L'impact de la néphrotoxine ochratoxine A sur les cellules rénales humaines étudiées par un nouveau modèle de co-culture est influencé par la présence de fibroblastes

edmund.chen@wecistanche.com

Résumé:Laun reinest menacée par de nombreuses substances potentiellement toxiques. Pour étudier l'influence de la néphrotoxine ochratoxine A (OTA), nous avons établi un modèle de co-culture cellulaire composé derénal Cellules tubulaires proximales et fibroblastes. Nous avons étudié l'effet de l'OTA sur la survie cellulaire, l'expression de gènes et/ou de protéines liées à la mort cellulaire, la matrice extracellulaire et l'homéostasie énergétique. La nécrose induite par l'OTA était renforcée dans les deux types de cellules en présence de l'autre type de cellule respectif, tandis que l'apoptose induite par l'OTA en était indépendante. Dans les fibroblastes, mais pas dans les cellules tubulaires, un effet de co-culture était visible concernant l'expression de la protéine p21 liée au cycle cellulaire. L'expression de la vimentine, protéine indiquant la transition épithéliale-mésenchymateuse, était indépendante des conditions de culture. L'expression de l'ARNlnc induit par l'OTA WISP1-AS1 a été améliorée en co-culture. L'exposition à l'OTA a entraîné des altérations de l'expression des gènes liés au métabolisme énergétique avec un effet mobilisateur du glucose et une expression réduite des protéines mitochondriales. Ensemble, nous démontrons que la réaction des cellules peut être différente en présence de cellules naturellement proches, permettant ainsi une interférence cellulaire. Ainsi, pour évaluer la toxicité d'une substance, il serait avantageux d'envisager l'utilisation de co-cultures au lieu de mono-cultures.

Mots clés:l'ochratoxine A; culture de cellules; le métabolisme énergétique; équilibre apoptose-nécrose; mitochondries; un rein; rénal

CISTANCHE AMÉLIORE L'INSUFFISANCE RÉNALE/RÉNALE

Introduction

En raison de sa fonction excrétrice, leun reinest menacée par une variété de substances nocives telles que les médicaments ou les contaminants alimentaires, comme les mycotoxines entraînant des maladies aiguës ou, pire encore, chroniques.maladies rénalesavec une prévalence d'environ 10 pour cent [1,2]. Pour comprendre les mécanismes de l'action néphrotoxique, il est utile de trouver des stratégies pour atténuer ces scénarios néfastes et de nombreuses études ont été réalisées pour résoudre la question du pourquoi et du comment.reinssont en danger [3–5]. Pour étudier les influences d'une substance sur un organisme, il est souvent difficile d'utiliser des animaux entiers en raison de soucis éthiques et de prérequis organisationnels, coûteux et élaborés. De plus, un transfert de connaissances à la situation humaine est associé à des incertitudes. Par conséquent, des modèles de culture cellulaire ont été établis et sont largement utilisés, et présentent l'avantage qu'un type cellulaire spécifique et sa réponse à une substance ou à un traitement peuvent être étudiés dans des conditions contrôlées. Bien que de nombreuses découvertes importantes aient été faites en utilisant cette approche, certains inconvénients sont inhérents : les cellules d'une lignée cellulaire ont souvent été immortalisées par mutagenèse ou d'autres méthodes, parfois drastiques [6]. Cela permet une manipulation facile et une longue utilisation, mais avec le danger qui résulte d'un système modèle spécifique, il peut ne pas être transférable à la situation dans l'ensemble de l'organe ou de l'organisme. Pour surmonter cet inconvénient, au lieu de lignées cellulaires immortalisées, des cellules primaires peuvent être utilisées, mais la génération de cellules primaires est souvent très difficile et nécessite des compétences techniques avancées. De plus, les cellules primaires ne survivent souvent pas pendant une longue période et nécessitent des conditions de culture individuelles spéciales. Mais les cellules primaires sont un pas de plus vers les conditions naturelles et au moins parfois, il s'est avéré qu'elles sont plus sensibles, par exemple, aux stimuli toxiques que les lignées cellulaires [7], ce qui signifie que les lignées cellulaires pourraient être plus robustes. Un autre inconvénient est le fait que les cellules sont souvent maintenues en monoculture, c'est-à-dire sans les influences d'autres types de cellules, qui dans leur organe d'origine sont généralement proches. Par conséquent, étudier la réponse d'un type de cellule à une substance ou à un traitement en présence de ces cellules, qui se trouvent à proximité immédiate de l'organe natif, pourrait constituer un pas vers une situation plus réaliste.

