L'efficacité sensible à l'âge de la restriction calorique sur la biogenèse mitochondriale et les dommages à l'ADNmt dans le foie de rat 2

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2.4.Effet de l'âge et de la RC sur le contenu et les dommages de l'ADNmt

Étant donné que la dynamique mitochondriale est étroitement liée au maintien de l'ADNmt [16,18], nous avons déterminé la teneur en ADNmt chez tous les rats par la réaction quantitative en chaîne par polymérase (qPCR) (Figure 8).

Une diminution liée à l'âge de la teneur en ADNmt a été constatée chez les rats AL-28(-27 %) et les rats AL-32(-23 %) par rapport aux rats AL{{ 5}} animaux, alors qu'aucune différence statistique n'était présente entre les groupes AL-28 et AL-32. La CR n'a été très efficace pour prévenir la diminution liée à l'âge de la teneur en ADNmt qu'à 28 mois, ce qui a entraîné une augmentation (plus 19 %) de la valeur dans le groupe CR -28 par rapport à l'homologue du même âge nourri avec AL. De plus, il n'y avait pas de différence statistique entre la valeur AL-18 et celle du groupe CR-28. Comme on l'a vu pour d'autres marqueurs dans le présent travail, le CR n'était pas aussi efficace à 32 mois puisqu'il n'y avait pas de différence entre la valeur AL-32 et celle de l'homologue CR-32. Afin d'approfondir l'analyse au niveau des dommages à l'ADNmt, nous avons mesuré le contenu relatif de la "délétion commune" de 4,8 Kb par qPCR (Figure 9).

Aucun changement significatif n'a été trouvé avec l'âge ni avec la RC dans le contenu relatif de la délétion de 4,8 Kb dans tous les groupes testés.

Enfin, nous avons criblé trois régions spécifiques de l'ADNmt pour l'incidence des purines oxydées, principalement l'8-oxo-désoxyguanosine (8-oxyde), en utilisant l'enzyme formamidopyrimidine ADN glycosylase (Fpg) sensible aux purines oxydées. Les trois régions englobaient, respectivement, la boucle de déplacement (boucle D), l'origine de la réplication du brin léger (Ori-L) et des parties des sous-unités 1 et 2 de la NADH déshydrogénase (ND) (ND1/ND2)( Figure 10).

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Comme le montre la figure 10, le pourcentage d'incidence d'oxyde 8- était significativement différent entre les groupes de rats dans chaque région analysée, bien qu'avec un schéma similaire. Le test post-doctoral a révélé l'importance de la présence réduite d'8-oxyde chez les rats CR-28 par rapport aux groupes AL-18 et AL-28({{7} } % de CR-28 par rapport à AL-18 et-43 % de CR-28 par rapport à AL-28 au niveau de la boucle D ;-48 % de CR -28 contre AL-18et-49 % de CR-28vs.Extrait de Cistanche Anti RadiationAL-28 à l'Ori-L ;-54 % de CR-28 contre AL-18 et-56 % de CR-28 contre AL{{ 7}} à ND1/ND2). Le CR s'est avéré efficace pour prévenir les dommages oxydatifs de l'ADNmt jusqu'à 28 mois, alors que l'incidence des mêmes dommages n'était pas différente entre AL-32 et CR-32 les rats. Des purines oxydées ont déjà été détectées chez les rats AL-18 sans montrer d'augmentation liée à l'âge chez les animaux AL-28. La comparaison entre le groupe AL-32 et le groupe CR-32 n'a pas montré de différence significative. Compte tenu des valeurs de la région spécifique, il est intéressant de souligner que l'incidence de la boucle D était la plus élevée parmi les valeurs des régions testées dans chaque groupe, confirmant ainsi les découvertes précédentes indiquant que cette région était un point chaud pour les dommages oxydatifs [17,{{ 20}}].

