L'anti-apoptose des podocytes et la pro-apoptose des cellules mésangiales pour le telmisartan dans le soulagement des lésions rénales diabétiques

ABSTRAIT

Les dommages aux podocytes et l'expansion des cellules mésangiales sont deux manifestations pathologiques importantes des lésions glomérulaires au début du diabète. Le telmisartan, en tant qu'inhibiteur des récepteurs de l'angiotensine de type 1 (AT1), pourrait améliorer les produits de fin de glycation avancée (AGE) ou les lésions des podocytes induites par l'angiotensine Ⅱ (Ang Ⅱ), y compris le détachement ou l'apoptose. Dans cet article, nous avons d'abord confirmé l'effet protecteur du telmisartan sur les lésions rénales diabétiques précoces chez les rats diabétiques de type 1. Le telmisartan a réduit la perte de podocine et inhibé l'expression de -SMA, reflétant son effet protecteur sur les lésions des podocytes et la prolifération mésangiale, respectivement. Plus intéressant, nous avons observé un effet opposé du telmisartan sur la viabilité cellulaire et l'apoptose des podocytes et des cellules mésangiales dans un environnement riche en glucose in vitro. L'effet anti-apoptotique du telmisartan sur les podocytes pourrait être lié à son inhibition de l'expression de la swiprosine-1 (une protéine qui peut médier l'apoptose des podocytes induite par le glucose élevé). Alors que le telmisartan induisait une expression élevée de PPAR dans les cellules mésangiales, et GW9662 (un antagoniste de PPAR) inhibait partiellement l'apoptose induite par le telmisartan et réduisait la viabilité des cellules mésangiales. De plus, l'expression élevée de PKC 1/TGF 1 induite par le glucose dans les cellules mésangiales pourrait être bloquée par le telmisartan. Ces données fournissent un mécanisme cellulaire plus précis pour révéler l'effet protecteur du telmisartan dans les lésions rénales diabétiques.

MOTS CLÉS

néphropathie diabétique, podocytes (MeSH : D050199), cellules mésangiales, telmisartan (PubChem CID : 65, apoptose

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INTRODUCTION

La maladie rénale diabétique (DKD), bien connue comme une maladie rénale chronique induite par le diabète sucré (DM) de type 1 ou 2 (Podgórski et al., 2019), pourrait aggraver le débit de filtration glomérulaire (DFG) diminue progressivement, puis finit par se développer en fin -stade d'insuffisance rénale (Hou et al., 2018 ; Ruiz-Ortega et al., 2020 ; Groupe d'experts de la Société chinoise de néphrologie, 2021). L'hyperglycémie est médiée par deux mécanismes via la lésion des podocytes rénaux et les modifications de la membrane basale glomérulaire (GBM) induites par l'expansion ou la prolifération des cellules mésangiales (Anders et al., 2018).

Les podocytes sont des cellules épithéliales viscérales spécialisées, tapissant la couche externe du GBM, dont les processus du pied s'interdigitent formant une barrière ultime pour prévenir la perte de protéines urinaires (Podgórski et al., 2019). Le nombre et/ou la densité de chaque glomérule a été étudié chez des patients atteints de DM (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). Les lésions des podocytes contribuent à la perte de leurs propriétés adhésives et constituent une cause majeure du développement de la DKD (Podgórski et al., 2019). Une autre caractéristique notable des podocytes est que les podocytes matures sont des cellules prolifératives limitées (Podgórski et al., 2019), (Griffin et al., 2003). Les pertes de podocytes entraînent la prolifération des cellules mésangiales, néanmoins, des pertes plus importantes entraînent une fibrose glomérulaire et une protéinurie accrue lors de la dénudation ultérieure du GBM (Fukuda et al., 2012). Un mauvais contrôle glycémique entraîne une podocytopathie (Anders et al., 2018), des changements morphologiques caractérisés par une hypertrophie des podocytes, une transdifférenciation épithéliale-mésenchymateuse des podocytes (Chang et al., 2017), un détachement des podocytes (Zhang et al., 2020), une apoptose des podocytes ( Wang et al., 2018a) et la perte de podocytes, qui conduisent aux aberrations progressives des podocytes, entraînent le détachement du GBM avec une glomérulosclérose conséquente.