Dans leun rein, les cellules du tubule proximal sont entourées de fifibroblastes et une influence - probablement mutuelle - peut être supposée. C'est aussi le cas dansdommage aux reinsscénarios qui dans la plupart des cas conduisent à une inflammation tubulo-interstitielle et à une fibrose [8,9], et sont décisifs pour le déclin deun reinfonction. En raison de leurs capacités de transport et enzymatiques,rénalles cellules des tubules proximaux sont menacées par une variété de substances potentiellement toxiques telles que, par exemple, des médicaments ou leurs restes ou des mycotoxines. Un rôle des fibroblastes environnants est de fournir la matrice extracellulaire par libération de collagènes et d'autres composants de la matrice et donc de participer à l'intégrité du tissu [10]. Mais elles sont aussi, avec les cellules épithéliales, impliquées dans des processus inflammatoires ou dans la fibrose.maladies rénales[11] avec le risque de développerinsuffisance rénale. 

Une mycotoxine intensivement étudiée et pertinente pour la santé humaine est l'ochratoxine A (OTA) [12,13]. Il peut être trouvé dans une variété de denrées alimentaires [12,14] et éviter son exposition et son absorption est presque impossible [9,15]. Cela conduit à l'observation que l'OTA est fréquemment détectée dans le sang humain à de faibles concentrations nanomolaires [16]. Chez les animaux exposés, l'OTA conduit àinsuffisance rénaleet les modifications fibrotiques [17,18]. L'exposition à l'OTA est supposée être impliquée dansmaladies rénales[19]. Dans les cellules du tubule proximal primaire humain, un effet toxique de l'OTA a été montré, qui est également observable dans les fibroblastes primaires humains, bien qu'il ne soit pas aussi important que dans les cellules du tubule proximal [7]. Les mécanismes à l'origine de l'action toxique de l'OTA ne sont pas encore complètement élucidés et font l'objet de nombreuses études en cours. La mesure dans laquelle les cellules voisines ayant des fonctions différentes interfèrent et modulent ainsi la fonction cellulaire n'est presque pas connue, mais on peut s'y attendre. Dans une étude précédente utilisant un modèle de co-culture composé de ratun reincellules du tube proximal et des fibroblastes, il s'est avéré qu'une sorte de diaphonie entre les deux types de cellules a lieu, conduisant à l'observation que les effets de l'OTA en tant que transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) ne se produisaient que dans des conditions de co-culture [20]. Une autre conclusion pouvant être tirée de cette étude et d'autres était que les cellules de rat sont plus robustes concernant la tolérance à l'OTA par rapport aux cellules humaines du tubule proximal [7,20] et donc un système modèle basé sur des cellules humaines est nécessaire pour évaluer de plus près la situation humaine et le risque d'exposition à l'OTA.

Par conséquent, dans la présente étude, nous établissons un modèle avancé de co-culture cellulaire composé de cellules humaines du tubule proximal (cellules HK2) et de fifibroblastes humains (cellules CCD-1092SK) pour étudier les effets de l'OTA sur la survie cellulaire (apoptose , nécrose) et l'expression de certains gènes choisis de manière exemplaire liés au cycle cellulaire, à la mort cellulaire, à la matrice extracellulaire et au métabolisme. Semblable aux études précédentes utilisant des cellules de rat [20], les cellules du tubule proximal humain ont été placées sur des dispositifs de filtrage et les filtres ont été placés au-dessus d'une couche de fibroblastes ensemencés au fond d'une boîte de Pétri de sorte que le côté basolatéral des cellules épithéliales soit tourné vers les fibroblastes, permettant une sorte de conversation entre les deux types de cellules.

Résultats

Protéine, libération de lactate déshydrogénase et activité caspase-3Pour obtenir une première impression sur les effets possibles des conditions de culture elles-mêmes ainsi que sur les effets sur les altérations induites par l'OTA, nous avons comparé l'activité caspase-3 comme mesure de l'apoptose des cellules cultivées en monoculture avec l'activité des cellules cultivées en co -culture incubée avec ou sans OTA 100 nM pendant deux instants, 24 et 48 h. En outre, la libération de lactate déshydrogénase (LDH) en tant que mesure de la nécrose a été déterminée ainsi que la teneur en protéines pour donner une impression globale sur l'état des cellules. Par conséquent, des quantités égales de cellules ont été placées soit dans le fond du puits (fifibroblastes) soit sur un fifiltre (cellules des tubules proximaux). Après avoir atteint la confluence, des fifiltres ont été placés dans les puits dans lesquels se trouvaient les fifibroblastes (voir résumé graphique). Comme le montre la figure 1A, presque aucun effet dépendant de l'état de la culture sur la teneur en protéines n'a pu être observé dans les deux types de cellules après 24 ou 48 h (voir également le fichier supplémentaire S1). Dans les fifibroblastes, l'exposition à l'OTA a entraîné une légère augmentation de la teneur en protéines, tandis que dans les cellules tubulaires, l'OTA a entraîné une légère diminution de la teneur en protéines, ce qui montre que l'OTA pourrait avoir un effet négatif sur les cellules tubulaires. Ces effets étaient presque indépendants de la condition de culture dans les deux types de cellules

