La voie à suivre pour faire progresser les études précliniques sur les maladies neurodégénératives liées à l'âge : une perspective sur les modèles dérivés de rongeurs et de HiPSC, partie 3

Des approches similaires de vecteurs viraux ont été évaluées dans divers modèles de MP, les premières versions employant AAV2/2 ou LV.123–126Ces vecteurs injectés dans le cerveau de rats adultes ont été utilisés pour administrer des mutants WT, A30P ou A53T d'a-syn humain pour la maladie. induction.

La relation entre les virus et la mémoire peut sembler négative à de nombreuses personnes, car les virus provoquent souvent un inconfort physique et des maladies. Cependant, les virus peuvent également avoir un effet positif sur l’amélioration de la mémoire, principalement parce que les attaques virales peuvent favoriser l’activité du système immunitaire.

Des études ont montré que les attaques virales peuvent provoquer une réaction du système immunitaire de l'organisme, améliorant ainsi la résistance de l'organisme aux virus. Cette réponse du système immunitaire comprend l’augmentation du nombre de globules blancs et d’autres cellules immunitaires produites, ainsi que la production d’anticorps. Ces réponses aident non seulement l’organisme à résister à l’invasion virale, mais contribuent également à renforcer le fonctionnement du système immunitaire et à améliorer la santé globale de l’organisme.

Les attaques virales activent également les cellules immunitaires du cerveau. Ces cellules immunitaires peuvent éliminer les cellules inutiles et corrompues du cerveau, améliorer le fonctionnement du système nerveux et favoriser la transmission de l’information et le traitement de la mémoire. Des études ont également montré que les personnes atteintes de certaines infections virales peuvent mieux performer dans les tâches de mémoire.

De plus, certaines études ont montré que certains virus peuvent stimuler l’organisme à produire le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF), une substance qui favorise la croissance et le développement des neurones. Cette substance a un effet positif sur la fonction cérébrale et peut favoriser la réparation physique et l’amélioration de la mémoire.

Bien entendu, dans la lutte contre le virus, nous devons adopter la bonne approche et la bonne stratégie, maintenir de bonnes habitudes d’hygiène et dormir suffisamment et faire de l’exercice, afin que notre système immunitaire soit dans les meilleures conditions. Bref, même si le virus peut nous causer un inconfort physique, il est de plus en plus évident qu’il peut également favoriser l’activité du système immunitaire et avoir un impact positif sur notre santé et notre mémoire. On voit que nous devons améliorer notre mémoire, et Cistanche peut améliorer considérablement notre mémoire car Cistanche peut également réguler l'équilibre des neurotransmetteurs, comme en augmentant les niveaux d'acétylcholine et de facteurs de croissance, qui sont très importants pour la mémoire et l'apprentissage. En outre, Cistanche peut également améliorer la circulation sanguine et favoriser l'apport d'oxygène, ce qui peut garantir que le cerveau reçoive suffisamment de nutrition et d'énergie, améliorant ainsi sa vitalité et son endurance.

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Les auteurs ont démontré une expression efficace de a-syn dans les neurones nigraux DA, accompagnée de pathologies moléculaires et cellulaires et d’une dégénérescence de nigralDA qui ont évolué progressivement au fil du temps.

Néanmoins, la première génération de vecteurs rAAV2/2 utilisée dans ces études présentait une perte neuronale progressive, bien que la neurodégénérescence des neurones tyrosine-hydroxylase-positives, ainsi que l'évolution dans le temps, étaient assez variables (25 % à 80 % et 6 semaines à 1 an). , respectivement).123,124

En revanche, les LV codant pour la synthèse a mutée par WT, A30P ou A53T étaient capables d'induire une perte de cellules neuronales chez le rat de manière plus retardée et plus cohérente (25 à 40 % et 5 mois, respectivement).126 Les deux études ont démontré une perte progressive de la longueur des neurites et un péricarya enflé dans les neurones DA restants.

De plus, des accumulations cytoplasmiques massives de a-syn ont été trouvées à la fois dans les corps cellulaires et dans les neurites. Ces résultats ont été récemment reproduits dans plusieurs études utilisant les deux plateformes virales.127-131

Les LV ont également été utilisés dans divers modèles de souris PD. Par exemple, Lauwers et ses collègues125 ont montré que l'injection de LV porteur du mutant WT ou A30P de a-syn dans le striatum, l'amygdale ou la souris SNof était capable d'induire des modifications neurodégénératives associées à la MP de manière dépendante du temps et incluait une hypertrophie neuritique indépendante de a. et inclusions cytoplasmiques.

De plus, cette étude a démontré que la surexpression nigrale de A30P-a-syn entraînait une perte cellulaire d'environ 25 % après 10 à 12 mois.125 L'administration de A30P, E57K et E35K au SN du rat en utilisant LV a démontré une étendue similaire dans le neurone DA. perte (environ 50 %) par rapport au WT (30 %), alors que le mutant A53T formant des fibrilles plus rapide utilisé dans la même étude n'a pas montré de diminution significative du nombre de cellules DA.

