L'effet du facteur de croissance nerveuse sur le soutien de la mémoire spatiale dépend de l'innervation cholinergique de l'hippocampe
Mar 17, 2022
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Résumé
La thérapie génique du facteur de croissance nerveuse (NGF) a été utilisée dans des essais cliniques sur la maladie d'Alzheimer. Comprendre le mécanisme sous-jacent de l'influence du NGFMémoirepeut aider à développer de nouvelles stratégies de traitement. Le NGF et le système cholinergique jouent tous deux un rôle important dans l'apprentissage etMémoire. Le NGF est essentiel pour maintenir l'innervation cholinergique de l'hippocampe, mais c'est sous la question de savoir si l'effet de soutien du NGF sur l'apprentissage etMémoiredépend spécifiquement de l'innervation cholinergique hippocampique intacte. Ici, nous caractérisons le comportement et les mesures hippocampiques du volume, de la neurogenèse, de la potentialisation à long terme et de l'innervation cholinergique, chez des souris déficientes en Ngf spécifiques au cerveau. Nos résultats montrent que les souris knock-out présentent une anxiété accrue, une altération de l'apprentissage spatial et de la mémoire, une diminution du volume de l'hippocampe adulte, une neurogenèse, une potentialisation à court terme et une innervation cholinergique. La surexpression de Ngf dans l'hippocampe de souris knock-out pour le gène Ngf a été sauvéeMémoireet innervations cholinergiques partiellement restaurées, mais pas d'anxiété. L'épuisement sélectif de l'innervation cholinergique de l'hippocampe a entraîné une altération de l'espaceMémoire. Cependant, la surexpression de Ngf dans l'hippocampe n'a pas réussi à sauver l'espaceMémoirechez des souris présentant une déplétion sélective des fibres cholinergiques dans l'hippocampe, En conclusion, nous démontrons l'impact d'une déficience en Ngf dans le cerveau et apportons la preuve que l'effet du NGF surMémoirerepose sur des innervations cholinergiques intactes dans l'hippocampe. Les résultats suggèrent qu'un ciblage cholinergique adéquat peut être une condition essentielle pour une utilisation réussie de la thérapie génique NGF de la maladie d'Alzheimer.
Wei Zheng Eu1, Yu-Ju Chen1, Wei-Ting Chen1, Kuan-Yu Wu1, Cheng-Yu Tsai1, Sin-Jhong Cheng2,
Roderick N. Carter3 et Guo-Jen Huang 1,4,5
Introduction
Le facteur de croissance nerveuse (NGF), un facteur de croissance neurotrophique identifié pour la première fois dans les années 1950, favorise la croissance des neurites et stimule la différenciation des cellules nerveuses dans les expériences de culture1–3. Dans le cerveau, l'expression la plus élevée d'ARNm de Ngf se trouve dans l'hippocampe4. Le NGF active deux récepteurs : le récepteur NGF de faible affinité (récepteur neurotrophique commun, p75) et le récepteur NGF de haute affinité (TrkA), qui sont tous deux exprimés dans les neurones cholinergiques du cerveau antérieur basal5,6 et sont connus pour innerver la structure hippocampique7. Les preuves suggèrent que le NGF est libéré des cellules cibles et déclenche les voies de signalisation de manière rétrograde le long de l'axone8. Il existe un lien étroit entre le NGF et le système cholinergique de l'hippocampe. L'injection de NGF dans les ventricules latéraux augmente l'activité de la choline acétyltransférase (ChAT) dans l'hippocampe9. De plus, il a été démontré que le NGF protège les neurones cholinergiques du prosencéphale basal après une lésion axonale des fibres saillantes de l'hippocampe10.
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Plusieurs hypothèses ont été proposées pour la cause de la maladie d'Alzheimer. L'une d'entre elles est l'hypothèse NGF11. Depuis le début des années 1980, plusieurs rapports ont montré qu'un dysfonctionnement cholinergique important survenait chez les personnes âgées démentes et que la dégénérescence neuronale cholinergique était associée à des déficits cognitifs dans la maladie d'Alzheimer1.
Le nouveau radiotraceur de tomographie par émission de positrons (TEP) 18F-fluoro éthoxy benzène point-virgule a fourni des preuves plus récentes qu'il existe une perte terminale cholinergique plus corticale chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer13. Des études animales fournissent également des preuves que la densité des innervations cholinergiques diminue chez les rats âgés et les souris transgéniques ressemblant à la maladie d'Alzheimer14,15. De plus, les souris anti-NGF âgées présentent des phénotypes de type maladie d'Alzheimer, tels que la perte neuronale, les déficits cholinergiques et les troubles de la mémoire spatiale16. Une étude récente suggère que la voie métabolique du NGF est altérée chez les patients atteints de la maladie d'Alzheimer, constatant que la machinerie moléculaire de la maturation du proNGF est réduite tandis que celle de la dégradation du NGF mature est améliorée17.
Le système cholinergique central est impliqué dans l'apprentissage18,19 et le NGF semble jouer un rôle important dans ce soutien. L'infusion de NGF par voie intraventriculaire peut sauver à la fois une déplétion cholinergique légère dans l'hippocampe et des déficits de mémoire chez des souris hétérozygotes Ngf plus /- mutantes20. Les preuves montrent également que le NGF module la force des projections cholinergiques vers l'hippocampe et affecte la plasticité neuronale et la rétention du comportement d'apprentissage spatial21. Cependant, on ignore si les effets du NGF sur l'apprentissage dépendent de ces projections cholinergiques vers l'hippocampe. La clarification de ceci peut fournir une meilleure compréhension pour développer un traitement pour la maladie d'Alzheimer. Dans cette étude, nous avons abordé cette question en utilisant des souris knock-out conditionnelles Ngf (cKO) spécifiques au cerveau pour révéler l'importance du NGF dans l'anxiété et la mémoire spatiale. De plus, nous avons constaté que l'effet du NGF sur la mémoire spatiale, mais pas sur l'anxiété, nécessite la projection cholinergique vers l'hippocampe.