Figure 1. Effets de l'ochratoxine A (OTA) et/ou des conditions de culture sur la teneur en protéines (A), l'activité caspase-3 (B) et la libération de lactate déshydrogénase (LDH) (C). Les cellules ont été cultivées en mono- ou en co-culture et exposées à 100 nM d'OTA pendant 24 ou 48 h. N=3–6, n=14–18 (protéine, LDH) ou 8–9 (caspase-3). * indique ap < 0,05="" aux="" cellules="" non="" exposées="" à="" l'ota="" (comparaison="" des="" effets="" ota,="" resp.="" côté="" gauche)="" ou="" aux="" cellules="" en="" monoculture="" (comparaison="" des="" effets="" de="" culture,="" resp.="" côté="" droit).="" pour="" mieux="" expliquer="" l'effet="" sur="" la="" teneur="" en="" protéines,="" nous="" avons="" étudié="" l'apoptose="" et="" la="" nécrose.="" par="" rapport="" aux="" fifibroblastes,="" l'ota="" a="" eu="" un="" effet="" clair="" sur="" l'apoptose="" dans="" les="" cellules="" tubulaires="" après="" une="" exposition="" de="" 24="" h="" avec="" une="" augmentation="" d'environ="" 2,5-="" fois="" de="" l'activité="" (figure="" 1b).="" après="" 48="" h="" d'exposition,="" l'augmentation="" était="" encore="" observable="" mais="" pas="" aussi="" nette="" qu'après="" 24="" h.="" cependant,="" ces="" augmentations="" étaient="" presque="" indépendantes="" des="" conditions="" de="" culture,="" sauf="" qu'après="" 48="" h="" en="" présence="" de="" fifibroblastes,="" l'activité="" caspase="" dans="" les="" cellules="" tubulaires="" était="" légèrement="" réduite,="" indiquant="" un="" effet="" protecteur="" modeste="" de="" la="" co-culture.="" cependant,="" un="" effet="" protecteur="" de="" la="" co-culture="" était="" observable="" pour="" les="" fifibroblastes,="" notamment="" en="" présence="" d'ota.="" en="" co-culture,="" la="" libération="" de="" ldh="" a="" été="" clairement="" améliorée="" dans="" les="" fibroblastes="" et="" les="" cellules="" tubulaires="" par="" rapport="" aux="" conditions="" de="" monoculture="" indépendantes="" de="" la="" présence="" d'ota="" (figure="" 1c).="" dans="" les="" cellules="" tubulaires,="" l'ota="" a="" entraîné="" une="" augmentation="" de="" la="" ldh="" libérée="" dans="" le="" milieu,="" en="" particulier="" après="" 48="" h="" d'exposition,="" qui="" n'était="" pas="" aussi="" prononcée="" dans="" les="" fibroblastes.="" pris="" ensemble,="" la="" présence="" de="" l'autre="" type="" de="" cellule="" respectif="" a="" conduit="" à="" une="" nécrose="" accrue="" mais="" à="" moins="" d'apoptose,="" de="" sorte="" que="" la="" teneur="" globale="" en="" protéines="" n'a="" pas="" été="" remarquablement="" modifiée.="" les="" effets="" de="" l'ota="" sur="" l'apoptose="" et="" la="" nécrose="" étaient="" également="" pour="" la="" plupart="" indépendants="" de="" la="" présence="" ou="" de="" l'absence="" de="" l'autre="" type="" de="">

Western Blot et expression de l'ARNm

CDKN1A/p21Il a été démontré que le cycle cellulaire était influencé par l'OTA et il a pu être démontré que la protéine p21 impliquée dans le cycle cellulaire était régulée positivement par l'OTA dans les cellules tubulaires [21]. Pour étudier dans quelle mesure la protéine, ainsi que l'expression de l'ARNm codant pour p21, est influencée par la présence de fibroblastes, nous avons effectué des Western blots et une RT-PCR. Comme le montrent les figures 2A, B et 3, une exposition de 48 h à 100 nM d'OTA a entraîné une augmentation de la quantité de protéine p21 en mono mais aussi en co-culture dans les cellules tubulaires. Dans les fibsoblastes dans des conditions de co-culture, l'OTA n'a eu aucun effet sur l'expression de la protéine p21- bien que l'expression de l'ARNm ait été augmentée par l'OTA indépendamment de la présence de l'autre type de cellule. Fait intéressant, dans des conditions de co-culture, l'exposition à l'OTA n'a pas augmenté davantage l'expression de la protéine p21. Dans les cellules tubulaires, l'expression de l'ARN n'a pas été altérée par la présence de fibroblastes mais dans les fibroblastes en co-culture, l'expression de l'ARNpZlm a été améliorée non seulement dans les cellules exposées à l'OTA mais aussi déjà dans les cellules non exposées à l'OTA (voir également le fichier supplémentaire S1). Ceci montre que la présence de l'autre type cellulaire a une influence sur l'expression de la protéine p21, notamment dans les fibroblastes.