Les cellules mésangiales ont un impact significatif non seulement sur l'ajustement de la circulation glomérulaire et intraglomérulaire, mais également sur la conservation des glomérules, comme la défense des cellules endothéliales glomérulaires et la sortie de substances du sérum et du liquide des microvaisseaux (Wakisaka et al., 2021). Le GBM épaissi et le mésangial élargi sont des troubles glomérulaires notables dans le diabète (Papadopoulou-Marketou et al., 2017). L'épaississement du GBM est une histopathologie précoce de la DKD et est affecté par le revenu aberrant et la variation de la matrice extracellulaire sécrétée par les cellules endothéliales et les podocytes (Anders et al., 2018). L'hyperglycémie excite les cellules mésangiales à proliférer et à fabriquer la matrice (Kriz et al., 2017) via l'activation du facteur de croissance transformant (TGF), qui provoque directement l'activation transcriptionnelle des collagènes matriciels (Ziyadeh et al., 2000) conduisant à l'expansion mésangiale. matrice.

Une intervention précoce avec un traitement hypoglycémiant et antihypertenseur est bénéfique pour retarder l'apparition et le développement de la NDK (Martins et Norris, 2001). Un inhibiteur de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACEI) ou un antagoniste des récepteurs de l'angiotensine (ARA) est particulièrement recommandé chez les adultes à pression artérielle normale atteints de diabète sucré et d'albuminurie (Liew et al., 2020). Le blocage du système rénine-angiotensine améliore l'expression de l'ANGPTL2 et de l'intégrine qui maintiennent la barrière glomérulaire (Tawfik et al., 2021). La raison pour laquelle le telmisartan a été choisi est qu'il est décrit comme plus efficace que les autres ARA pour atténuer la protéinurie (Naruse et al., 2019 ; Guo et al., 2020). De plus, le telmisartan peut diminuer la néphrotoxicité induite par le cisplatine, telle que l'apoptose des podocytes et les niveaux d'expression des protéines associées à l'autophagie (Malik et al., 2015). De manière fascinante, le telmisartan possède de telles caractéristiques compte tenu de son double rôle d'action de blocage des récepteurs AT1 et de propriété agoniste partielle du récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPAR) (Balakumar et al., 2012). Le but de cet article était d'examiner l'influence protectrice du telmisartan sur les lésions des podocytes et l'expansion mésangiale au stade précoce du diabète de type 1, respectivement.

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MATÉRIELS ET MÉTHODES

1. Animaux

Des rats mâles SD ont été achetés auprès de SLRC Laboratory Animal Ltd. (Shanghai, Chine). Les rats ont été logés à une température contrôlée de 22 ± 2 degrés C, une humidité relative de 50 à 60 %, des cycles de 12-h lumière et 12-h d'obscurité (lumière, 08 :00–20 :00, obscurité, 20 : 00–08 :00), et a permis un libre accès à une alimentation sèche standard et à l'eau du robinet. Tous les animaux ont reçu des soins sans cruauté et les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité de protection des animaux de la Naval Medical University.

2. Modèle diabétique et traitement

Weight 180–200 g male rats were treated with STZ (Sigma, Deisenhofen, Germany) to induce type 1 diabetes. STZ was dissolved in sterile citrate buffer (pH 4.5) and injected intraperitoneally (65 mg/kg body weight) within 10 min of preparation. The non-diabetic rats initially injected with STZ vehicles served as controls (group Con, n = 10). Diabetes mellitus was confirmed by measuring glucose levels in tail venous blood using a B-glucose analyzer (HemoCue, Angelholm, Sweden) 7 days later. Rats with random blood glucose levels>16,7 mmol/L ont été inclus dans les expériences.