Il est intéressant de noter que les caractéristiques neuropathologiques globales observées chez les souris (c'est-à-dire l'apparition et la gravité) semblaient moins graves que chez les rats, bien que ces différences puissent être un artefact de la pureté virale ou des titres de production du virus injecté et/ou d'autres divergences techniques associées.

Considérations importantes pour les modèles de vecteurs viraux AD et PD

Le développement de nouveaux sérotypes, notamment AAV2/1, AAV2/5, AAV2/6, AAV2/8, AAVrh10, DJ et DJ8, a élargi les cibles cellulaires et amélioré l'efficacité de transduction de l'AAV.

Les AAV sérotypés avec ces nouvelles capsides ont été testés chez des rats et des primates non humains pour surexprimer a-syn.132-137. La surexpression de la forme S129A délivrée via AAV2/5 et AAV2/6 présente systématiquement une toxicité accrue dans le processus de neurodégénérescence.134,138

Ces expériences ont également démontré qu'un dosage prudent du transgène de surexpression est crucial, car même les vecteurs témoins portant uniquement des rapporteurs fluorescents délivrés à des titres élevés peuvent démontrer des effets toxiques non spécifiques.135

Cette mise en garde doit être soigneusement prise en considération lors de la conception d’expériences de sauvetage basées sur l’AAV. Par exemple, il a été démontré que l'AAV thérapeutique hébergeant de petits ARN interférents (ARNsi) ciblant la SNCA entraînait un niveau élevé de toxicité et provoquait une perte significative de neurones DA nigrostriataux. Cette étude a en outre mis en évidence les limites des applications de l'AAV dans les études animales.

Cependant, il ne peut être exclu que la neurotoxicité ait été causée par la forte réduction des niveaux de SNCA dans les modèles de rats, l'asa-syn joue un rôle biochimique crucial dans les neurones DA et sa forte réduction pourrait diminuer la viabilité cellulaire.139 Pris ensemble, cela souligne l'importance de développer un outil permettant d'affiner l'expression des gènes associés à la maladie pour concevoir des approches de thérapie génique.

À cet égard, le système plus récent basé sur CRISPR-dCas9- pourrait présenter un système plus avantageux pour moduler l'expression des gènes de manière précise et affinée.

Dans cette optique, nous avons récemment développé le système LV-CRISPR-Cas9 pour obtenir une régulation précise et fine de l'expression du gène SNCA. L'étude a fourni la preuve du concept selon lequel la manipulation de l'expression des gènes (par exemple, l'inversion de la surexpression) via l'édition de l'épigénome constitue une stratégie thérapeutique précieuse pour les troubles neurologiques, tels que la MP,140 causés par une dérégulation génétique.

En tant que tels, les modèles PD de vecteurs viraux utilisant LV et AAV pour la surexpression de la protéine a-syn présentent une pathologie PD associée à la neurodégénérescence DA, et l'utilisation de nouveaux sérotypes AAV améliore l'expression a-syn dans les neurones DA par rapport à l'AAV2/2.

Dans l’ensemble, les AAV et les LV sont capables d’induire l’expression du transgène et démontrent un niveau élevé de tropisme pour les neurones DA, entraînant des niveaux similaires de neurodégénérescence. Une amélioration supplémentaire de ces systèmes viraux sera nécessaire pour contourner une lente progression des phénotypes cellulaires de la maladie de Parkinson et des niveaux relativement faibles de troubles du comportement.

Modèles de culture cellulaire in vitroAperçu des modèles AD et PD in vitro actuels : limites et opportunités

Au cours des quatre dernières décennies, divers modèles in vitro de MA et de MP ont été développés pour examiner les interactions entre les aspects clés de la physiopathologie relative de leur maladie, puis utilisés pour le dépistage thérapeutique préclinique.

Les modèles in vitro actuels de MA et de PD visent principalement à récapituler les caractéristiques des maladies moléculaires et cellulaires, telles que le dysfonctionnement mitochondrial, le stress oxydatif, la survie cellulaire et la présence d'agrégats de protéines intracellulaires et/ou extracellulaires. Par exemple, les modèles cellulaires d'AD les plus importants et les plus largement utilisés sont basés sur l'induction d'agrégats Ab40 42 ou sur l'hyperphosphorylation et l'agrégation de tau (Tableau 1).

De même, les modèles in vitro de MP sont basés sur le dysfonctionnement mitochondrial induit par la toxine (par exemple, MPTP, roténone, paraquat, 6-OHDA) et la protéostase perturbée (par exemple, thapsigargine, ionomycine, tunicamycine), la surexpression et l'expression de l'a-syn. des gènes familiaux mutés de la MP (par exemple, a-syn, Parkin, PINK1)92 (Tableau 2).