Cyclooxygénase 2 (COX2)Il a été démontré que la protéine cyclooxygénase 2 (COX2) ainsi que les niveaux d'ARNm sont augmentés pendantinsuffisance rénale[22]. Comme le montrent les figures 2C, D et 3, uniquement dans les fifibroblastes, l'expression de la protéine a été augmentée par l'exposition à l'OTA. De plus, en présence de cellules tubulaires, l'expression de la protéine COX2 a été améliorée dans les cellules non traitées ainsi que dans les cellules exposées à l'OTA, démontrant une nette influence des cellules tubulaires. L'expression de l'ARNm, cependant, n'a pas été influencée par l'OTA et un très léger effet de co-culture s'est produit par l'exposition à l'OTA. En revanche, dans les cellules tubulaires, l'expression de l'ARNm et des protéines de COX2 était complètement indépendante de l'OTA ou de la présence de fifibroblastes. Cela montre que les cellules tubulaires COX2 peuvent influencer les fifibroblastes mais que les fifibroblastes n'ont aucune influence sur les cellules tubulaires.

fibronectineInsuffisance rénaleest souvent accompagnée de fibrose. Au cours de la fibrose, une accumulation de matrice extracellulaire a lieu et une observation parmi d'autres est une augmentation de la quantité de protéine fifibronectine [23]. Par conséquent, l'altération dépendante de l'OTA de l'expression de l'ARNm et de la protéine codant pour la fibronectine a été déterminée dans des conditions de mono- ou de co-culture. Comme le montrent les figures 3 et 4A, B, une exposition de 48 h des cellules tubulaires à 100 nM d'OTA a entraîné une diminution de la fifibronectine intracellulaire à la fois en mono et en co-culture. L'effet OTA était plus faible en co-culture. De plus, la quantité d'ARNm codant pour la fifibronectine a été réduite par l'exposition à l'OTA indépendamment des conditions de culture et la présence de fifibroblastes a entraîné une diminution de l'expression de l'ARNm dans les cellules témoins et exposées à l'OTA. En revanche, dans les fifibroblastes, l'expression de la fifibronectine n'était presque pas altérée ni par l'OTA ni par les conditions de culture en raison d'une grande variabilité, en particulier dans les Western blots. Une tendance à l'expression induite par l'OTA pourrait être visible en monoculture.

VimentinLa vimentine est une protéine dont l'abondance augmente lors de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et le développement de l'EMT peut conduire àinsuffisance rénale[23]. Par conséquent, l'altération dépendante de l'OTA de l'expression de l'ARNm et des protéines de la vimentine a été déterminée dans des conditions de mono- et de co-culture. Comme le montrent les figures 3 et 4C, D, une exposition de 48 h des cellules tubulaires à 100 nM d'OTA a entraîné une plus faible abondance de protéines de vimentine dans des conditions de mono et de co-culture. Cependant, en présence de fifibroblastes, l'expression de la protéine vimentine était indépendante des conditions de culture. L'expression de l'ARNm codant pour la vimentine n'a presque pas été altérée ni par l'OTA ni par les conditions de culture à l'exception que l'exposition à l'OTA en co-culture a montré une légère augmentation. Dans les fifibroblastes, l'expression de la protéine vimentine était complètement indépendante de l'exposition à l'OTA ainsi que de la présence des cellules tubulaires. De plus, l'expression de l'ARNm codant pour la vimentine n'était presque pas altérée

Expression de certains gènes sélectionnésPour tester davantage de manière exemplaire dans quelle mesure les conditions de culture peuvent également affecter l'expression d'autres ARN, nous avons sélectionné certains gènes qui jouent un rôle dans l'apoptose-nécrose, le développement du cancer ou le métabolisme énergétique (voir également le fichier supplémentaire S1).

WISP1-AS1est un long ARN non codant (lncRNA) induit par l'OTA affectant la régulation transcriptionnelle et jouant un rôle dans la balance apoptose-nécrose et probablement dans le développement du cancer [24]. Comme on le voit sur la figure 5A, une exposition de 48 h à 100 nM d'OTA a conduit dans les deux types de cellules à une augmentation marquée de l'expression de cet ARNnc. Sans OTA, la présence de l'autre type de cellule respectif n'avait presque aucune influence sur l'expression. Cependant, en présence d'OTA, son expression était plus élevée en co-culture qu'en mono-culture.