Les rats diabétiques ont ensuite reçu du telmisartan (Merck, PHR 1855, 10 mg kg−1 ·j−1 po, groupe DM plus Tel, n=10) ou véhicule (groupe DM, n=10) par gavage pendant 4 semaines. Le telmisartan utilisé dans cet article a été obtenu auprès de Sigma-Aldrich Germany, Inc., dont la pureté est supérieure à 98 % (HPLC). Périodiquement, la glycémie et le poids corporel ont été mesurés, et des échantillons d'urine pour la mesure quantitative de l'albuminurie ont été recueillis dans des cages métaboliques. Les rats ont été sacrifiés sous anesthésie après 4 semaines, les reins ont été prélevés et pesés pour analyse histologique et extraction des protéines.

3. Albumine urinaire

Les échantillons d'urine ont été centrifugés à 10 000 rpm pendant 5 min pour éliminer les matières insolubles. Le surnageant a été aliquoté et stocké à -80°C jusqu'à son utilisation. Le kit ELISA pour l'albumine urinaire de rat de Chondrex (Redmond, WA) a été utilisé selon les instructions du fabricant.

4. Taux de clairance de la créatinine

Le kit de dosage de la créatinine (Nanjing Jiancheng, C011-2-1) a été utilisé pour la détermination de la créatinine dans le sang et l'urine. La Ccr a été calculée selon la formule : Ccr=(créatinine urinaire*volume urinaire 24 h)/(créatinine sanguine*24 h*60 min/h)/poids final (kg).

5. Coloration immunohistochimique et TUNEL

Les reins ont été coupés dans un microtome à trancher à 7–8 μm et fixés avec du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10 min. Le blocage a été effectué avec un tampon (PBS, 2% BSA, 10% FBS) pendant 1 h suivi d'une incubation de 10 min avec un second tampon (PBS, 0,4% Triton). L'anticorps primaire contre -SMA (Servicebio, GB13044) ou NPHS2 (Abcam, ab229037) a été incubé pendant 3 h à température ambiante dans une chambre humidifiée. Après lavage, les coupes ont été incubées avec de l'IgG de chèvre anti-souris Cy3 (H plus L) (Servicebio, GB21301), de l'IgG de chèvre anti-lapin conjugué HRP (H plus L) (Servicebio, GB23303) ou du TUNEL immunofluorescent (Servicebio, G1501 ) réaction dans une chambre humide (obscurité, 37 degrés, 1 h). Les coupes ont ensuite été contre-colorées au DAPI (Servicebio, G1012) pour la détection des noyaux. Enfin, les sections colorées ont été noyées dans la résistance au liquide d'étanchéité d'extinction de fluorescence et photographiées à l'aide d'un microscope à fluorescence (NIKON ECLIPSE C1, Japon).

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6. Culture cellulaire

Des cellules mésangiales rénales humaines (HRMC) ont été obtenues auprès de ScienCell Research Laboratories, Santiago, CA, et cultivées dans du milieu cellulaire mésangial (MsCM, ScienCell Research Laboratories). Les HRMC ont été étalés sur un flacon revêtu de poly-L-lysine (2 ug/cm2) et cultivés à 37 degrés dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2. Les cellules de cette expérience ont été utilisées en 3 à 4 passages et ont été examinées pour s'assurer qu'elles présentaient les caractéristiques spécifiques des cellules mésangiales. La lignée cellulaire de podocytes de souris MPC -5 a été obtenue auprès de l'ATCC, Maryland, États-Unis. Les cellules ont été cultivées sur du collagène de type I dans du RPMI 1640 (10% FBS) avec 50 U / ml d'IFN- à 33 degrés à 85% de confluence, puis transférées à 37 degrés sans IFN- pendant 10 à 14 jours pour la différenciation.

