l’oxygène et récupère l’activité enzymatique antioxydante endogène SOD/CAT, atténuant ainsi l’amplification pigmentaire médiée par le stress oxydatif.

Le rapport m(PhGs):m(Gla) = 1:1 présentait des performances synergiques globales optimales dans l'inhibition des enzymes biochimiques, l'élimination des radicaux, le modèle de pigment mélanocytaire, le modèle d'inflammation des kératinocytes et le modèle de stress oxydatif. Ce ratio a surpassé les groupes de 5 : 1 et 10 : 1 dans presque tous les indicateurs de test. La synergie peut provenir de caractéristiques structurelles moléculaires complémentaires : les PhG et la glabridine possèdent des structures squelettiques phénoliques distinctes, interagissant avec différentes protéines cibles (tyrosinase, kinases de signalisation inflammatoire, voies liées aux enzymes antioxydantes). Après le mélange des composés, l'état d'exposition aux phénoliques et aux hydroxyles est optimisé grâce à une interaction intermoléculaire, améliorant ainsi l'activité biologique globale.

Du point de vue pratique de l’industrie cosmétique, les matières premières synergiques à base de composés botaniques apportent deux avantages majeurs. Premièrement, l'effet synergique permet de réduire la dose requise pour chaque ingrédient actif, réduisant ainsi le coût de la formulation ; Deuxièmement, le profil fonctionnel multivoie correspond au mécanisme pathologique complexe de l'hyperpigmentation cutanée observée cliniquement, comme le PIH et le mélasma, offrant une base théorique pour le développement de formules cosmétiques naturelles éclaircissantes pour la peau à haute efficacité.

4. Conclusion

Cette recherche a systématiquement évalué la bioactivité synergique anti-hyperpigmentation deDérivé de cistanche deserticolaglycosides phényléthanoïdes (PhG) associés à la glabridine (Gla). Un criblage biochimique in vitro et trois modèles cellulaires représentatifs ont été utilisés pour la caractérisation multidimensionnelle de l'efficacité. Les principales conclusions expérimentales sont résumées comme suit :

Dans les tests biochimiques in vitro pour l'inhibition de la tyrosinase et l'élimination des radicaux libres, les formulations de composés m(PhGs):m(Gla) = 1:1, 5:1, 10:1 ont présenté des performances d'inhibition et une interaction synergique favorables. Sous une concentration totale de 0,4 g/L dans du PBS pH 6,8, les taux d'inhibition de la tyrosinase ont atteint 94,37 % (1:1), 92,93 % (5:1), 88,06 % (10:1). Taux de suppression des radicaux DPPH : 89,44 %, 88,72 %, 88,10 %. ABTS⁺‑taux de piégeage des radicaux : 100,13 %, 100,01 %, 99,87 %.

À une concentration de travail sûre de 25 ug/mL, les solutions PhGs/Gla (1:1), (5:1), (10:1) DMEM n'ont présenté aucune cytotoxicité contre les cellules de mélanome B16F10 et les kératinocytes humains HaCaT. Parmi ces groupes, PhGs/Gla (1:1) a obtenu la meilleure efficacité intégrée : l'activité de la tyrosinase intracellulaire a diminué à 23,80 %, la teneur en mélanine a été réduite à 30,90 %. Il a généré la plus forte inhibition de la libération d'IL-6, de TNF-cytokines inflammatoires et une restauration maximale de la vitalité des enzymes antioxydantes SOD et CAT. Le groupe à rapport de masse 1:1 a présenté un effet d'amélioration synergique évident supérieur aux groupes à agent unique et aux autres groupes à rapport composé.

Le mélange binaire de PhG et de glabridine exerce un effet anti-hyperpigmentation cutanée par trois voies : suppression de la biosynthèse de mélanine, soulagement de l'inflammation épidermique et lutte contre les dommages causés par le stress oxydatif. Le rapport de masse synergique optimal m(PhGs):m(Gla) = 1:1. Cette étude fournit des preuves expérimentales et un soutien technique pour le développement de matières premières cosmétiques multifonctionnelles naturelles d'origine végétale pour des applications éclaircissantes et anti-pigmentaires.

Remerciements

Ce travail a été soutenu financièrement par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subvention n° . 82160772). Nous remercions le Laboratoire clé de recherche sur les médicaments cliniques du Xinjiang pour son soutien à la plateforme expérimentale.

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