Figure 10. Incidence des dommages aux purines oxydées dans les régions d'ADNmt de la boucle D, Ori-L et ND1/ND2 dans le foie à partir de AL-18, AL-28, CR-28, AL -32, et CR-32-rats âgés d'un mois. (UN). Les barres représentaient les données obtenues à partir de deux expériences indépendantes menées en triple et analysées à l'aide du test ANOVA à un facteur et du test de comparaison multiple de Tukey. Dans la représentation graphique, les données ont été normalisées par rapport à la valeur des rats AL-18, fixée à 1, et affichées comme valeur moyenne et SD.*p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">cistanche herbeUne aliquote de chaque amplification par PCR a été chargée sur un gel d'agarose coloré au bromure d'éthidium et analysée pour les intensités de bande.

Tous les résultats rapportés sur l'efficacité de la RC dans les groupes appariés selon l'âge ont été résumés dans le tableau 1.

3. Débat

Dans la recherche de longue date d'approches capables de contrer le déclin progressif du vieillissement, la CR a acquis une pertinence primordiale en raison de ses effets positifs, rapportés dans une large série d'organismes allant de la levure à l'homme [22]. Il a été démontré que la CR affecte un grand nombre de voies moléculaires. Parmi ceux-ci, certains sont particulièrement efficaces dans la modulation de la biogenèse et de l'activité mitochondriales, comme ceux qui détectent les nutriments et/ou les niveaux d'énergie tels que la kinase dépendante de l'AMP (AMPK) et les sirtuines, dans lesquelles tous coopèrent avec la reprogrammation induite par le CR des mitochondries. métabolisme [23]. En améliorant le métabolisme oxydatif, la CR réduit la production mitochondriale de ROS et les dommages moléculaires induits par l'augmentation liée à l'âge de ces espèces réactives [8-10]. Bien que plusieurs études aient étudié les effets de la CR au niveau mitochondrial [3,13-15,24], un travail complet sur les effets de cette intervention nutritionnelle sur les organites fait toujours défaut. Par conséquent, cette étude visait à tester l'existence de limites à l'efficacité des CR dans un large ensemble de marqueurs mitochondriaux. En particulier, nous nous sommes concentrés sur la comparaison entre les effets induits par ce régime alimentaire chez des rats âgés (28-mois) et extrêmement âgés (32-mois) pour vérifier s'il existe une interaction entre la CR et la progression du vieillissement. L'analyse des résultats a révélé une image complexe de l'efficacité de la CR sur la biogenèse mitochondriale et les dommages à l'ADNmt, qui a été résumée dans le tableau 1.