Matériaux et méthodes
Animaux
Des expériences ont été réalisées sur des cohortes équilibrées par sexe de souris Ngf cKO âgées d'une semaine 12- et de souris de même portée de type sauvage (WT). Des souris Ngf floxées du National Laboratory Animal Center, Taiwan, (RMRC 13175) et des souris Sox1 :: Cre (Acc. No. CDB0525K) 22 ont été utilisées pour générer Ngf flox/flox ; Souris Sox1 :: Cre dans cette étude. Ngf flox/flox ; Les souris Sox1 :: Cre (cKO) et Ngf flox/flox (WT) utilisées dans cette étude étaient des compagnons de portée générés par le croisement Ngf flox/flox ; Souris Sox1::Cre avec des souris homozygotes Ngf flox/flox. Des souris mâles C57BL/6Narl âgées de 12 semaines ont été utilisées pour la dénervation cholinergique de l'hippocampe. Les souris se sont reproduites dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques certifiées AAALAC. Ils ont été logés dans un cycle lumière-obscurité de 12 : 12 h à une température de 22 degrés et un taux d'humidité de 60 à 70 %. Les animaux avaient un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux réglementations locales et ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de Chang Gung (numéro de permis : CGU105-033).
Tests comportementaux
Pour les tests comportementaux, le mouvement des animaux a été enregistré et suivi à l'aide d'un système d'enregistrement vidéo. Les souris pour effectuer l'analyse comportementale ont été randomisées dans une cage séparée pour les tests, avec de la literie, de la nourriture et de l'eau, avant d'être transférées dans la cage d'origine. Tous les labyrinthes sont en acrylique; il n'y a pas de litière dans le labyrinthe pendant le test. Toutes les données comportementales ont été enregistrées et acquises automatiquement par le logiciel Ethovision.
Champ ouvert
Les souris ont été placées dans un champ ouvert rond avec un rayon =45 cm et un cercle intérieur avec un rayon =30 cm. Ils ont été autorisés à se déplacer librement pendant 5 minutes et ont été suivis par le logiciel Ethovision.
Plus-labyrinthe surélevé
L'appareil utilisé pour le test du labyrinthe surélevé (EPM) consistait en deux bras ouverts (30 × 5 cm) et deux bras fermés de même taille, avec des murs de 15 cm de haut. Le labyrinthe était surélevé de 38 cm au-dessus du sol. Les souris ont été placées dans l'EPM pendant 5 min avec une lumière tamisée et le temps passé dans le bras ouvert a été mesuré.
Labyrinthe d'eau de Morris
Cela a été réalisé dans un réservoir de labyrinthe d'eau rond (110 cm de diamètre, 50 cm de profondeur) situé dans une pièce lumineuse. La piscine a été remplie à une profondeur de 15 cm avec de l'eau rendue opaque par l'ajout de peinture blanche non toxique. Une plate-forme d'évacuation carrée (9 × 9 cm) a été immergée à 0,5 pm sous la surface de l'eau, en position fixe dans l'un des quadrants. Les souris ont été entraînées pendant 4 jours. Chaque jour d'entraînement, les souris ont reçu quatre essais d'entraînement. L'intervalle entre les essais était de 15 min. Lors de chaque essai, les souris ont été placées dans la piscine à l'un des quatre emplacements de départ. Les souris ont été autorisées à nager/rechercher pendant un maximum de 90 s ou jusqu'à ce qu'elles trouvent la plate-forme, et ont été autorisées à rester sur la plate-forme pendant 30 s. Si la souris ne parvenait pas à trouver la plate-forme lors d'un essai donné, la souris était guidée vers la plate-forme. Huit jours après le dernier essai, pour le test de mémoire, la plate-forme a été retirée du pool et la souris a été autorisée à la rechercher pendant les années 90. L'acquisition et l'analyse des données ont été effectuées automatiquement, y compris la longueur du parcours de nage des essais d'entraînement et le pourcentage de temps passé dans le quadrant cible pour le test de mémoire.
Nouvelle reconnaissance d'objets
Les souris ont été autorisées à se familiariser avec deux cylindres acryliques blancs identiques (hauteur =9 cm, diamètre=5 cm) pendant 15 min par jour, pendant 2 jours. Les objets se trouvaient dans un emplacement fixe dans une chambre blanche. Au cours de la phase de test du troisième jour, l'un des objets exposés a été remplacé par un verre à shot gris (hauteur=8.7 cm, diamètre=5cm)fixé à l'envers dans la chambre et l'autre objet a été remplacé par un nouveau cylindre en acrylique blanc identique. Le temps passé à explorer chacun des objets a été collecté et analysé par le logiciel Ethovision.
Analyse volumétrique hippocampique
Toutes les analyses d'imagerie par résonance magnétique (IRM) ont été réalisées à l'aide de ClinScan 70/30 USR (Bruker BioSpin, Ettlingen, Allemagne) avec une bobine à réseau phasé adaptée à la tête de la souris. Une séquence d'écho de gradient tridimensionnelle (3D) a été choisie pour acquérir des images multi-tranches cérébrales avec les paramètres suivants : temps de répétition =30 ms ; temps d'écho=15 ms ; angle de retournement=20" ; nombre de moyennes=5 ; épaisseur de tranche =0.2 mm ; résolution dans le plan=256×256 ; taille de voxel=59×59 ×200 μm².Le temps d'acquisition total était d'environ 15 min avec 1-2 % d'Isoflurane comme anesthésique. Le volume de l'hippocampe a été mesuré avec PMOD 3.2 (PMOD Technologies. Suisse). Les hippocampes ont été délimités manuellement sur 13 ou 14 tranches coronales par animal ; le volume de chaque tranche a été obtenu en multipliant la zone délimitée par l'épaisseur de la tranche (0,2 mm). Le volume total du cerveau a été mesuré à l'aide de zones délimitées manuellement sur 19 tranches sagittales par animal, multipliant la zone délimitée à l'épaisseur de la tranche (0,2 mm). mm) Les images ont été analysées dans les mêmes conditions en aveugle.
quantification de l'ARNm
Le tissu hippocampique a été prélevé sur des souris WT et cKO, puis homogénéisé dans du Trizol, suivi d'une extraction au phénol-chloroforme de l'ARN total. L'ADNc a ensuite été fabriqué en utilisant la transcriptase inverse SuperScript III (Invitrogen). Les expériences ont été réalisées en double. Les niveaux d'expression génique ont ensuite été calculés avec la méthode △ACt et normalisés par rapport à un contrôle Gapdh. Ng-Avant : 5'-TTCTA TACTG GCCGC AGTGA-3 ; Ngf-Inverse 5-TTAGT CCAGT GGGCT TCAGG-3'
Dosage de la corticostérone
Des échantillons de sang ont été prélevés entre 19h30 et 20h00 par ponction de la veine faciale et ont été collectés dans des tubes Microvette" CB300 LH. Le plasma a été séparé du sang total par centrifugation et a été stocké dans des tubes à centrifuger à{{5} }"C jusqu'à l'analyse. Pour analyser, les échantillons ont été dilués dans du tampon (1/40), puis analysés par un kit Corticostérone EIA (Enzo Life Sciences) selon les instructions du fabricant, comme décrit précédemment.
Préparation de vecteurs viraux et injections intra-hippocampiques
Pour l'expérience de surexpression de Ngf, fragments d'ADN codant pour Ngf (RefSeq NM 013609) ou améliorés. Des protéines fluorescentes vertes (eGFP) ont été créées par PCR et sous-clonées dans le site Note d'une construction de virus AAV9. Les vecteurs AAV9 recombinants ont été produits par une méthode standard de transfection à triple plasmide et ont été purifiés par deux cycles de centrifugation Csd. Les titres de vecteurs physiques des AAV ont été quantifiés en mesurant le nombre de génomes de vecteurs emballés à l'aide d'une méthode de PCR en temps réel.
Pour les injections de vecteur viral, la chirurgie a été réalisée sous anesthésie (mélange Zoletil-Rompun). Les souris ont reçu des injections bilatérales de vecteurs viraux dans l'hippocampe dans un volume de 1,5 ul sous guidage stéréotaxique. Il y avait quatre sites d'injection au total (pour l'hippocampe dorsal, Antérieur-Postérieur(AP)-22 mm. Médial-Latéral (ML)±2.0 mm du bregma, et Dorsal-Ventral ( DV)-10,8 mm de la dure-mère ; pour l'hippocampe ventral, AP-3.0mm, ML ±3.0 et DV-3 .3mm). La concentration finale du vecteur AAV injecté était de 3,1 ×10 12vg/ml.
Immunohistochimie/hybridation et quantification in situ
Toutes les sections pour le marquage de Ki67, Doublecortin (DCX,5-Bromo-2'-désoxyuridine(BrdU)/NeuN et ChAT ont été coupées à une épaisseur de 40μm sur un microtome coulissant Les sections ont été montées sur des diapositives SuperFrost et séchées pendant la nuit Par la suite, les diapositives ont été incubées dans un tampon citrique 0,01 mol / L pendant 20 min à 90 * C, 3% HaO, pendant 10 min, rincées dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), et incubé pendant une nuit à température ambiante avec un anticorps de lapin anti-Ki67 (1:3000, Abcam), un anticorps de lapin anti-DCX (1:4000, Abcam) et un anticorps anti-ChAT (1:200, Abcam). La procédure standard du kit IgG ABC de lapin (Vector Lab) a été utilisée et les lames ont réagi pendant 5-10 min avec un comprimé Sigma DAB. Les coupes ont ensuite été recouvertes de DPX.
Pour le double marquage BrdU/NeuN, les coupes ont été incubées dans du HCl 2N pendant 15 minutes à 37"C, neutralisées dans du borate de sodium (Sigma) pendant 10min (pH 8,5) et lavées trois fois dans du PBS avant incubation avec du rat anti-BrdU (1:1500, Abcam) et anti-NeuN de souris (1:1000, Millipore). Après trois lavages dans du PBS (5 min chacun), les coupes ont été incubées avec l'anticorps secondaire fluorescent (1:250, Alex Fluor 488 et Texas Red, Invitrogen) pendant 2 h dans du Triton/PBS à 0,3 % avec 2 % de sérum de chèvre.
Pour l'hybridation in situ Ngf, la sonde Ngf (numéro de catalogue 565131) et le kit de réactifs RNAscope 2.5 HD Brown (Advanced Cell Diagnostics, États-Unis) ont été utilisés et la coloration a été effectuée conformément au manuel du produit. En bref, les lames ont été incubées dans un tampon de récupération 1 × pendant 5 min à 100 ° C, 3% H, O, pendant 10 min et rincées dans un tampon de lavage 1 ×. Les lames ont ensuite été incubées dans de la protéase pendant 20 minutes et, par la suite, dans une sonde cible pendant 2 heures à 40"C. Après une série d'amplifications, du DAB a été utilisé pour visualiser l'ARN.