GDF15Le facteur de différenciation de croissance 15 (GDF15) est un membre de la superfamille des facteurs de croissance transformants répondant au stress. Il est également considéré comme un biomarqueur pourmaladies rénalesou comme prédicteur de la survie deun reingreffés [25,26]. L'expression de l'ARNm codant pour GDF15 a été améliorée dans les deux types de cellules après exposition à l'OTA, comme le montre la figure 5B. Cet effet induit par l'OTA était favorisé dans les fifibroblastes lorsque les cellules tubulaires étaient à proximité. Dans les cellules tubulaires, cependant, l'expression était indépendante de la présence de fifibroblastes (figure 5B).CDK2La kinase dépendante de la cycline 2 (CDK2) a été identifiée par une analyse de réseau de corrélation pondérée comme un régulateur majeur de la dérégulation du cycle cellulaire induite par l'OTA [21]. Dans les fifibroblastes en monoculture l'expression de l'ARNm codant pour CDK2 n'a pas été altérée par l'OTA. De plus, la présence de cellules tubulaires n'a pas affecté l'expression de l'ARNm. Cependant, dans les cellules tubulaires, l'OTA a conduit à une expression légèrement améliorée uniquement en présence de fifibroblastes (Figure 5C).

Protéines liées au glycogène et au glucose : PYGM, GYS1 et GLUT1 (SLC2A1)Laun reinest également impliqué dans l'homéostasie du glucose et peut apporter du glucose à l'organisme soit par gluconéogenèse, soit en mobilisant les réserves de glycogène [27]. La glycogène phosphorylase (PYGM) joue un rôle dans la décomposition des réserves de glycogène, mobilisant ainsi le glucose [28]. Comme on le voit sur la figure 6A, une exposition de 48 h à 100 nM d'OTA a entraîné une augmentation marquée de l'expression de l'ARNm codant pour la glycogène phosphorylase, en particulier dans les cellules tubulaires. Cependant, dans les cellules tubulaires, cette augmentation ne dépendait pas des conditions de culture alors que dans les fifibroblastes, l'expression induite par l'OTA était plus élevée en présence de cellules tubulaires par rapport à la condition sans cellules tubulaires, la glycogène synthase 1 (G^YSl) catalyse la réaction opposée. et tandis que l'expression de la phosphorylase était régulée positivement, l'expression de la synthase était régulée négativement par l'OTA dans les cellules tubulaires et dans les fibroblastes en co-culture (figure 6B). Cela indique un effet de mobilisation du glucose de l'OTA. Il est intéressant de noter que l'expression de l'ARNm du transporteur de glucose GLUTl (SLC2A1) a également été régulée positivement par l'OTA (Figure 6C), soulignant l'idée d'une demande accrue de glucose due à l'exposition à l'OTA peut-être due à

Protéines liées aux mitochondries : NDUFB10 et MRPS16

Il y a des indications que l'exposition à l'OTA peut entraîner une diminution du potentiel mitochondrial dansun reincellules [24] montrant que la fonction mitochondriale peut être influencée par l'exposition à l'OTA, qui pourrait en outre être influencée par la présence de fibroblastes. Par conséquent, représentatif d'autres ARN codant pour des protéines mitochondriales, nous montrons ici l'expression des ARNm codant pour NDUFB10 et MRPS16. NDUFBt0 code pour la sous-unité mitochondriale NADH:ubiquinone oxydoréductase B10, qui fait partie du complexe respiratoire mitochondrial I et est fortement exprimée dans le cœur etun rein(gène NCBI. Disponible en ligne : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4716 (consulté le 17 mars 2021)). Le gène MRPS16 code pour la protéine ribosomique mitochondriale S16, qui joue un rôle dans la synthèse des protéines mitochondriales. Comme le montre la figure 7, une exposition à l'OTA de 24 h a conduit dans les deux types de cellules à une diminution de l'expression des deux ARNm. Dans les cellules tubulaires, la diminution de l'expression du gène NDUFB10 n'a pas été influencée par la présence de fibroblastes, alors que dans les fibroblastes, la réduction induite par l'OTA de l'expression de NDUFB10 a été légèrement sauvée en présence de cellules tubulaires (figure 7A). Dans les cellules tubulaires, l'expression déjà réduite du gène codant pour la sous-unité ribosomique mitochondriale par l'OTA était en outre plus faible en présence de fibroblastes, alors que dans les fibroblastes, la présence de cellules tubulaires entraînait une expression légèrement plus élevée de l'ARNm MRPS16 (figure 7B). Cela montre que la fonction mitochondriale peut être affectée par l'OTA mais que l'effet de l'OTA peut en outre être modifié lorsque les deux types de cellules sont proches l'un de l'autre.