Cistanche peut anti-âge

3.1.Marqueurs mitochondriaux chez 28-rats âgés d'un mois

Un grand nombre de marqueurs mitochondriaux ont été positivement affectés par la RC chez des rats âgés de 28-mois. À savoir, des diminutions liées à l'âge ont été signalées dans l'activité de la citrate synthase, dans les quantités de protéines de TFAM, MFN2 et DRP1, et dans la teneur en ADNmt comparant le groupe témoin AL-18 avec le groupe AL-28 . De tels changements ont tous été empêchés par CR chez 28-rats âgés d'un mois (CR-28). Ces résultats confirment l'effet anti-vieillissement de CR jusqu'à cet âge dans le foie de rat. De même, la diminution de l'incidence des purines oxydées dans les trois régions d'ADNmt testées, induite par CR, renforce encore cette opinion. Il convient de noter que ces dommages oxydatifs étaient déjà présents chez les animaux AL-18 sans augmentation liée à l'âge chez les rats AL-28, ce qui suggère que son apparence peut être identifiée comme un marqueur précoce du vieillissement. Une attention particulière doit être accordée aux cinq marqueurs mitochondriaux qui n'ont pas été affectés par la RC chez les rats âgés de 28-mois, à savoir les quantités de protéines de LonP1. Cvt c, OGGl et APE1 et le contenu de suppression de 4,8 Ko. En fait, comme pour LonP1 et Cyt c, la CR n'a pas empêché la diminution liée à l'âge observée chez les animaux AL-28, alors que les quantités de protéines d'OGG1 et d'APE1, ainsi que le contenu de délétion de 4,8 Kb, n'étaient pas affectée par l'âge ni par CR. LonP1 est responsable de la dégradation du TFAM épuisé [25-27] et il a été rapporté qu'il diminue avec le vieillissement [28] dans le foie de rat [29] jusqu'à l'âge de 27 mois. Nous avons précédemment suggéré qu'une telle expression diminuée par le vieillissement de LonP1 [16] pourrait être liée à son activité dans l'élimination du TFAM non lié à l'ADNmt [26]. Comme explication possible de l'inefficacité de la CR pour prévenir la diminution de l'expression de LonP1 liée à l'âge, malgré l'expression restaurée de TFAM et la liaison de TFAM aux régions spécifiques de l'ADNmt (données actuelles et Picca et al. [15]), est la CR -activation médiée de Sirt3 [30] qui pourrait avoir également influencé la quantité de protéines de LonP1 via la désacétylation induite. Une hypothèse différente peut être proposée pour expliquer l'inefficacité de la RC pour prévenir la diminution liée à l'âge de la quantité de Cyt c. Cette protéine est le principal déclencheur de la voie apoptotique mitochondriale par sa libération dans le cytosol, ainsi sa diminution de la quantité intra-mitochondriale chez les rats AL-28 par rapport à la valeur AL-18 a indiqué une augmentation de la processus apoptotique intrinsèque avec le vieillissement [16,31]. De plus, comme pour LonP1, la quantité de Cyt c chez les rats CR-28 était encore significativement inférieure à la valeur chez les animaux AL-18, indiquant que la CR n'affectait pas de manière substantielle la régulation finale de l'expression de Cyt c /relargage vers le cytosol et, vraisemblablement, ni l'augmentation liée à l'âge de la voie apoptotique mitochondriale. Ceci est en accord avec la promotion de l'apoptose médiée par CR [23].croissance du pénis cistancheÉtant donné que la voie apoptotique peut également être déclenchée par l'accumulation de dommages à l'ADN [32,33], nous avons déterminé l'expression protéique de deux enzymes BER mitochondriales majeures, à savoir OGG1 et APE1. Les quantités de protéines des deux n'ont pas été affectées par le vieillissement et le CR passant de 18 à 28 mois. Une explication possible est que l'expression des deux enzymes BER était déjà augmentée et suffisante chez les rats AL -18 pour contrecarrer les dommages accrus liés à l'âge de l'ADNmt. En effet, une augmentation liée à l'âge de l'activité de l'OGG1 mitochondrial [34,35] et de l'APE1 mitochondriale[36] a été rapportée dans le foie de rongeurs passant d'animaux âgés de 3-6- mois à 20-23- mois -les anciens, probablement induits pour contrecarrer efficacement l'augmentation des dommages à l'ADNmt liée à l'âge. Tout cela conforte encore notre hypothèse selon laquelle les dommages à l'ADNmt, réparés par OGG1 et APE1, sont apparus très tôt dans la vie des rongeurs (ils étaient déjà présents chez les rats AL-18) et induits, via une communication rétrograde mitochondrie-noyau, une augmentation précoce de l'expression des enzymes BER. En ce qui concerne l'absence d'effet CR sur OGG1 et APE1, nous suggérons que la présence réduite de CR de ROS et des dommages oxydatifs associés a été efficacement contrecarrée par une expression des deux enzymes non différente de celle des animaux AL appariés selon l'âge. En ce qui concerne le contenu de suppression de 4,8 Ko, il n'y a pas eu d'augmentation liée à l'âge passant des animaux AL-18 aux animaux AL-28, comme si ces dommages à l'ADNmt étaient également apparus assez tôt dans la vie et l'âge des rats. -l'augmentation liée n'a pu être vérifiée qu'en comparaison avec de jeunes animaux, comme rapporté dans d'autres études [19,37-39]. L'inefficacité de la CR pour diminuer significativement le contenu de suppression de 4,8 Kb chez les rats CR-28 par rapport aux animaux AL-28 et AL-18 