Les cellules DCX, Ki67-marquées et BrdU/NeuN doublement marquées ont été comptées toutes les huitièmes sections sur toute l'étendue rostrocaudale de la couche de cellules granulaires (six sections par animal). Le nombre de cellules comptées a ensuite été multiplié par 16, pour obtenir une estimation du nombre total de cellules DCX, Ki67 et BrdU positives dans le gyrus denté. Toutes les lames ont été randomisées et codées avant l'analyse quantitative. Les somates cellulaires marqués au ChAT ont été comptés sur chaque deuxième section à travers l'étendue rostrocaudale du noyau du membre vertical de la bande diagonale (VDB) et du septum médial (MS) (quatre sections par animal). Pour une image représentative du double marquage BrdU/NeuN, une image z-stack (sept tranches dans la pile) a d'abord été acquise sous un objectif x40, suivie d'une déconvolution 3D avec un mode itératif rapide à l'aide du logiciel Axiovision Microimaging (Carl Zeiss).
Les fibres cholinergiques ont été visualisées en coloration ChAT et examinées en champ sombre, sous objectif ×10 (Axio Imager 2, capturé par Nikon D5100). La densité de fibres a été quantifiée en tant qu'intensité moyenne (valeur de gris moyenne) du signal seuillé sous la zone hippocampique avec l'image 142g (NIH), la densité de fibres cholinergiques hippocampiques a été quantifiée unilatéralement sur chaque huitième section à travers toute l'étendue rostrocaudale de l'ensemble de l'hippocampe.
Électrophysiologie dans des tranches d'hippocampe
Les tranches d'hippocampe (450 um d'épaisseur) ont été coupées transversalement avec une trancheuse de tissu vibrante (DSK Microslicer DTK-1000 ; Dosaka EM, Kyoto, Japon). Les tranches ont été laissées récupérer pendant au moins 120 min et ont été transférées dans une chambre d'enregistrement de type immersion montée sur un microscope droit (BX51Wl; Olympus Optical, Kyoto, Japon) équipé d'une vidéo microscopique à contraste d'interférence différentiel infrarouge. Du liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné (5 % de CO et 95 % d'O) contenant de la picrotoxine 0,1 mM a été perfusé dans la chambre d'enregistrement à un débit de 1-2 ml/min. Une électrode de stimulation bipolaire en acier inoxydable (Frederick Haer Company, Bowdoinham, ME) (impédance de 10 Meg-ohm) et une pipette en verre remplie de 3 M de NaCl ont été positionnées dans le stratum radiatum de CA1 pour évoquer et enregistrer les potentiels post-synaptiques excitateurs (fEPSPs ) activité, respectivement. La facilitation d'impulsions jumelées (PPF) a été étudiée à divers intervalles interstimulus et chaque intervalle interstimulus a appliqué deux impulsions de courant de courte durée (40 μs) toutes les 20 secondes pendant au moins quatre fois. Les rapports des pentes initiales de la deuxième réponse fEPSP/première réponse fPSP ont été mesurés pour l'analyse des données. Pour les expériences de potentialisation à long terme (LTP), une activité fPSP de base stable a été évoquée toutes les 20 secondes pendant au moins 20 min, une stimulation à haute fréquence (HFS)-LTP a ensuite été induite à l'aide de 5 trains de 100 impulsions à 100 Hz avec un intervalle inter-souches de 20s. Les traces électrophysiologiques ont été amplifiées avec un amplificateur (Multiclamp 700 B; Axon Instruments, Union City, CA). Tous les signaux ont été filtrés passe-bas à 1 kHz et numérisés à 10 kHz à l'aide d'une interface CED Micro 1401 MKII (Cambridge Electronic Design). Les données ont été collectées à l'aide du logiciel Signal (Cambridge Electronic Design, Cambridge, Royaume-Uni). Les réponses synaptiques ont été normalisées à la moyenne de la ligne de base. Les valeurs de potentialisation à court terme (STP) et de LTP ont été déterminées en faisant la moyenne de 5 min de valeurs de pente normalisées à 10-15 min et 55-60 min post-HFS, respectivement. Les expérimentateurs qui ont effectué l'électrophysiologie ont été aveuglés au groupe de souris.
Dénervation cholinergique de l'hippocampe
L'anticorps p{{0}} murin avec Saporin conjugué (mu p75-SAP)(ATS Bio, San Diego) a été utilisé dans la dénervation cholinergique. Ensuite, 0,2 ug de mu p75-SAP a été administré par site et les sites d'injection étaient similaires aux sites d'injection du vecteur viral (quatre sites d'injection par animal).