Discussion

Laun reinest menacée par une variété de substances néphrotoxiques avec le risque de toxicité aiguë ou chronitinsuffisance rénale[1]. Pour l'étude de l'impact des substances néphrotoxiques sur différents types de cellules et pour réduire la manipulation des animaux, les cultures cellulaires ont été largement appliquées. Ces cultures cellulaires ont l'avantage supplémentaire de pouvoir contrôler les conditions expérimentales et d'étudier les effets spécifiques d'une substance à l'aide d'un type cellulaire défini. Outre ces avantages incontestés, certaines considérations demeurent : par exemple, dans « l'organe d'origine », un type de cellule (par exemple, les cellules du tubule proximal dans leun rein) est entouré d'autres types de cellules (par exemple, des fibroblastes) avec des interdépendances multiples. Par conséquent, la réaction à une substance observée lors de l'utilisation d'un seul type de cellule peut ne pas être la même qu'en présence des cellules à proximité dans le tissu d'origine. Dans un modèle constitué de deux types différents de cellules rénales de rat, il a été montré qu'il existe une interférence entre les cellules tubulaires et les fibroblastes, conduisant à des réactions apparaissant uniquement lorsque les deux types cellulaires étaient proches l'un de l'autre [20]. Cependant, lorsque l'on compare les résultats de cette recherche avec les résultats observés à l'aide de cellules de tubules rénaux humains, il apparaît que les cellules de rat sont évidemment plus robustes que ce que l'homme dit concernant leur réaction au traitement avec une néphrotoxine omniprésente, l'ochrafoxine A (OTA) [7]. Par conséquent, un modèle de co-culture composé de cellules humaines est nécessaire. Nous avons établi un tel modèle en utilisant la lignée cellulaire humaine du tubule proximal HK2 et des fibroblastes humains. Les cellules HK2 ont été cultivées sur des inserts de filtre et réunies avec des fibroblastes, cultivées au fond d'une plaque à puits 6-. Après avoir enregistré des paramètres de base tels que l'apoptose et la nécrose, nous avons utilisé ce modèle pour obtenir des données initiales sur l'effet de l'ochratoxine A sur l'expédition de certaines protéines et ARN liés au cycle cellulaire, à l'EMT et au métabolisme cellulaire.

Survie cellulaire  Sur la base de la teneur en protéines, il semble que ni l'OTA ni les conditions de culture n'aient un effet remarquable. Cependant, la relation entre l'apoptose et la nécrose a été déplacée vers la nécrose dans les deux types de cellules lorsque les cellules ont été cultivées ensemble. L'OTA est connue pour induire l'apoptose dans les cellules tubulaires [29] et, dans une moindre mesure, également dans les fibroblastes [7]. Cela se reflète également dans les résultats actuels. Fait intéressant, la présence de l'autre type de cellule respectif a entraîné une diminution des taux d'apoptose dans les deux types de cellules, mais une libération accrue de LDH. C'est un premier indice que déjà la présence d'un autre type cellulaire peut influencer la fonction cellulaire et que la réaction des cellules à une substance toxique peut être différente en co-culture par rapport à la mono-culture.

Expression des protéines et des ARN Nous avons prolongé nos études par la détermination de l'expression des protéines et des ARN de certaines protéines choisies à titre d'exemple et des ARN codant pour elles. Comme il a été démontré que l'OTA influence le cycle cellulaire [21, 30], l'expression de CDKN1A/p21 a été étudiée. Selon les découvertes de Dubourg et al [21], l'OTA a conduit à une expression accrue non seulement de l'ARNm de CDKN1A mais également de la protéine CDKN1A/p21 dans les cellules tubulaires. Dans ces cellules, la présence de fibroblastes n'a pas influencé l'expression de l'ARNm de CDKN1A, alors que dans les fibroblastes, un effet clair de co-culture était visible avec une abondance accrue d'ARNm uniquement visible en co-culture. Cependant, cette augmentation de l'abondance de l'ARNm n'était pas complètement reflétée par l'expression des protéines, suggérant d'autres mécanismes de régulation. Des études sur le cycle cellulaire peuvent être ajoutées pour mieux comprendre l'impact sur le cycle cellulaire. La kinase dépendante de la cycline 2 (CDK2) jouait un rôle dans la dérégulation du cycle cellulaire induite par l'OTA [21]. Dans les cellules tubulaires, son expression d'ARNm a été renforcée par l'OTA en co-culture alors que les fibroblastes n'ont pas été influencés par les cellules tubulaires. Ensemble, les résultats suggèrent que le cycle cellulaire dans les cellules tubulaires est influencé par la présence de fibroblastes.