indique en outre que la CR à long terme a induit une diminution marquée de la présence de ROS dans le foie. Cela aurait pu conduire à une sorte de niveau d'état stable de la suppression de 4,8 Ko, non différent de celui de l'homologue AL-18 et compatible avec le contenu respectif de l'ADNmt. Bien que la réparation de l'ADNmt n'ait pas été réduite par le vieillissement, la diminution de la teneur en ADNmt liée à l'âge était toujours présente lors du passage des rats AL-18 aux rats AL-28, comme décrit précédemment dans différents tissus de rongeurs âgés [3,15,19,39-42]. Cela peut s'expliquer par l'augmentation de la liaison du TFAM liée à l'âge dans des régions spécifiques de l'ADNmt qui étaient également des points chauds endommagés [19]. Cette hypothèse réconcilierait ainsi la perte d'ADNmt liée à l'âge avec l'expression et l'activité inchangées des enzymes de réparation. L'absence de perte d'ADNmt chez les rats CR-28 vient étayer cette hypothèse. En effet, nous avons précédemment démontré que la CR empêchait l'augmentation liée à l'âge de la liaison du TFAM dans des régions spécifiques de l'ADNmt [15]. Par conséquent, selon les données actuelles et antérieures, la modulation de la liaison au TFAM pourrait faire partie des mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation médiée par le vieillissement et la CR de la biogenèse mitochondriale. Il a également été démontré que cette régulation par le vieillissement et la CR se poursuit à travers l'équilibre de la dynamique mitochondriale qui est affectée par le vieillissement [43] et conduit à la prévalence de la fusion sur la fission [44,45]. Par conséquent, nous avons calculé l'indice de fusion (FI) chez tous les animaux testés (Figure 6) et avons trouvé des valeurs qui ont confirmé et élargi nos résultats précédents [16].bienfaits de la salsa cistancheCertaines nouvelles indications peuvent être recueillies par la présente étude, à savoir, chez les rats AL-18, les valeurs FI couvraient une petite plage, tandis que chez les rats AL-28, la plage FI était beaucoup plus large, avec une nette augmentation liée à l'âge des valeurs individuelles, chez les rats CR -28, la petite plage de valeurs indiquait un effet positif du CR dans l'induction de la fission, avec une augmentation généralisée des quantités individuelles de DRP1 par rapport à celles du Groupe AL-28. Alors qu'une fission efficace pourrait éliminer les organites endommagés, une fusion d'entités similaires pourrait assurer la diffusion des macromolécules endommagées dans le réseau mitochondrial, diluant ainsi leurs effets négatifs [46]. Par conséquent, la restauration médiée par CR de l'équilibre finement réglé de la dynamique mitochondriale pourrait induire des conséquences positives sur la modulation de la biogenèse mitochondriale, agissant en synergie avec la communication rétrograde des dommages à l'ADNmt. Ceci est conforme à la littérature existante indiquant que le statut nutritif et les altérations métaboliques peuvent moduler l'équilibre de la dynamique mitochondriale [47] et, par conséquent, affecter également la biogenèse des organites. En particulier, la régulation sensible aux ROS de la biogenèse mitochondriale ne peut faire face qu'à des augmentations limitées de ROS par l'augmentation du nombre d'organites [48] et la présence réduite de ROS [15] pourrait empêcher le dépassement d'un niveau de type seuil qui pourrait conduire à la perte mitochondriale. L'efficacité du CR pour diminuer la présence de ROS a été prouvée dans la présente étude par la réduction de l'accumulation de purines oxydées dans les régions analysées de l'ADNmt chez les rats CR -28 qui soutiennent une amélioration globale du métabolisme mitochondrial, capable de contrecarrer l'âge -déclin lié. En effet, la présence CR-réduite de ROS a été largement démontrée également au niveau des protéines mitochondriales et des lipides. En particulier, il a été démontré que la CR diminue les modifications oxydatives des protéines mitochondriales dans le cœur des rats [49] et modifie l'indice de saturation/insaturation des membranes mitochondriales, empêchant les dommages oxydatifs et maintenant la fluidité membranaire [8]. De plus, il a été démontré que la CR diminue la production de ROS par les complexes respiratoires mitochondriaux dans le muscle squelettique et le foie murins [8]. Les effets bénéfiques de la CR au niveau des ROS comprennent également une neutralisation améliorée des ROS et une réparation accrue des molécules endommagées par les ROS [10]. En plus de cet effet, les modifications de la fonctionnalité mitochondriale sont modulées par l'activation de l'AMPK sensible au CR et des sirtuines qui régulent l'activité des facteurs de transcription coactivateur gamma du récepteur activé par les proliférateurs de peroxysomes 1-alpha (PGC-1 ), et la boîte à fourche (FoxO), cette dernière étant impliquée dans la biogenèse, le métabolisme oxydatif et le renouvellement des mitochondries [23]. Ainsi, l'influence positive médiée par la CR sur le métabolisme mitochondrial devrait interagir avec d'autres voies pour moduler le déclencheur final de la biogenèse mitochondriale, selon un modèle de communication rétrograde vers le noyau [50].

