Les effets de Cistanche Shenqiwan sur les dommages rénaux, le GRP78 et les facteurs liés à l'autophagie chez les rats gras diabétiques Zucker atteints de diabète sucré de type 2

quantité de solution saline normale. Les rats ont reçu une administration continue pendant 4 semaines. L'état général des rats a été observé régulièrement. La glycémie à jeun (FBG) et les taux de microalbumine urinaire 24-heure (24 h U-mAlb) ont été mesurés. Le tissu rénal a été coloré et la morphologie a été observée. L'ultra-microstructure a été observée par microscopie électronique à transmission. Les niveaux d'ARNm de GRP78, Beclin-1 et LC3 dans le tissu rénal de rat ont été examinés par PCR en temps réel et les niveaux de protéines ont été examinés par Western blot.Résultats Par rapport au groupe modèle, les rats du groupe Shenqiwan ont montré

amélioration de la brillance de la fourrure, plus d'augmentation de poids et plus d'activité ; les niveaux de FBG et d'U-mAlb sur 24 h ont diminué (P <0.05). Lereinsdes rats du groupe modèle ont montrécapillaires glomérulaires dilatés, membranes basales irrégulièrement épaissies, zones mésangiales élargies et sclérose segmentaire ; une atrophie tubulaire rénale et du tissu fibreux interstitiel rénal ont également été observés dans ces reins. Ces changements pathologiques ont été atténués dans le groupe Shenqiwan. Par rapport au groupe modèle, les niveaux de gènes et de protéines de GRP78 ont diminué (P <0.05) dans le groupe Shenqiwan ; le niveau de protéines de Beclin-1

a été diminué (P < {{0}}.05 ); et le niveau de protéines de LC3 a été augmenté (P < 0,05). Conclusion Shenqiwan peut atténuer les lésions rénales chez les rats ZDF et retarder la progression de la maladie rénale diabétique en réduisant le stress du réticulum endoplasmique et en améliorant l'autophagie.

 

Mot-clé : Shenqiwan ;diabète de type 2; maladie rénale diabétique; stress du réticulum endoplasmique;autophagie; GRP78; Zucker rats gras diabétiques

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Maladie rénale diabétique(DKD) est une complication microvasculaire importante dediabète sucréet une cause majeure dephase terminale de la maladie rénale[1]. DKD est un élément importantcomplication microvasculaire du diabèteetune cause majeure d'insuffisance rénale terminale[1]. Les patients atteints de DKD peuvent présenter une protéinurie persistante et une réduction persistanteTaux de filtration glomérulaire[2]. Lepathogenèse de la DKDest complexe, et des études récentes ont montré que le stress du réticulum endoplasmique (ERS) dans le rein est la cause la plus fréquente d'insuffisance rénale terminale. （Le stress du réticulum endoplasmique (ERS) et l'autophagie sont également étroitement liés à la DKD, et l'étude de leur pathogenèse peut être importante pour le traitement de la DKD. Le DKD ressemble plus à la "faible extinction" dans la catégorie des troubles de la soif en médecine chinoise.
Les symptômes typiques de la soif, de la consommation excessive d'alcool et de la miction sont enregistrés dans le Jin Kui Yao (Essentials of the Golden Horoscope), et lePilule Qi Reinest proposé comme principale formule thérapeutique. Le Jin Kui Yao (金匮要略) a enregistré les symptômes typiques de la soif et de la miction excessive et a proposé lePilule Qi Reincomme principale formule de traitement. Le traitement de la DKD avec la MTC peut en effet protéger efficacement la fonction rénale et présente des caractéristiques sûres et fiables [5-6]. Le traitement de la DKD avec la médecine chinoise peut protéger efficacement la fonction rénale et possède des caractéristiques sûres et fiables [5-6]. L'efficacité de Kidney Qi Pill pour tonifier le rein et aider le Yang a été confirmée dans des études connexes [7]. Notre étude précédente également Notre étude précédente a également montré que les pilules de qi rénal ont de bons effets protecteurs sur la structure et la fonction des tissus rénaux chez les souris diabétiques [8]. Dans la présente étude, nous avons observé les effets de la pilule de qi rénal sur Dans la présente étude, nous avons observé les effets des pilules de qi rénal sur les lésions tissulaires rénales, l'ERS et les facteurs associés à l'autophagie chez le rat gras diabétique Zucker (ZDF). Dans cette étude, nous avons étudié les mécanismes possibles des dommages rénaux chez les rats ZDF en observant les effets des pilules de qi rénal surlésions du tissu rénal, ERS et facteurs liés à l'autophagie médiés par les pilules de qi rénal.