analyses statistiques
La moyenne ± SEM a été déterminée pour chaque groupe. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel Graphpad Prism. Les données ont été analysées via une analyse de variance ou un test t, selon le cas. La méthode de Bonferroni a été utilisée le cas échéant. Les différences étaient considérées comme significatives lorsque p était<>
Résultats
Diminution de la neurogenèse hippocampique, de la densité et du volume des fibres cholinergiques chez les souris Ngf KO spécifiques au système nerveux
Un défi majeur pour l'étude des fonctions du NGF chez la souris adulte est que les modèles KO conventionnels meurent prématurément. Jusqu'à présent, la plupart des rapports ont utilisé des bloqueurs du NGF, tels que de petits ARN interférents ou des anticorps, pour évaluer l'effet du NGF52. Pour étudier le rôle du NGF dans le cerveau, nous avons croisé des souris floxées Ngf avec des souris Sox : Cre, qui expriment Cre dans tout le tube neural à partir de E1127. Ces souris cKO spécifiques aux tissus nous permettent d'étudier les fonctions du Ngf dans le cerveau (Fig. 1A). Tout d'abord, l'expression de l'ARNm de Mgf hippocampique a été mesurée par PCR quantitative. Les résultats montrent une diminution robuste de l'expression de Ngf chez les souris cKO (p<0.0001, tuo="8.24)(Fig.1B)." to="" further="" confirm="" the="" specificity="" of="" this="" brain="" cko,="" we="" measured="" ngf="" mrna="" levels="" in="" the="" whole="" brain,="" liver,="" and="" musde="" from="" wt="" and="" cko="" mice,="" and="" our="" results="" confirm="" the="" specificity="" of="" ko="" (supplementary="" fig.="">
La perfusion de NGF dans les ventricules latéraux augmente à la fois la survie des neurones nouvellement nés et l'activité cholinergique dans l'hippocampe8. Nous avons donc demandé si les souris déficientes en Ngf avaient des niveaux inférieurs de neurogenèse hippocampique adulte et d'innervation cholinergique. Pour détecter la neurogenèse adulte, nous avons injecté du BrdU (200 mg/kg, une injection, par voie intrapéritonéale) à des souris adultes WT et Ngf cKO (âgées d'environ 13 semaines). Les souris ont été tuées 34 jours après cette injection de BrdU pour évaluer la survie neuronale. Nous avons coloré le tissu cérébral pour Ki67 (un marqueur de prolifération cellulaire), DCX (un marqueur pour les neurones immatures) et une double coloration pour BrdU et NeuN (marqueur neuronal). Pour évaluer la densité des fibres cholinergiques, nous avons coloré ChAT, l'enzyme responsable de la synthèse de l'acétylcholine. Nous avons détecté beaucoup moins de Ki67 (p=0.0016, t(16)=3.8) et DCX (p < 0.0001,="" t(16)="8.14)" nombre="" de="" cellules="" positives="" dans="" le="" gyrus="" denté="" de="" l'hippocampe="" chez="" les="" souris="" ngf="" cko="" par="" rapport="" aux="" souris="" wt.="" pour="" le="" double="" marquage="" brdu="" et="" neun,="" les="" souris="" ngf="" cko="" ont="" également="" montré="" une="" tendance="" à="" un="" niveau="" inférieur="" de="" brdu="" plus="" neun="" plus="" nombre="" de="" cellules="" (p="0.054," t(14)="2.09)" (fig.="" 1c).="" ensemble,="" ces="" données="" démontrent="" qu'un="" déficit="" de="" ngf="" dans="" le="" cerveau="" entraîne="" une="" diminution="" de="" la="" neurogenèse="" de="" l'hippocampe="" adulte.="" la="" corticostérone="" plasmatique="" est="" un="" facteur="" majeur="" dans="" le="" contrôle="" de="" la="" neurogenèse="" adulte.="" ainsi,="" pour="" déterminer="" si="" la="" diminution="" de="" la="" neurogenèse="" chez="" les="" souris="" ngf="" cko="" est="" due="" à="" une="" élévation="" de="" la="" corticostérone="" plasmatique,="" nous="" avons="" mesuré="" le="" niveau="" basal="" de="" corticostérone="" plasmatique="" chez="" les="" souris="" wt="" et="" cko.="" il="" n'y="" avait="" pas="" de="" différence="" significative="" dans="" la="" corticostérone="" plasmatique="" basale="" (p="0.24," t(9)="1.25)," suggérant="" que="" l'effet="" du="" ngf="" sur="" la="" neurogenèse="" n'est="" pas="" causé="" par="" le="" différentiel="" de="" corticostérone="" plasmatique="" (="" figure="" supplémentaire="">
Des travaux antérieurs ont montré que les projections cholinergiques vers l'hippocampe proviennent du prosencéphale basal30. Ainsi, nous avons évalué s'il y avait des changements dans les projections septohippocampiques cholinergiques chez les souris Ngf cKO. Nos résultats de coloration ChAT montrent que la densité des fibres cholinergiques est considérablement réduite dans l'hippocampe des souris Ngf cKO (environ 76 % de diminution, p <0,0001, t(8)="9.56)" (fig.="" 1d),="" mais="" pas="" d'autres="" régions="" corticales,="" telles="" que="" le="" cortex="" préfrontal="" médian="" (p="0.12," t(8)="1.73)" et="" le="" cortex="" d'association="" temporelle="" (p="0.2," t(16="" )="1.31)" (fig.="" supplémentaire="" s2a,="" b).="" ensemble,="" ces="" données="" indiquent="" que="" le="" ngf="" est="" nécessaire="" pour="" soutenir="" les="" projections="" cholinergiques="" vers="" l'hippocampe,="" mais="" pas="" le="" cortex.="" ensuite,="" nous="" avons="" analysé="" le="" nombre="" de="" cellules="" neuronales="" cholinergiques="" dans="" le="" vdb="" de="" broca="" et="" ms,="" d'où="" il="" projette="" des="" fibres="" cholinergiques="" vers="" l'hippocampe31,32.="" les="" souris="" ngf="" cko="" affichent="" une="" légère="" diminution="" (environ="" 20%="" de="" diminution)="" du="" nombre="" de="" cellules="" chat="" dans="" ms="" et="" vdb="" (p="0.022," t(16)="2.52)" (fig.="" s2c="" supplémentaire)="">
Lors de la section du tissu cérébral, nous avons constaté que l'hippocampe des souris cKO semblait être petit. Pour le confirmer, nous avons effectué une IRM et nos résultats confirment que Ngf cKO a des hippocampes plus petits que WT (p <0.0001, t(12)="12)." pour="" vérifier="" davantage="" cela,="" nous="" avons="" disséqué="" l'hippocampe="" et="" mesuré="" le="" poids,="" et="" nous="" avons="" trouvé="" que="" les="" hippocampes="" des="" souris="" cko="" étaient="" plus="" légers="" que="" les="" souris="" wt="" (p="0.01," t(23)="2." 79)="" (fig.="">
Diminution de la réponse à l'anxiété et de l'apprentissage spatial chez les souris Ngf cKO
Le blocage du NGF endogène altère la rétention de la mémoire spatiale21 et perturbe la signalisation cholinergique, tandis que la suppression du système cholinergique du cerveau antérieur influence l'anxiété et l'apprentissage spatial18,33. Pour mieux comprendre les effets de Ngf cKO sur l'anxiété et l'apprentissage, nous avons soumis des souris à un champ ouvert, à un EPM, à des tests de labyrinthe aquatique et à la reconnaissance d'un nouvel objet.