3.2.Marqueurs mitochondriaux chez 32-rats âgés d'un mois

Quant à la comparaison entre les rats AL-32 et CR-32, nos données montrent une absence généralisée de différences significatives. Cela peut suggérer une limite d'âge à l'efficacité de la RC pour contrecarrer le déclin lié à l'âge lors du passage de 28 à 32 mois. En ce qui concerne l'effet de l'âge, cependant, différentes conclusions peuvent être tirées en fonction du marqueur analysé. En fait, dans les deux groupes d'âge 32-mois, la diminution liée à l'âge de l'activité citrate synthase, des quantités de TFAM, LonP1, OGG1, APE1, du contenu de l'ADNmt et de la suppression de 4,8 Kb a été maintenue à un niveau cela était similaire à celui observé chez les rats AL-28 ou il a été partiellement/complètement empêché comme dans les quantités de Cyt c, MFN2, DRP1 et l'incidence des purines oxydées dans des régions spécifiques de l'ADNmt. Ces différents comportements sont probablement dus à l'interaction des différentes voies impliquant les marqueurs analysés. Une autre conclusion peut être mise en évidence en comparant les deux groupes 32-d'un mois avec les AL-18 et les AL-28 pour les montants MFN2 et DRP1. En fait, la diminution liée à l'âge n'était pas présente en passant du groupe AL-18 aux groupes AL-32 et CR-32 pour les deux protéines dynamiques. Considérant que dans la comparaison entre le groupe AL-18 et les deux 32-mois comme pour les autres marqueurs, il y avait une diminution liée à l'âge similaire ou plus petite en taille que celle entre le groupe AL{{ 30}} et AL-28, nous pouvons entraîner certaines conséquences. Cela peut indiquer que les altérations des marqueurs liées à l'âge ont peut-être commencé ou étaient déjà présentes à 18 mois, puis ont atteint leur valeur la plus basse/la plus élevée chez les animaux âgés de 28-mois avec un "rythme" qui est typique du processus de vieillissement. Inversement, chez les animaux extrêmement âgés (32-mois), le "rythme" du processus semble ralentir puisque les valeurs sont inférieures ou égales à celles des homologues AL-18, mais pas inférieures /supérieurs à ceux des AL-28, ont été trouvés, malgré le laps de temps plus long écoulé. L'hypothèse de deux rythmes différents dans le processus de vieillissement [16]implique que des dommages, dus à des causes différentes, commencent à affecter les activités physiques et métaboliques à l'âge adulte chez chaque rat. De tels dommages sont efficacement contrecarrés par des mécanismes compensatoires et les dommages n'apparaissent pas ouvertement, coïncidant avec un âge "moyen" stable caractérisé par une homéostasie réussie. Dans cette étude, nous avons identifié comme rats vieillissant "rapidement" ceux chez qui l'équilibre entre les dommages intervenant et les mécanismes compensatoires commence à s'estomper plus tard dans la vie.dosage de cistanche tubulosa redditChez ces animaux, constituant la plus grande fraction du groupe AL-28, les dommages dépassent le seuil compatible avec les activités normales et une condition altérée apparaît. À l'inverse, la plus petite partie restante de la population vieillissante examinée maintient plus longtemps l'équilibre homéostatique entre les dommages et la réparation et constitue le groupe d'animaux vieillissant "lentement", comprenant à la fois AL-32 et CR{{2} } les rats. Une hypothèse similaire sur les différents rythmes de vieillissement a récemment été proposée également pour les humains [51]. Pris dans leur ensemble, ces résultats indiquent que les animaux extrêmement âgés peuvent avoir atteint la longévité sans être significativement affectés par la CR et probablement en raison d'une prédisposition génétique à mieux faire face au dysfonctionnement mitochondrial lié à l'âge, mais une telle hypothèse justifie des recherches futures. Ces nouvelles découvertes peuvent donner une réponse à la question originale et cruciale sur l'existence de limites à l'efficacité de la RC, soulevée par Ingram et de Cabo dans leur étude très approfondie sur cette question l52l, permettant d'identifier de telles limites avec l'âge de 28 mois pour le foie de rat. Néanmoins, la conclusion que la RC ou tout autre régime alimentaire n'a pas entraîné de conséquences bénéfiques chez les rats naturellement prédisposés à la longévité ne devrait pas affecter la confiance globale dans l'efficacité de cette intervention nutritionnelle. En fait, la RC était toujours capable de transmettre des effets bénéfiques car elle était capable de prévenir la plupart des altérations liées à l'âge de la biogenèse mitochondriale et des dommages à l'ADNmt dans le foie des rats âgés de 28- mois. Cela confirme en outre que la RC est une stratégie bien fondée pour contrer efficacement le déclin vieillissant de la population générale.