7. Essai de viabilité cellulaire et de prolifération

Le kit de comptage de cellules-8 (CCK-8) a été utilisé pour mesurer la prolifération et la viabilité cellulaires. Les cellules ont été ensemencées dans chaque puits de plaques de culture 96-puits (5 × 103 /puits). Après le traitement, 10 ul de CCK-8 (Beyotime, Shanghai, Chine) ont été ajoutés et incubés pendant 1 h à 37 °C. L'absorbance a été mesurée à l'aide d'un lecteur de microplaques (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis). à une longueur d'onde de 450 nm.

8. annexine V et coloration à l'iodure de propidium

Les cellules ont été étalées et cultivées jusqu'à ce qu'elles atteignent 60 % de confluence, puis traitées avec du glucose élevé (50 mmol/L) ou du telmisartan. Après 96 h, les cellules collectées ont été lavées avec du PBS froid et remises en suspension dans un tampon de liaison. L'annexine V-FITC et PI (eBioscience, Santiago, CA, États-Unis) ont été ajoutés à la suspension cellulaire conformément aux instructions du fabricant, et un échantillon de fluorescence de 10 000 cellules a été analysé par cytométrie en flux réalisée avec FACScan ( Becton, Dickinson, and Company, Franklin, NJ, États-Unis).

9. Western blot

Le cortex rénal, les HRMC et les MPC -5 ont été homogénéisés dans un réactif d'extraction de protéines tissulaires ou cellulaires (Beyotime) complété par des inhibiteurs de protéase et de phosphatase (Merck, Whitehouse Station, NJ, États-Unis). Les échantillons ont été séparés sur une SDS PAGE à 10 % et transférés sur une membrane de nitrocellulose (Pall Corporation, NY, États-Unis). La membrane a été bloquée avec de l'albumine de sérum bovin à 5 % et buvardée avec des anticorps. Anti-PKC 1 (Cell Signaling Technology, 46 809), anti-swiprosin-1 (Abcam, ab24368), TGF- 1 (Abcam, ab215715), Tubuline (Beyotime, AT819) et GAPDH (Beyotime, AF5009 ) ont été utilisés à une concentration de 1:1,000. Les protéines ont été visualisées à l'aide d'anticorps secondaires anti-souris ou anti-lapin conjugués à IRDye (Rockland, Limerick, PA, États-Unis) à 1 : 5,000. Utilisation du SYSTÈME D'IMAGERIE INFRAROUGE ODYSSEY (LI-COR) pour analyser les résultats.

10. Analyses statistiques

Le traitement des données a été analysé par Origin 6.1 (OriginLab, Northampton, MA) et exprimé en moyenne ± SD d'au moins trois expériences indépendantes. La signification statistique a été déterminée à l'aide de l'ANOVA. Une valeur de p < 0.05 a été considérée comme statistiquement significative.

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DISCUSSION

Le telmisartan est un bloqueur sélectif des récepteurs AT1 qui a été utilisé en clinique pour réduire l'hypertension artérielle et l'excrétion de protéines urinaires chez les patients hypertendus (Baden et al., 2008 ; Mann et al., 2009). Plusieurs essais cliniques ont suggéré que le telmisartan est efficace pour réduire la protéinurie chez les patients atteints de macroalbuminurie et retarder l'apparition et la progression de la néphropathie diabétique (Makino et al., 2005 ; Nakamura et al., 2010 ; Fujita et al., 2011 ; Schmieder et al. ., 2011). Dans la présente étude, le traitement oral par le telmisartan chez des rats diabétiques induits par la STZ a empêché l'apparition d'anomalies précoces au niveau rénal et global, notamment la diminution du poids corporel, de la glycémie et des protéines urinaires. Ces résultats ont confirmé que le telmisartan a une rénoprotection chez les souris atteintes de néphropathie diabétique à un stade précoce. Plus important encore, cette étude a révélé que l'effet protecteur du telmisartan sur les glomérules diabétiques se reflétait dans les effets anti-apoptotique et pro-apoptotique sur les podocytes et les cellules mésangiales, respectivement.