La suppression du Ngf a augmenté le comportement anxieux et diminué l'apprentissage spatial et la mémoire, sans affecter la nouvelle reconnaissance d'objet. Dans le test à champ ouvert, les souris cKO ont dépensé moins dans la zone centrale (p=0.04, t(40)=2.09), sans différence dans la distance totale parcourue (p {{7 }}.31, t(40)=1.01) (Fig. 2A). Dans l'EPM, les souris cKO ont passé plus de temps dans le bras ouvert (p=0.001, t(40)=3.43) mais elles n'ont pas montré de différence significative dans la distance totale (p {{ 18}}.25, t(40)=1.15) (Fig. 2B). Dans le test du labyrinthe aquatique, les souris Ngf cKO ont obtenu de moins bons résultats dans la section d'entraînement (p=0.001, F(1,16)=15.65). Une semaine plus tard, nous avons effectué un test de mémoire. Les souris ont été placées dans le labyrinthe aquatique mais avec la plate-forme retirée. Les souris Ngf cKO ont passé moins de temps dans le quadrant cible (p=0.01, t(16)=2.79) (Fig. 2C). Pour la reconnaissance d'un nouvel objet, il n'y a pas de différence dans le DI (p=0.41, t(20)=0.82). Ensemble, ces données indiquent que le NGF joue un rôle dans la médiation de l'anxiété et de l'apprentissage/mémoire spatiale.
La LTP hippocampique a été largement considérée comme un modèle synaptique de la mémoire34 et les perfusions intra-septales directes de NGF facilitent l'induction de la LTP21. Pour examiner l'effet du NGF sur la plasticité synaptique, nous avons mesuré la LTP par enregistrement électrophysiologique ex vivo dans la voie collatérale CA1 Schaffer de l'hippocampe de tranches de cerveau chez des souris WT et Ngf cKO. Nos résultats ont révélé que HFS produisait une augmentation persistante de la pente des fEPSP dans les neurones CA1 des souris WT et Ngf cKO, mais aucune différence dans la LTP (Fig. 2D). Cependant, après cinq trains de stimulus tétanisant HFS, le STP a été significativement diminué dans le groupe Ngf cKO (10–15 min après HFS, p=0.006, t(10)=3.39) ( figure 2E). Pour confirmer davantage l'effet sur la transmission présynaptique, nous avons examiné la plasticité synaptique à court terme par PPF. Les rapports d'impulsions appariées (PPR) étaient similaires entre les souris Ngf cKO et WT. Cependant, nous observons une tendance à l'amélioration de la PPR à partir d'échantillons Ngf cKO en utilisant un intervalle interstimulus de 50 ms (p=0.094, t(18)=1.76) (Fig. 2F), ce qui suggère que le la transmission présynaptique peut avoir été modifiée chez les souris Ngf cKO.
La surexpression de Ngf dans l'hippocampe de souris cKO sauve la mémoire spatiale, mais pas l'anxiété
Pour déterminer si les phénotypes comportementaux que nous avons observés chez les souris Ngf cKO peuvent être inversés en surexprimant Ngf dans l'hippocampe, nous avons injecté le vecteur viral AAV-CB (actine de poulet)-Ngf (surexpression) ou le vecteur viral AAV-CB-eGFP ( contrôle) dans l'hippocampe de souris Ngf cKO. Quatorze jours après la chirurgie, nous avons soumis toutes les souris à des tests comportementaux. Les résultats ne montrent aucune différence significative dans le test en champ libre (temps dans la zone centrale, p=0.59, t(37)=0.54) et EPM (temps dans le bras ouvert, p {{12} }.76, t(37)=0.29) (Fig. 3A, B). Pour le labyrinthe aquatique, aucune différence n'a été trouvée dans la section d'entraînement (p=0.54, F(1,15)=0.39). Cependant, les souris cKO avec surexpression de Ngf ont passé plus de temps dans la zone cible par rapport au groupe témoin (p=0.008, t(15)=3.01) (Fig. 3C, D). Après avoir récolté le tissu cérébral, nous avons confirmé la surexpression de Ngf par hybridation in situ et PCR en temps réel (Fig. 3E, F). Nous avons également détecté un niveau significativement plus élevé de fibres cholinergiques dans l'hippocampe de souris surexprimant Ngf (p=0.001, t(10)=4.19) (Fig. 3G, H). Ces résultats suggèrent que les souris Ngf cKO avec une surexpression hippocampique de Ngf peuvent restaurer l'innervation cholinergique et la mémoire spatiale, mais pas l'anxiété.
Mémoire spatiale altérée chez la souris avec dénervation cholinergique dans l'hippocampe
Les souris Ngf cKO présentaient une innervation sévèrement diminuée des fibres cholinergiques de l'hippocampe, qui a été restaurée par la surexpression de Ngf dans l'hippocampe. Ceci était corrélé à la restauration des performances de la mémoire spatiale (sans amélioration de l'anxiété). Nous avons donc examiné si l'épuisement des fibres cholinergiques sélectivement dans l'hippocampe influence l'anxiété ou la mémoire spatiale dans le labyrinthe aquatique.