1 Matériaux
1.1 Animaux de laboratoire
Rats ZDF mâles SPF âgés de vingt 12- semaines (masse corporelle 390-410 g, nourris avec de la nourriture pour rongeurs de haute qualité 5C08 pendant 4 semaines pour compléter l'induction du diabète de type 2) et sept 12- semaines- de vieux rats mâles Zucker Lean (ZL) SPF (masse corporelle 350-380 g) ont été achetés auprès de Beijing Viton Lehua Laboratory Animal Technology Co. Tous les rats ont été hébergés dans l'environnement barrière de l'Institut de médecine clinique, Hôpital de l'amitié Chine-Japon , numéro de licence : SYXK (Pékin) 2016-0043, et la plate-forme fournissait un système de ventilation indépendant à l'intérieur de la barrière, maintenant une alternance 12-h de lumière et d'obscurité, une température ambiante de 23-25 degré , et une humidité relative de la pièce de 50 % -60 % . Tous les rats ont été autorisés à boire et à se nourrir librement pendant la période d'alimentation.

1.2 Examen éthique
Les expérimentations animales ont été approuvées par le sous-comité d'éthique animale expérimentale du comité académique de l'Université de médecine traditionnelle chinoise de Pékin (BUCM) avec le numéro d'approbation BUCM-4-2021102801-4034.
1.3 Principaux médicaments et réactifs
Les tablettes (Shu Di Huang, Shan Yu Fei, Shan Yao, Mudan Pi, Fu Ling,Cistanche, Ze Xie, Gunner's Fructus, Gui Zhi) pour la décoction deQi du reinLes pilules ont été achetées auprès de Beijing Tong Ren Tang Co. Solution saline physiologique, spécification : 500 ml, fournie par Shandong Hualu Pharmaceutical Co. Silver Staining Solution (Beijing Regen Biotechnology Co., Ltd., Lot No. DG0090), Magic SYBR Mixture (Jiangsu Kangwei Century Biotechnology Co., Ltd.), kit de transcription inverse d'ARNm (Thermo Fisher Scientific, Inc.), réactif ARN TRIzol (réactif ARN TRIzol), réactif ARN TRIzol (réactif ARN TRIzol). Réactif ARN TRIzol (Beijing Solabao Technology Co., Ltd.), kit ELISA de microalbumine d'urine de rat (Jiangsu Kote Biotechnology Co., Ltd., lot n° KT8560-A), anticorps GRP78 BiP, anticorps LC3B et Beclin{ {5}} Anticorps (Abcam, Royaume-Uni) (numéros de lot : ab108613, ab192890, ab207612), anticorps polyclonal anti-GAPDH de lapin (Proteintech, États-Unis), IgG(H&L)-HRP anti-lapin de chèvre (Beijing Baiao Yijie Technology Co. Ltd.).

 

Lecteur de glycémie, bandelettes de test de glycémie (Shanghai Roche Diagnostic Products Co. Ltd.), centrifugeuse haute vitesse à basse température (Eppendorf, Allemagne), instrument de PCR quantitatif à fluorescence, instrument d'électrophorèse verticale double et instrument d'électrophorèse de transfert (Burroughs Life Medical Products Co. Ltd.), imageur de gel (Protein Simple, États-Unis), microscope optique (Leica, Allemagne), microscope électronique à transmission (Leica, Allemagne) et imageur de gel. (Leica, Allemagne), microscope électronique à transmission (Hitachi, Japon).