Les produits finaux de glycation avancée (AGE) pourraient causer des lésions et un détachement de l'ADN des podocytes en partie par la stimulation de l'axe Ang II-AT1R, fournissant ainsi une caractéristique bénéfique innovante du telmisartan dans la DKD (Fukami et al., 2013). Dans les maladies glomérulaires protéinuriques normotensives de bas grade, le traitement par telmisartan au stade précoce de la maladie atténue les lésions glomérulaires et tubulo-interstitielles (Villa et al., 2011). Et plusieurs voies sont probablement liées aux conséquences pléiotropes, notamment la signalisation du facteur de croissance, la cible mammifère de la signalisation de la rapamycine, l'ubiquitination des protéines, la voie de la caténine Wnt-bêta et la signalisation de l'hypoxie (Villa et al., 2011).

Récemment, nous avons signalé que la swiprosine-1 (Wang et al., 2018b), un autre nom pour le domaine de la main EF contenant 2 (EFhd2), jouait un rôle essentiel dans la progression de la DKD initiée après l'induction, alors qu'elle localisait dans les podocytes du glomérule de souris. L'absence de swiprosine -1 a amélioré l'apoptose des podocytes dépendante des mitochondries stimulée par l'hyperglycémie ou une glycémie élevée via la voie de signalisation p38 MAPK. Ici, nous avons également constaté que le telmisartan inhibait l'hyperglycémie ou l'expression induite par une forte teneur en glucose de la swiprosine-1 à la fois in vivo et in vitro, ce qui indiquait que l'effet anti-apoptose du telmisartan sur les podocytes pouvait être lié à la régulation de la swiprosine{ expression {12}}.

La prolifération des cellules mésangiales et le dépôt excessif de protéines de la matrice extracellulaire ont été reconnus comme contribuant au développement de la DKD (Lee et al., 2004). Des études antérieures ont montré qu'une glycémie élevée pouvait induire l'expression de protéines de la matrice extracellulaire mésangiale en cas d'hyperglycémie (Taniguchi et al., 2013). -SMA est généralement utilisé pour différencier les cellules mésangiales des autres cellules glomérulaires chez les souris diabétiques induites par STZ, et l'expression accrue de -SMA pourrait être le marqueur des changements phénotypiques des cellules mésangiales de la phase non activée à la phase proliférative et sécrétoire activée (Niu et al., 2014). Ici, nous avons constaté que le telmisartan diminuait l'expression de -SMA dans le glomérule diabétique. De plus, il a été rapporté que la prolifération des cellules mésangiales a un impact significatif sur la pathogenèse de la DKD (Zeng et al., 2013). Nos résultats dans cette étude reflétaient l'effet dépressif dépendant du temps et de la dose du telmisartan sur la prolifération des cellules mésangiales liée aux caractéristiques pro-apoptotiques.

Les preuves cliniques suggèrent que le telmisartan est plus efficace que le losartan pour améliorer la protéinurie chez les personnes hypertendues atteintes de DKD, ce qui peut être lié à sa capacité à agoniser partiellement le PPAR (Bichu et al., 2009). De plus, ces changements bénéfiques tels que la prévention de l'atrophie rénale et de la fibrose du telmisartan étaient liés à une diminution de l'expression du TGF 1 et d'autres gènes de cytokines pro-inflammatoires et profibrotiques via l'activation du PPAR/HGF (Kusunoki et al., 2012), indépendamment du blocage des récepteurs de l'Ang II de type 1. Ici, nous avons également trouvé que le telmisartan activait spécifiquement l'expression du gène PPAR dans les cellules mésangiales, et l'effet pro-apoptotique causé par le telmisartan sur les cellules mésangiales pouvait être atténué par les inhibiteurs de PPAR.