4. Matériels et méthodes

4.1.Animaux

L'étude a été approuvée par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Floride. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux directives du National Institute of Health (NIH) pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire. Les échantillons de foie provenaient de rats mâles Fischer 344 × Brown Norway (F344BNF1) obtenus de la colonie du National Institute of Aging (Indianapolis, IN, USA) et logés individuellement dans une température-(20 plus/-2 degré) et lumière- environnement contrôlé (12-h cycle lumière/obscurité) avec nourriture régulière pour rats et eau disponible ad libitum au Département de recherche sur le vieillissement et la gériatrie, Division de biologie du vieillissement, Collège de médecine, Université de Floride, Gainesville, Floride ( ETATS-UNIS). La restriction calorique avait été initiée à l'âge de 3,5 mois (restriction de 10 %), augmentée à 25 % à 3,75 mois et maintenue à 40 % à partir de 4 mois jusqu'à la fin de la vie de chaque animal, soit à 28 mois (CR{ {17}}) ou 32 mois (CR-32) d'âge. Les animaux à restriction calorique ont reçu le régime enrichi NIH31-NIA pour s'assurer qu'ils ne souffraient pas de malnutrition, tandis que les animaux nourris ad libitum ont reçu le régime NIH31 pour rats. Les animaux se composaient des groupes suivants : 18-mois nourris à volonté (AL-18, n=6),28-mois nourris à volonté(AL -28, n=6),28-annonce limitée en calories d'un mois (CR-28, n=6), 32-annonce d'un mois rats nourris à volonté (AL-32, n=6) et 32-mois à restriction calorique (CR-32, n =6). Les animaux ont été anesthésiés avant le sacrifice et des échantillons de foie ont été immédiatement prélevés, congelés instantanément dans de l'isopentane refroidi par de l'azote liquide et stockés dans de l'azote liquide jusqu'à une analyse plus approfondie.

4.2. Détermination de l'activité citrate synthase

La détermination de l'activité citrate synthase a été réalisée comme dans [17]. En bref, 80 ug de protéines totales purifiées à partir d'échantillons de foie ont été incubés dans le tampon de réaction (0.31 mM d'acétyl-CoA, 100 mM de tampon Tris ( pH 8,1), 0,25 % de Triton X-100, 0,1 mM d'acide 550-dithiol-bis-2-nitrobenzoïque et 0,5 mM d'oxaloacétate (1 mL) à 30 degrés.

L'activité citrate synthase (umol x min-I x g tissu-) a été déterminée par spectrophotométrie en mesurant le taux de production d'acide thionitrobenzoïque (TNB) à 412 nm.