2 méthodes
2.1 Préparation de médicaments expérimentaux
La décoction dePilule Rein-Qia été préparé en convertissant la dose de Kidney-Qi Pill dans le Jin Kui Yao [9] selon les ratios anciens et modernes du système de métrologie Han dans la première édition de "Study on the Dose and Proportion of Typhoid Prescriptions" [2015 ], et la dose de décoction nécessaire à l'expérience était la suivante : Shu Di Huang 24 g, Shan Yu Fei 12 g,Cistanche10 g, Shan Yao 12 g, Mudan Pi 9 g, Fu Ling 9 g, Ze Xie 9 g, Gunnera 3 g et Gui Zhi 3 g. Les médicaments ont été trempés dans de l'eau distillée pendant 2 h. La décoction a ensuite été concentrée pendant 30 minutes et filtrée sur une gaze stérile. Décocter les herbes pendant 30 min, puis ajouter les médicaments restants et décoter pendant 1 h. Une fois la température de la solution abaissée à température ambiante, la solution est concentrée et filtrée à travers une gaze stérile, et le filtrat est emballé et stocké à -20 degré . Le médicament ne doit pas être conservé plus d'une semaine et la solution doit être ramenée à température ambiante avant administration.

2.2 Etablissement et regroupement des modèles animaux
Les rats ZDF ont été induits avec un régime riche en graisses 5C08 pendant 4 semaines, et la glycémie a été mesurée par prélèvement sanguin à l'extrémité de la queue à l'âge de 12 semaines. Les rats du groupe de la pilule du rein qi ont reçu une décoction aqueuse de la pilule du rein qi, et la dose quotidienne de 8,12 g/kg par rat a été calculée selon la formule dans "Modèles de maladie chez les animaux de laboratoire" [10], et la concentration de dosage était de 0,812 g/mL, et les rats des groupes modèle et témoin ont reçu une solution saline dans le volume correspondant pendant 4 semaines.

2.3 État général et test de glycémie à jeun (FBG) des rats
Les conditions générales des rats ont été observées et enregistrées quotidiennement, et les masses corporelles ont été pesées régulièrement. À la fin de 12 semaines et de 16 semaines d'âge, du sang a été prélevé à l'extrémité de la queue des rats après 8 h de jeûne, et le FBG a été mesuré par un lecteur de glycémie Roche et des bandelettes de test. 2.4 La microalbumine urinaire 24-h (24-h U-mAlb) a été mesurée à la fin de l'âge de 16 semaines, et la concentration en 24-h U-mAlb a été mesurée conformément aux instructions du kit LISA.

2.5 Prélèvement d'échantillons de tissus rénaux
À la fin de l'âge de 16 semaines, tous les rats ont jeûné pendant 8 h. Après anesthésie, la cavité abdominale a été ouverte et les reins bilatéraux ont été exposés, et le péritoine a été retiré intact et décollé. Le cortex rénal a été séparé et partiellement fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % pour la préparation de coupes de paraffine de 3 μm ; partiellement coupé en blocs de tissu de 1 mm3 et fixé dans du glutaraldéhyde à 2,5 % pour la préparation de coupes ultrafines. Les tissus rénaux restants ont été stockés à -80 degré pour les tests de PCR en temps réel et de Western blot.

 

2.6 Application de l'observation morphologique des tissus rénaux
La coloration PAS, la coloration Masson et la coloration hexaammonium argent-hématoxyline-éosine ont été utilisées pour observer lachangements histopathologiques rénauxsous un microscope optique et d'acquérir des images. La microscopie électronique à transmission a été appliquée pour observer les changements ultrastructuraux des tissus rénaux et des images ont été recueillies.

 

2.7 Test PCR en temps réel
Congelétissus rénauxont été broyés sur de la glace et du réactif TRIzol a été ajouté pour extraire l'ARN total, et centrifugés à 4 degrés avec un rayon de 9,5 cm. Le surnageant a été extrait par centrifugation à 12 000 tr/min pendant 10 min, puis centrifugé pendant 15 min avec du chloroforme. Le surnageant a été centrifugé à nouveau pendant 15 min à température ambiante pendant 10 min, et le surnageant a été lavé avec de l'éthanol à 75 %. expression au niveau de l'ARNm. Les amorces ont été conçues à l'aide du logiciel Primer Premier 5.0 et synthétisées par Shanghai Bioengineering Co. Ltd. Les séquences d'amorces sont les suivantes.