PKC 1 est l'une des familles largement exprimées de sérine-thréonine kinases qui transduisent un large éventail de progressions cellulaires par phosphorylation spécifique au substrat (Newton, 1995). Il a été rapporté que non seulement une activité accrue de la PKC, mais également ses niveaux d'ARNm sont observés dans les biopsies de néphropathie diabétique humaine (Langham et al., 2008). L'expression et l'activation de PKC induites par l'hyperglycémie ont des effets pléiotropes dans les cellules mésangiales, y compris la promotion d'une accumulation excessive de protéines ECM (Brownlee, 2001). Des études ont montré que l'inhibition de la PKC atténue l'hypercellularité glomérulaire et l'expansion de la matrice extracellulaire chez les souris db/db et le dysfonctionnement glomérulaire chez les rats STZ (Ishii et al., 1996 ; Koya et al., 2000). De même, l'inhibiteur de la PKC a atténué la prolifération des cellules mésangiales et la production de collagène induites par le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) (Tokuyama et al., 2011). Dans notre étude, le telmisartan a réduit la régulation à la hausse de l'ARNm de PKC 1 et l'expression des protéines dans les cellules mésangiales stimulées par l'hyperglycémie. De plus, l'expression de TGF 1 dans les cellules mésangiales induite par une glycémie élevée pourrait également être inhibée par le telmisartan.

Les récepteurs AT1 et AT2, bien connus sous le nom de sept récepteurs couplés aux protéines G transmembranaires, ont été clonés et illustrés pharmacologiquement (Touyz et Berry, 2002). Les récepteurs AT1 peuvent être sélectivement antagonisés par le telmisartan, tandis que les bloqueurs des récepteurs AT1 peuvent induire l'expression des récepteurs AT2 (Touyz et Berry, 2002). Des études ont montré que les récepteurs AT1 exercent leurs influences en limitant la croissance cellulaire et en provoquant l'apoptose (Horiuchi et al., 1997 ; Touyz et al., 1999). De plus, les récepteurs AT2 induisent l'apoptose cellulaire dans une conformation spécifique via la signalisation apoptotique médiée par p38 MAPK (Miura et Karnik, 2000). Dans notre présent article, l'expression des ARNm AT1 et AT2 était inchangée dans les cellules mésangiales cultivées stimulées par le telmisartan ou l'hyperglycémie. Par conséquent, l'apoptose des cellules mésangiales induite par le telmisartan et la diminution de l'expression de PKC 1 pourraient ne pas être médiées par les récepteurs AT1 et AT2.

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En conclusion, le telmisartan a atténué les lésions glomérulaires précoces chez les rats diabétiques de type 1 en inhibant l'apoptose des podocytes et en favorisant l'apoptose mésangiale. L'effet anti-apoptotique du telmisartan dans les podocytes peut être lié à son inhibition de l'expression de la swiprosine-1, tandis que l'effet pro-apoptotique sur les cellules mésangiales était partiellement associé à son effet agoniste sur le PPAR . De plus, le telmisartan a bloqué sélectivement l'expression de PKC 1/TGF 1 dans les cellules mésangiales mais pas dans les podocytes. Des études avancées sont nécessaires pour élucider les effets opposés mais bénéfiques du telmisartan sur les podocytes et les cellules mésangiales et les mécanismes moléculaires sous-jacents.

Xin Wei 1, Yabin Ma2, Ya Li 3, Wenzhao Zhang4, Yuting Zhong5, Yue Yu6, Li-Chao Zhang5, Zhibin Wang4 et Ye Tu2

1 Département de pharmacie clinique, Hôpital Xinhua, École de médecine de l'Université Jiaotong de Shanghai, Shanghai, Chine,

2 Département de pharmacie, Shanghai East Hospital, Université Tongji, Shanghai, Chine,

3 Département de pharmacie clinique, centre d'essais cliniques, premier hôpital affilié de la première université médicale du Shandong et hôpital provincial Qianfoshan du Shandong, Jinan, Chine,

4 Department of Critical Care Medicine, School of Anesthesiology, Naval Medical University, Shanghai, Chine,

5 Département de pharmacie, Hôpital municipal de médecine traditionnelle chinoise de Shanghai, Shanghai, Chine,

6 Institute of Vascular Disease, Shanghai TCM-Integrated Hospital, Shanghai, Chine