4.3. Immunoblot occidental

Les mitochondries hépatiques ont été isolées dans un milieu contenant du mannitol 220 mM, du saccharose 70 mM, du Tris-HCl 20 mM, de l'EDTA 1 mM et de l'EGTA 5 mM, pH 7,4, à 4 degrés selon 【16】. De plus, 10 ug de protéines mitochondriales ont été utilisés pour l'analyse par Western immunoblot. Anti-TFAM(1:50,000), anti-VDAC(1:50,000, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-OGG1(1:2500, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni) , anti-APE1(1:5000, Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-MFN2(1:5000, Abnova, Taipei, Taïwan), anti-DRP1(1:2500, Abnova, Taipei, Taïwan) , anti-Cyt c (1:500, Pharmingen, San Diego, CA, USA) et anti-Lon Protease (1:10 000) ont été utilisés comme anticorps primaires. Les anticorps contre TFAM et Lon ont été fabriqués sur mesure et gracieusement donnés, respectivement, par le Dr H. Hinagaki (Département de chimie, Institut national de recherche industrielle de Nagoya, Nagoya-shi, Aichi, Japon) et le Dr C. Suzuki (Département of Biochemistry and Molecular Biology, New Jersey Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark, NJ, USA). Les protéines ont été détectées par chimiluminescence et les bandes immunoréactives ont été quantifiées à l'aide du logiciel Image Lab (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) et normalisées par rapport à l'expression de VDAC.

4.4.Détermination de l'ADNmt et de l'ADNmt 4.8 Kb"Common Deletion"Contenu

La réaction quantitative en chaîne par polymérase en temps réel (qPCR) a été utilisée pour déterminer le contenu relatif de l'ADNmt et de l'ADNmt 4,8 Kb "délétion commune". Les réactions ont été réalisées via la chimie SYBR Green en utilisant 3 ng d'ADN total comme matrice et les amorces suivantes : ADNmt pour 5-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3'(nt 15.785-15.806), ADNmt rev 5'-TGATTAGACCCGGTTACCATCGA-3'(nt 15,868-15,847); -actine pour 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA-3'(nt 2181-2200), -actinrev5'-CGTCTCCGGAGTCCATC AC-3'(nt 2266-2248);4.8 sup. pour {{26} }AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA-3'(nt8109-8131), 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA-3'(nt 13,020-12,996).Le contenu de l'ADNmt par rapport au noyau L'ADN et le contenu de "délétion commune" de 4,8 Kb par rapport à l'ADNmt ont été déterminés, comme indiqué dans [19].

4.5. Analyse des purines oxydées

La digestion de l'ADN total par la formamidopyrimidine ADN glycosylase (Fpg) (New England Biolabs, Beverly, MA, États-Unis) a été utilisée pour détecter les purines oxydées [53].

L'amplification par PCR des régions D-loop, Ori-L et ND1/ND2 de l'ADNmt a été réalisée à l'aide de la paire d'amorces respective :

Boucle D For5'-TCTGGTCTTGTAAACCAAAAATGA-3'(nt 15,302-15,325),D-loop Rev 5'-TGGAATTTTTCTGAGGGTAGGC-3'(nt 16,302-16, 282); Ori-L Pour 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA-3' (nt 4414-4433),Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGTCCA-3'(nt 5407-5388);ND1 Pour 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT-3'(nt3390-3409),ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3'(nt 4399-4380) sur 5 ng d'ADN total traité par Fpg et non traité. Les conditions de cycle étaient les suivantes : pré-incubation de 10 min à 95 degrés, suivie de 18 cycles de 15 à 95 degrés, 15 à 58 degrés C et 1 min à 72 degrés. Une aliquote de chaque amplification par PCR a été chargée sur un gel d'agarose à 1,3 %. Les intensités de bande des bandes colorées au bromure d'éthidium ont été analysées par le logiciel Image Lab (BioRad Laboratories Inc., CA, USA). Pour améliorer la visualisation graphique, le rapport entre les intensités de bande traitées par Fpg et non traitées a été exprimé en pourcentage du complément à 100.

4.6. statistiques

Les données sont exprimées sous forme de moyenne et d'écart-type (ET). L'ANOVA à un facteur avec le test de comparaison multiple de Tukey a été utilisé. Pour tous les tests, la signification statistique a été fixée à un niveau de 5 %. Les analyses ont été effectuées à l'aide d'un progiciel statistique spécifique (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software : Release. College Station, TX, USA).

Cet article est extrait de Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms