L'état actuel de la neuroprotection dans les cardiopathies congénitales, partie 1

Abstrait:

La présence d’ADN ectopique dans le cytoplasme induit une inflammation et la mort cellulaire. Il a été largement rapporté que la fuite d'ADN nucléaire dans le cytoplasme peut être principalement détectée par la cyclique GMP-AMP synthase (cGAS).

L'ADN est la molécule qui précise les informations génétiques de chaque personne et se trouve dans chacune de nos cellules. Des recherches récentes montrent que l’ADN peut s’infiltrer dans le cytoplasme par certaines voies et affecter notre mémoire.

Ce phénomène est fréquent chez les personnes âgées et les personnes souffrant de troubles cognitifs. Lorsque l’ADN s’infiltre dans le cytoplasme, il interfère avec les fonctions normales de la cellule et augmente le risque de perte de mémoire et de troubles cognitifs.

Cependant, nous ne devons pas nous sentir déprimés ou désespérés à ce sujet. Il existe de nombreuses façons d’améliorer la mémoire et les capacités cognitives pour nous aider à maintenir un cerveau en bonne santé.

Premièrement, vous devez maintenir un mode de vie sain. Cela inclut une alimentation équilibrée, un sommeil suffisant, une activité physique modérée et une réduction du stress. Ces pratiques favorisent la santé cérébrale, évitant ainsi les fuites d’ADN et améliorant la mémoire.

Deuxièmement, un entraînement cognitif est nécessaire. Cela peut inclure des jeux mathématiques, la lecture, l’apprentissage de nouvelles compétences, etc. Ces activités peuvent aider à stimuler le cerveau et favoriser la neurogenèse pour éviter les fuites d’ADN.

Enfin, gardez une attitude positive. L’instabilité émotionnelle et le stress excessif peuvent provoquer des changements dans la chimie du cerveau qui favorisent les fuites d’ADN. Par conséquent, nous devons apprendre à affronter les défis de la vie de manière positive et à maintenir une attitude optimiste.

En résumé, même si les fuites d’ADN dans le cytoplasme peuvent affecter la mémoire, nous pouvons améliorer la santé cérébrale, éviter les fuites d’ADN et, à terme, améliorer notre mémoire en adoptant un mode de vie approprié, en nous engageant dans un entraînement cognitif et en maintenant un état d’esprit positif. Mémoire et capacités cognitives. On peut voir que nous devons améliorer la mémoire, et la Cistanche deserticola peut améliorer considérablement la mémoire car la Cistanche deserticola est une matière médicinale traditionnelle chinoise qui a de nombreux effets uniques, dont l'un est d'améliorer la mémoire. L'efficacité de Cistanche deserticola provient des multiples ingrédients actifs qu'elle contient, notamment l'acide tannique, les polysaccharides, les glycosides flavonoïdes, etc. Ces ingrédients peuvent favoriser la santé cérébrale par diverses voies.

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Nous avons récemment signalé que l'ADN double brin cytoplasmique (ADNdb) dérivé des mitochondries qui a échappé à la dégradation lysosomale induit une cytotoxicité significative dans les cellules en culture et in vivo. On suppose que l’ADN mitochondrial cytoplasmique est impliqué dans diverses maladies et troubles, et de plus en plus d’articles ont été publiés le confirmant. D’un autre côté, la méthode actuelle d’évaluation de l’ADN mitochondrial dans le cytoplasme n’est peut-être pas quantitative.

Ici, nous présentons en détail une méthode pour évaluer les cellules d’ADN mitochondrial ectopique. Cette méthode est utile dans la recherche fondamentale ainsi que dans l'étude du vieillissement, de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer, de l'insuffisance cardiaque, des maladies auto-immunes, du cancer et d'autres affections.

Mots clés : ADN ectopique ; l'ADN mitochondrial ; facteur de transcription mitochondrial A (TFAM) ; maladie de Parkinson.

1. Introduction

L'ADN contient des informations importantes pour la survie et l'héritage, et il doit être protégé contre divers facteurs de stress, notamment les oxydants et les mutagènes. Les cellules eucaryotes contiennent des mitochondries, qui produisent de l'énergie, ainsi que de nombreuses espèces actives d'oxygène, par la respiration aérobie.

Ainsi, dans la cellule eucaryote, l’ADN existe dans le noyau ou les mitochondries, respectivement emballés à l’intérieur de la membrane nucléaire ou de la membrane mitochondriale. Cependant, l’ADN peut être présent dans le cytoplasme dans certaines conditions, comme lors d’infections virales ou non virales [1– 4].

Même dans certaines conditions non infectieuses (par exemple, le vieillissement ou divers troubles liés à l'âge ou le cancer), l'ADN peut s'échapper dans le cytoplasme à partir du noyau ou des mitochondries [5-7].