Un précédent rapport a montré que l'anti-p75NTRSaporine est une immunotoxine cholinergique spécifique chez la souris35. À cette fin, nous avons injecté anti-p75NTRSaporine (ou véhicule PBS comme contrôle) dans l'hippocampe de souris C57. Quatorze jours après la chirurgie, nous avons soumis ces deux groupes de souris à des tests comportementaux. Nous n'avons trouvé aucune différence significative dans les tests en champ libre (temps dans la zone centrale, p=0.5, t(15) {{10}}.68) et EPM (temps dans les bras ouverts , p=0.51, t(14)=0.66) (Fig. 4A, B). Pour le labyrinthe aquatique, aucune différence n'a été trouvée dans la section d'entraînement (p=0.49, F(1,14)=0.49) ; cependant, les souris injectées avec anti-p75NTRSaporin dans l'hippocampe ont passé moins de temps dans la zone cible par rapport au contrôle PBS (p=0.035, t(14)=2.33) (Fig. 4C, RÉ). Après avoir récolté le tissu cérébral, nous avons confirmé que la dénervation cholinergique s'était produite dans l'hippocampe par coloration ChAT (p <0,0001, t(10)="11.85)," montrant="" également="" que="" les="" fibres="" cholinergiques="" du="" cortex="" étaient="" épargnées="" (p="" {="" {37}}.184,="" t(14)="1.39)" (fig.="" 4e).="" ces="" résultats="" démontrent="" que="" le="" système="" cholinergique="" hippocampique="" est="" nécessaire="" au="" maintien="" de="" la="" fonction="" de="" mémoire="" spatiale,="" sans="" impact="" sur="">
L'effet du NGF sur la mémoire spatiale dépend du système cholinergique hippocampique
Nous avons ensuite examiné si le bénéfice de la mémoire spatiale obtenu en surexprimant Ngf dans l'hippocampe de souris Ngf cKO dépendait de l'innervation cholinergique hippocampique intacte. Nous avons injecté des vecteurs viraux anti-p75NTRSaporine et AAV-Ngf dans l'hippocampe de souris Ngf cKO. Pour le groupe témoin, nous avons injecté des vecteurs viraux anti-p75NTRSaporin et AAV-eGFP. Quatorze jours après la chirurgie, nous avons évalué à la fois l'anxiété et la mémoire spatiale. Les résultats n'ont montré aucune différence entre AAV-Ngf et AAV-eGFP dans le test en champ libre (temps dans la zone centrale, p=0.6, t(33)=0.51) et EPM (temps dans bras ouverts, p=0.92, t(33)=0.09) (Fig. 5A, B). Pour l'apprentissage spatial et la mémoire, il n'y avait pas non plus de différences entre les groupes, à la fois dans la section d'entraînement (p=0.94, F(1,36)=0.004) et dans le test de mémoire (p {{ 26}}.44, t(36)=0.77) (Fig. 5C, D). Après avoir récolté le tissu cérébral, nous avons évalué la densité des fibres cholinergiques de l'hippocampe par coloration au ChAT et les deux groupes ont montré une déplétion sévère des fibres cholinergiques de l'hippocampe, bien qu'un niveau légèrement plus élevé de densité de fibres ait été trouvé chez les souris AAV-Ngf par rapport aux souris AAV-eGFP (p=0.01, t(12)=2.83) (Fig. 5E, F). La PCR en temps réel a confirmé que le groupe AAV-Ngf avait considérablement augmenté l'expression de Ngf par rapport au groupe témoin (p=0.0004, t(12)=4.89) (Fig. 5G). Ces données suggèrent que l'effet bénéfique du NGF sur la mémoire spatiale nécessite une innervation cholinergique hippocampique intacte.
Discussion
Dans cette étude, nous avons entrepris d'étudier les rôles du NGF hippocampique et du système cholinergique sur l'anxiété, l'apprentissage et la mémoire. Nous avons montré que les souris présentant une délétion Ngf spécifique au cerveau (Mgf ckO) présentaient une anxiété accrue et un déficit d'apprentissage spatial. Les souris Ngf cKO présentaient également des niveaux inférieurs de neurogenèse adulte, un volume hippocampique plus petit, un STP altéré et une déplétion dramatique des innervations cholinergiques dans l'hippocampe. La surexpression de Ngf dans l'hippocampe des souris KO du gène Ngf a sauvé la mémoire spatiale mais n'a pas augmenté l'anxiété. Fait intéressant, nous avons également observé une restauration partielle de l'innervation cholinergique dans l'hippocampe suite à la surexpression de Ngf dans cette structure. Pour déterminer si l'effet du NGF sur la mémoire spatiale dépend de ces innervations cholinergiques, nous avons d'abord appauvri les fibres cholinergiques hippocampiques chez les souris WT C57 en injectant une immunotoxine cholinergique dans l'hippocampe et avons confirmé que les fibres cholinergiques hippocampiques soutiennent la mémoire spatiale. Ensuite, sur des souris de fond Ngf cKO, nous avons épuisé les fibres cholinergiques de l'hippocampe mais augmenté l'expression de Ngf simultanément en utilisant AAV-Ngf, qui ont été comparées à des souris appauvries en cholinergique similaires mais injectées avec le contrôle AAV-eGFP. Le résultat a montré que la réexpression de niveaux élevés de Ngf dans l'hippocampe n'améliorait pas la mémoire spatiale. Ainsi, nous montrons que l'effet réparateur du NGF dans le Ngf cKO dépend des innervations cholinergiques hippocampiques intactes et non d'un autre mécanisme.