Un autre effet de co-culture a été observé pour l'expression de COX2 dans les fibroblastes. Pour les fibroblastes, la présence de cellules tubulaires a conduit à une expression protéique nettement améliorée (similaire aux résultats observés dans les cellules de rat [20]), qui n'était pas visible pour les cellules tubulaires qui ne présentaient aucune dépendance à la culture. Ceci indique que le rôle des fibroblastes dans l'inflammationmaladies rénalespeut avoir été sous-estimée par des études utilisant des fifibroblastes en monoculture. La vimentine, une protéine de filament intermédiaire, est exprimée de manière constitutive dans les fibroblastes et est de plus en plus exprimée au cours de la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) dans les cellules épithéliales [10]. Bien qu'il ait été démontré qu'une exposition prolongée à l'OTA peut conduire à une expression accrue du collagène III ou de la fibronectine dans les cellules tubulaires [7], dans la présente étude, l'expression de la vimentine, protéine indicatrice de l'EMT dans les cellules tubulaires, était encore plus faible après l'exposition à l'OTA, indépendamment des conditions de culture. De plus, l'expression de l'ARNm et de la protéine de la fibronectine était plutôt inférieure et non améliorée. De plus, dans les fibroblastes, aucune expression altérée n'était démontrable, de sorte que ces résultats ne plaident pas en faveur d'une TEM induite par l'OTA, comme l'ont montré d'autres [31].

CISTANCHE AMÉLIORE LA FONCTION RÉNALE/RÉNALE

Pour tester plus avant si la co-culture peut influencer la réponse cellulaire au stress induit par l'OTA, nous avons déterminé l'expression de certains ARN exemplairement choisis liés à l'apoptose-nécrose, au développement du cancer et au métabolisme énergétique. Les ARN longs non codants jouent un rôle important dans de nombreux processus de régulation cellulaire et leur déraillement, ainsi que dans la fibrose rénale ou le cancer [32]. WISP1-AS1 est un long ARN non codant induit par l'OTA et exprimé dans les cellules tumorales rénales [24]. Nous avons constaté que sa régulation à la hausse par l'OTA dans les deux types de cellules et la co-culture amélioraient la régulation à la hausse. Ceci permet l'aggravation de l'effet de WISP1-AS1 sur la balance apoptose-nécrose et probablement la formation de tumeurs. La libération accrue de LDH observée en co-culture peut donc au moins partiellement s'expliquer par le contenu accru de WISP1-AS1, qui s'est avéré nécessaire pour la nécrose induite par l'OTA [24].

WISP1-AS1était également suspectée de jouer un rôle dans le métabolisme notamment de la mitochon dria [24]. Dans les cellules de l'épithélium gastrique, il a été démontré que l'OTA provoque un dysfonctionnement mitochondrial [33]. Pourun reincellules, il existe des résultats controversés quant à savoir si l'exposition à l'OTA a une influence sur le potentiel mitochondrial ou non [21,24]. Un potentiel mitochondrial réduit peut être le résultat d'une altération des mitochondries ou peut entraîner des dommages mitochondriaux. L'expression réduite des protéines mitochondriales peut entraîner une altération de la fonction reflétée ou suivie d'un potentiel mitochondrial altéré. Une fonction mitochondriale altérée oblige la cellule à utiliser des voies alternatives pour assurer l'approvisionnement énergétique. L'approvisionnement énergétique sous apport mitochondrial inapproprié peut être maintenu par une utilisation accrue de la glycolyse conduisant à une production accrue de lactate. Cependant, dans les cellules HEK293, un embryon humainun reinlignée cellulaire, il a été constaté que l'OTA entraînait plutôt une réduction de la glycolyse et que la quantité accrue de lactate due à la production de lactate à partir de la glutamine dépendait de l'expression de l'ARNlnc WISP1-AS1 [24]. En revanche, dans les cellules épithéliales gastriques, il a pu être démontré que l'exposition à l'OTA entraîne une reprogrammation du métabolisme du glucose vers la glycolyse et une moindre activité du cycle de l'acide tricarboxylique [34]. Nous pouvons montrer ici que (1) l'OTA conduit à une expression réduite de l'ARNm de deux protéines mitochondriales choisies de manière représentative, qui jouent un rôle dans la synthèse des protéines mitochondriales (MRPS16) et la production d'énergie (NDUFB10) et (2) que les enzymes de gestion du glycogène ont été régulées de manière à ce que le glucose amélioré puisse être mobilisé (GYS1 vers le bas et PYGM vers le haut). De plus, une capacité de transport GLUT1 plus élevée semble être induite. Cependant, ces altérations induites par l'OTA étaient presque indépendantes des conditions de culture.