L'ADN présent dans le cytoplasme peut être inflammatoire et toxique pour les cellules. Il a été largement rapporté que la fuite d'ADN nucléaire dans le cytoplasme induit une inflammation, une cytotoxicité et un phénotype sécrétoire associé à la sénescence (SASP), principalement via le stimulateur cyclique de la GMP-AMP synthase (cGAS) de la voie des gènes de l'interféron (STING). 5,6].

Nous avons récemment rapporté que l'ADN double brin cytosolique (ADNdb) d'origine mitochondriale échappant à la dégradation lysosomale induisait une cytotoxicité et une neurodégénérescence dans des modèles cellulaires de la maladie de Parkinson [8]. La présence ou l'augmentation d'un tel ADN ectopique était souvent indiquée par des images microscopiques représentatives et des preuves circonstancielles, et non par l'augmentation des fuites d'ADN elle-même.

On s'attend à ce que l'évaluation de cet ADN ectopique devienne de plus en plus importante, non seulement pour la recherche fondamentale mais aussi pour la recherche sur le vieillissement et d'autres maladies, comme la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, la sclérose latérale amyotrophique, l'insuffisance cardiaque, les maladies auto-immunes, le diabète, stéatohépatite non alcoolique (NASH) et cancers. Il a été rapporté que la voie cGAS – STING est cruciale non seulement dans le vieillissement, mais également dans la pathogenèse de ces maladies (8–17).

Probablement en raison des circonstances oxydatives autour des mitochondries et de l'absence d'un système efficace de réparation de l'ADN mitochondrial, l'ADN mitochondrial est beaucoup plus susceptible aux mutations ou aux dommages que l'ADN nucléaire (18, 19).

Contrairement à l'ADN nucléaire, l'ADN mitochondrial existe en plusieurs copies dans une seule cellule et est synthétisé selon les besoins. Par conséquent, l'ADN mitochondrial pourrait avoir beaucoup plus de chances d'être divulgué dans le cytoplasme au cours du vieillissement ou dans des conditions malignes telles que des troubles liés à l'âge, un dysfonctionnement mitochondrial. , ou des cancers.

La détection et la mesure de cet ADN cytoplasmique mitochondrial pourraient être importantes pour comprendre la pathogenèse de diverses maladies et le vieillissement et pourraient devenir un biomarqueur et une cible thérapeutique.

Nous avons développé une méthode semi-quantitative pour évaluer l'ADN mitochondrial ectopique qui s'échappe dans le cytoplasme, et nous décrivons ici la méthode en détail. Cet article permet une évaluation objective des fuites d’ADN mitochondrial et est utile dans l’étude de diverses pathologies.

2. Matériels et méthodes

2.1. Lignées cellulaires, traitement siARN et analyse PCR quantitative (qPCR)

Les cellules HeLa étaient dérivées de cellules cancéreuses du col de l'utérus provenant d'une patiente (ATCC, CCL-2). Les cellules HeLa ont été cultivées à 37 °C sous 5 % de CO2 dans du EagleMedium modifié de Dulbecco (DMEM) (Nacalai Tesque, Kyoto, Japon) additionné de 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) (Biowest, Nuaillé, France) et d'une solution de pénicilline-streptomycine ( 100 unités/mL de pénicilline G et 100 µg/mL de sulfate de streptomycine, Wako, Osaka, Japon).

Un jour avant la transfection, les cellules HeLa ont été étalées à une densité de 600 cellules/µL. L'expression des gènes d'intérêt a été inhibée dans les cellules HeLa en utilisant le siRNA Stealth RNAi (facteur de transcription mitochondrial A, TFAM : HSS144251, glucocérébrosidase, GBA : HSS178140, Thermo FisherScientific, Waltham, MA, USA) dans le réactif de transfection Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) selon les instructions du fabricant (une concentration finale en ARN de 10 nM).

Trois jours après l'inactivation du siARN, l'ARN cellulaire total a été isolé à l'aide du TRIzolreagent conformément aux instructions du fabricant (Thermo Fisher Scientific). Les modèles d'ADNc ont été synthétisés à partir de l'ARN purifié à l'aide du kit de synthèse ProtoScript II First StrandcDNA (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) avec des amorces oligo (dT) 20. La qPCR a été réalisée à l'aide de TB Green Premix Ex Taq II (Takara Bio, Kusatsu , Japon) et analysés dans un Thermal Cycler Dice Real Time System Lite (Takara Bio). Les amorces PCR utilisées dans la présente étude étaient GBA forward (TGCTGCTCTCAACATCCTTGCC), GBA reverse (TAGGTGCGGATGGAGAAGTCAC), TFAM forward (GGCAAGTTGTCCAAAGAAACC), TFAM reverse (GCATCTGGGGTTCTGAGCTTTA), Glycéraldéhyde-3-Phosphate Déshydrogénase (GAPDH) forward (CAGCCTCAAGATCATCAGCA) et GAPDH. inverse (TGTGGTCATGAGTCCTTTCCA).

Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel GraphPad Prism version 9.3.1 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Des tests t de Student bilatéraux ont été utilisés pour comparer les moyennes arithmétiques entre deux groupes. Les données sont présentées sous forme de moyennes et d'erreurs types des moyennes.

2.2. Détection par immunofluorescence de l'ADN mitochondrial ectopique et analyse d'images

Un jour avant la transfection, les cellules HeLa ont été étalées à une densité de 600 cellules/µL. L'expression des gènes d'intérêt a été inhibée dans les cellules HeLa en utilisant le siRNA Stealth RNAi (Thermo Fisher Scientific) dans le réactif de transfection Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher Scientific) selon le instructions du fabricant (une concentration finale d'ARN de 10 nM).

Trois jours après l'inactivation du siARN, les cellules ont été soumises à une coloration par immunofluorescence. Pour la détection de l'ADN mitochondrial, anticorps anti-ADNdb (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni, clone 35I9, Cat# ab27156, RRID : AB_470907 ou EMD Millipore, Billerica, MA, USA, clone AC-30-10 , Cat# CBL186, RRID : AB_11213573) a montré un meilleur rapport signal/bruit que Hoechst 33258, DAPI ou Picogreen. Ici, nous avons combiné trois anticorps primaires : un anticorps anti-ADNdb (ADN 35I9) (Abcam, Cat# ab27156, RRID : AB_470907), un anticorps anti-histone-H2B (Abcam, Cat# ab134211) et un anti-chaleur. anticorps anti-protéine de choc -60 (Hsp60) (Abcam, Cat# ab46798, RRID : AB_881444).

D'autres anticorps peuvent être choisis ou marqués par fluorescence avec l'histone, ou Hsp60 peut être utilisé en alternative, mais il est nécessaire d'optimiser les conditions de triple coloration pour chaque combinaison.

Les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixées avec du méthanol glacé pendant 10 min à 4 ◦C. Alternativement, 4 % de paraformaldéhyde (PFA) peuvent être utilisés pour la fixation, mais les signaux de fond semblent beaucoup plus élevé dans les échantillons fixés avec du PFA. Après fixation, les cellules ont été lavées trois fois avec une solution saline tamponnée au phosphate avec du Tween 20 (PBST) pendant 5 minutes chacune. Les cellules ont été perméabilisées avec du PBS contenant 0,2 % (p/v) de Triton X-100 pendant 10 min.

Après avoir été lavées trois fois avec du PBST pendant 5 min à chaque fois, les cellules ont été incubées avec 2 % (p/v) d'albumine sérique bovine (BSA) dans du PBST pendant 30 min. Les cellules ont été incubées avec un anticorps primaire unique, un anticorps anti-histone-H2B (1/400, Abcam, Cat# ab134211) dilué dans 2 % (p/v) de BSA dans du PBST O/N à 4 °C. Après avoir été lavées trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque fois, les cellules ont été incubées avec un Alexa Fluor 488- AffiniPure Donkey anti-Chicken IgY (IgG) (H+L) (1/200, Wako, Cat# {{17 }}) dilué dans 2 % (p/v) de BSA dans du PBST pendant 1 heure à température ambiante (RT).

Après avoir été lavées trois fois pendant 5 minutes à chaque fois avec du PBST, les cellules ont été incubées avec des anticorps primaires et des anticorps anti-ADNdb (ADN 35I9) (1/800, Abcam, Cat# ab27156, RRID : AB_470907) et anti -Les anticorps Hsp60 (1/400, Abcam, Cat# ab46798, RRID : AB_881444) dilués dans 2 % (p/v) de BSA dans du PBST ont été appliqués pendant 1 heure à température ambiante ou toute la nuit (O/N) à 4◦C.

Après avoir été lavées trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque fois, les cellules ont été incubées avec des IgG(H+L) anti-lapin d'âne hautement adsorbées de manière croisée avec Alexa Fluor 680-conjugué (1/200, Thermo Fisher Scientific, Cat# A10043). , RRID : AB_2534018) ​​et Donkeyanti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor® 594) (1/200, Abcam Cat# ab150108, RRID : AB_2732073) dilués dans 2 % (p/v) BSA dans PBST pendant 1 heure à température ambiante.

Les cellules ont été lavées trois fois avec du PBST pendant 5 minutes à chaque fois et l'échantillon a été analysé à l'aide d'un microscope confocal A1R+ (Nikon, Tokyo, Japon).

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