Il a été démontré que le NGF fourni de manière exogène augmente la survie des neurones nouvellement nés28 et l'apprentissage spatial36 chez les rongeurs, tandis que le blocage du NGF par les anticorps altère la mémoire spatiale21. Conformément au rôle de soutien du NGF dans ces paramètres, nous avons montré que la suppression spécifique du système nerveux central du Ngf affiche une réduction de la prolifération cellulaire et de la neurogenèse. Dans les tests de comportement, nous avons également observé une altération de l'anxiété et de l'apprentissage spatial/mémoire.
Une précédente étude sur le Ngf KO a fourni des preuves montrant que le NGF est indispensable pour l'apprentissage et la mémoire37. Cependant, les auteurs n'ont pas effectué de test d'exploration (section mémoire) et ont plutôt effectué un apprentissage inverse. De plus, 60 % des fibres cholinergiques de l'hippocampe restaient encore chez les souris Ngff/f–Nes ::Cre dans cette étude. Dans notre modèle de souris, nous détectons seulement 20 % des fibres cholinergiques restantes chez les souris Ngff/f–Sox1 :: Cre. Cet écart peut expliquer la différence de comportement que nous avons observée, car notre expérience fournit la preuve que les innervations cholinergiques de l'hippocampe sont nécessaires pour l'effet du NGF sur la mémoire spatiale. Le phénotype d'anxiété que nous avons observé chez les souris Ngf cKO ne peut pas être inversé en surexprimant le Ngf hippocampique. Une possibilité pour cela est que le phénotype d'anxiété que nous avons observé chez les souris Ngf cKO était une conséquence de l'inactivation de Ngf à un stade précoce. Alternativement, le NGF peut agir en dehors de l'hippocampe pour moduler l'anxiété. Cependant, nous observons la régénération des fibres cholinergiques et une amélioration de la rétention de la mémoire spatiale chez les souris hippocampiques surexprimant le Ngf, et ce résultat est cohérent avec une étude antérieure chez des rats âgés38.
Nous avons constaté que la lésion cholinergique de l'hippocampe n'affectait pas l'anxiété mais altérait la mémoire spatiale. Nos résultats ne sont pas cohérents avec les rapports précédents qui montraient que la micro-infusion d'un inhibiteur de l'acétylcholinestérase ou d'antagonistes des récepteurs muscariniques M1 et M2 dans l'hippocampe module l'anxiété39,40. Cependant, nos résultats sont cohérents avec un rapport qui n'a trouvé aucun effet sur l'anxiété suite à une réduction de l'innervation cholinergique de l'hippocampe qui a été obtenue par injection d'immunotoxine dans le MS et le VDB de Broca41. Pour l'apprentissage spatial et la mémoire, plusieurs études suggèrent que l'activité ChAT est associée à l'apprentissage spatial18,35,42,43, mais d'autres travaux n'ont montré aucun effet sur l'apprentissage spatial et la mémoire après une lésion par immunotoxine44,45. Dans notre expérience, nous avons constaté que l'appauvrissement de l'innervation cholinergique de l'hippocampe altérait la mémoire spatiale, sans affecter l'acquisition. Ces écarts entre les études pourraient être dus aux différents protocoles comportementaux, à l'âge, à la souche et aux méthodes d'inhibition du système cholinergique dans l'hippocampe.
Une interaction entre le NGF et le système cholinergique a longtemps été étudiée. La perte de TrkA, ainsi que la suppression de Ngf, réduisent les neurones cholinergiques dans la SEP et les innervations cholinergiques dans les régions corticales et le pocampe de la hanche37,46. Des résultats similaires ont été observés dans notre modèle déficient en Ngf avec environ 76 % des fibres cholinergiques hippocampiques dénervées. Pour savoir si ces fibres cholinergiques ont contribué à l'effet du NGF dans l'apprentissage spatial, nous avons augmenté l'expression du Ngf, tout en appauvrissant les innervations cholinergiques chez les souris Ngf cKO via une injection intra-hippocampique avec un mélange AAV-Ngf (ou AAV-eGFP pour le groupe témoin) et anti-p75NTRSaporine. Les résultats montrent que nous avons considérablement augmenté l'expression de Ngf et également épuisé avec succès ces innervations cholinergiques. Bien que la densité de fibres cholinergiques dans le groupe AAV-Ngf plus anti-p75NTRSaporin était un peu plus élevée que dans le groupe AAV-eGFP plus anti-p75NTRSaporin, les deux groupes ont atteint 90 % d'épuisement des fibres cholinergiques dans l'hippocampe par rapport aux souris WT non traitées. Aucune différence de mémoire spatiale n'a été observée entre ces groupes, ce qui suggère que la simple augmentation de l'expression de Ngf sans innervation cholinergique de l'hippocampe n'est pas suffisante pour restaurer la mémoire spatiale.
Ici, nous utilisons des souris KO conditionnelles Ngf spécifiques au cerveau pour révéler l'importance du NGF dans la régulation du volume, du comportement, de la plasticité synaptique, de la neurogenèse et de l'innervation cholinergique de l'hippocampe. De plus, nous démontrons que l'effet du NGF hippocampique sur la mémoire spatiale dépend d'un système cholinergique intact. La thérapie génique Ngf a été testée chez des patients atteints de la maladie d'Alzheimer, mais aucun effet n'a été trouvé lors du dernier essai clinique de phase 247. Cependant, des données récentes de l'essai clinique de phase 1 précédent avec une procédure chirurgicale identique, analysant les tissus post-mortem, ont révélé que l'AAV-Ngf injecté n'engageait pas directement les neurones cholinergiques cibles48. Nos données fournissent la preuve que l'AAV-Ngf peut être inefficace sans réinnervation cholinergique. Notre étude, en combinaison avec cette récente observation post-mortem, suggère qu'il est encore trop tôt pour conclure que la thérapie par le NGF est inefficace pour la maladie d'Alzheimer.
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