En conclusion, nous avons montré que dans des conditions de co-culture, la réaction des cellules peut être différente des réactions observées en mono-culture, bien que tous les paramètres étudiés ici ne soient pas dépendants de la culture. Cependant, sur la base des résultats présentés ici, l'utilisation de la co-culture doit être préférée si possible, évitant ainsi la possibilité de surveiller les effets qui ne se produisent pas lorsqu'un seul type de cellule est étudié. Reste à savoir comment les cellules communiquent entre elles. Des études dans un modèle de co-culture chez le rat ont révélé un mécanisme dépendant de la COX2- [20] et chez la souris, l'acide rétinoïque semble participer à l'interférence cellulaire deun reincellules [35]. De plus, la question demeure de savoir si, pourquoi et comment l'OTA interfère avec le métabolisme énergétique cellulaire et le rôle des mitochondries dans celui-ci.

Détermination des activités LDH et Caspase-3 et de la teneur en protéinesPour la lyse, les cellules ont été lavées deux fois dans du tampon PBS glacé, collectées et lysées dans du tampon MOPSTriton (acide 20 mM 3-(N-morpholino)propanesulfonique, pH 7,4, 0). 1 % de Triton X100). La teneur en protéines des lysats cellulaires a été déterminée à l'aide d'acide bicinchoninique [36, 37]. L'activité LDH dans les milieux ou les lysats cellulaires comme mesure de la nécrose a été déterminée selon Bergmeyer [38] comme décrit en détail dans [20]. L'activité caspase-3 en tant que mesure de l'apoptose a été déterminée à l'aide du substrat florigénique caspase-3 (DEVD-AFC) comme décrit dans [39]. En bref, 60 µL de lysat cellulaire ont été incubés avec 65 µL de tampon de réaction (20 mmol/L de pipérazine-1,4-acide bis(2éthanesulfonique (PIPES), 4 mmol/L d'EDTA, 0,2 % {{26} }[(3-cholaminopropyl)diméthylammonio]-1-propanesulfate (CHAPS), 10 mmol/L de dithiotréitol (DTT), pH 7,4) contenant 42 μmol/L de DEVD-AFC (Aspglu-val-asp{{ 36}}amino-4-trifluorométhylcoumarine, concentration finale) à 37 ◦ C. La fluorescence du produit clivé (AFC) a été mesurée à une excitation de 400 nm et une émission de 505 nm. L'AFC clivé a été quantifié par une courbe d'étalonnage à l'aide d'AFC connu concentrations.

RT-PCR  L'isolement de l'acide ribonucléique total (ARN) a été réalisé à l'aide du réactif Trizol (Life Technologies, Darmstadt, Allemagne). Les cellules ont été lavées puis lysées avec le réactif Trizol et transférées dans un tube de réaction. Après addition de chloroforme et centrifugation (12,000× g), la phase supérieure a été recueillie et mélangée avec de l'isopropanol glacé. Après centrifugation (12, 000 × g), le surnageant a été éliminé et le culot a été lavé deux fois avec de l'éthanol à 75 % et finalement dissous dans de l'eau. La transcription inverse a été réalisée à l'aide d'un kit commercial d'Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) conformément à leurs instructions. La PCR en temps réel a été réalisée à l'aide d'un réactif SYBR Green (Invitrogen). Les amorces ont été synthétisées par Microsynth AG, Balgach, Suisse. Les séquences d'amorces sont présentées dans le tableau 1. Le changement de pli de l'expression génique a été calculé par la méthode 2∆∆Ct en utilisant l'expression de EEF2 et RPS17 comme références. L'expression de ces deux gènes s'est avérée être la moins altérée (voire pas du tout) dans les données de séquençage d'ARN lors de la comparaison d'OTA traité avec des cellules HK2 non traitées (résultats non publiés).

Transferts Western  Après séparation des protéines par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide (SDS-PAGE), les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. Par la suite, les sites de liaison libres de la membrane ont été bloqués par une solution à 5 % de lait écrémé en poudre dans une solution saline tamponnée au TRIS (base TRIS 3 mM, NaCl 140 mM, 0.17 mM Tris -HCl, pH 7,4) contenant 0,1 % de Tween20. Les premiers anticorps dilués dans une solution saline TRIS plus de l'albumine de sérum bovin à 5 % (TRIS-BSA, pour les dilutions, voir le tableau 2) ont été ajoutés et les membranes ont été incubées pendant une nuit. Après lavage, des anticorps secondaires couplés à la fluorescence dans du TRIS-BSA ont été ajoutés pendant 90 min. La fluorescence des seconds anticorps a été enregistrée en utilisant un système de détection LICOR.

CISTANCHE AMÉLIORE LA DOULEUR RÉNALE/RÉNALE