Bien que ces modèles de culture cellulaire aient été d’une valeur inestimable pour faire progresser notre compréhension de la neurobiologie pertinente, ils n’ont pas encore abouti à des DMT viables visant à la prévention, à retarder l’apparition ou à ralentir la progression de la maladie, remettant en question leur pertinence et leur validité translationnelle.

Il est important de reconnaître plusieurs limites claires de ces modèles pour améliorer les pratiques précliniques actuelles.

Par exemple, les modèles basés sur la surexpression et l'inactivation/inactivation de gènes pertinents associés à une maladie sont notoirement variables dans les changements quantitatifs des niveaux de protéines et dans les méthodes utilisées pour induire des changements dans l'expression des gènes (c'est-à-dire, à médiation virale, basée sur la reproduction, constitutive ou transitoire). cela peut conduire à des données et à des déductions contradictoires.92

Ce manque de cohérence dans l'obtention de phénotypes associés à la maladie introduit une mise en garde concernant les études précliniques utilisant ces modèles pour tester les DMT potentiels. De plus, la variabilité des phénotypes cellulaires et de la méthodologie observée dans les modèles précliniques NDD (par exemple, changement de facteur de surexpression ou d'inactivation de protéines) suggère fortement une plus grande hétérogénéité génétique qui ne peut pas être pleinement explorée dans les modèles cellulaires actuels.

Ceci est encore compliqué par la prévalence de modèles cellulaires basés sur des variantes génétiques identifiées dans des cohortes familiales, malgré les variantes familiales représentant une petite minorité de l'ensemble des cas de NDD.109,143

En raison des causes génétiques découvertes, il reste difficile de représenter avec précision les cohortes sporadiques de NDD ou les sous-types de maladies présentant une génétique non mendélienne dans des modèles précliniques, créant ainsi un obstacle important à l'élucidation des mécanismes pertinents de la maladie, à l'identification de cibles thérapeutiques potentielles et au développement de médicaments.

Compte tenu de ces défis, les chercheurs ont été contraints d'évaluer ces modèles pour identifier les domaines d'amélioration et évaluer les opportunités présentées par les nouvelles techniques de culture cellulaire.

Ces dernières années, nous nous sommes appuyés sur ces modèles, en intégrant une nouvelle technologie d’édition de gènes et en évaluant d’importantes associations de maladies génétiques obtenues dans les GWAS dans des modèles de culture tissulaire améliorés.144,145

L'incorporation accrue de la technologie hiPSC représente une avancée majeure dans le domaine de la modélisation in vitro du NDD et offre des opportunités auparavant indisponibles d'utiliser des types de cellules pertinents pour la maladie dérivés de patients pour explorer la pathogenèse de la maladie dans le contexte du génome humain.

L'éventail complet des avantages et des limites des modèles NDD dérivés de hiPSC, en particulier ceux concernant l'AD et la PD, est exploré en détail dans la section suivante.

Modèles de NDD dérivés de hiPSC : polyvalents et génétiquement « fidèles »

Les progrès modernes dans la technologie de la culture cellulaire représentent l’une des percées les plus intéressantes dans la recherche sur les TND, offrant des opportunités pour améliorer la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et la médecine personnalisée.

Jusqu'à récemment, l'examen post-mortem du cerveau était considéré comme le matériel biologique humain de référence pour obtenir des informations sur les processus pathologiques des maladies neurodégénératives humaines.

Cependant, les technologies modernes de cellules souches, y compris l'analyse des neurones et des cellules gliales spécifiques au patient, ont ouvert de nouvelles voies pour étudier les mécanismes pathologiques des NDD et ont été de plus en plus exploitées dans la dissection moléculaire des NDD avec une complexité génétique accrue, comme la MA et PD.

Grâce à une biopsie simple et non invasive d'échantillons de peau de patients, en plus d'une variété d'échantillons biologiques alternatifs, la génération de hiPSC permet aux chercheurs de révéler les voies moléculaires et les mécanismes pathologiques qui sont à l'origine des NDD d'une manière qui était impossible avec les méthodes de culture cellulaire précédentes.

À l'heure actuelle, les cellules donneuses les plus répandues sont les fibroblastes, qui sont utilisés dans plus de 80 % de toutes les expériences de reprogrammation publiées ;146 cependant, les hiPSC peuvent être obtenues à partir de diverses sources, notamment les cellules souches du cordon embryonnaire, le sang du cordon ombilical, les cellules épithéliales cornéennes, et les cellules sanguines, telles que les cellules mononucléées du sang périphérique147-149 (Figure 1).

Par conséquent, les modèles dérivés de hiPSC représentent une alternative polyvalente aux modèles de maladies cellulaires existants et sont obtenus à partir de tissus somatiques de patients contraints à la pluripotence grâce à l'utilisation d'une variété d'outils de reprogrammation, tels que des plasmides, des vecteurs (par exemple épisomiques) et une transduction virale (par exemple , adénovirus, virus Sendai, lentivirus ; ces méthodes sont examinées en détail dans Brouweret al.150 et Malik et Rao151).

Ces cellules s'auto-renouvellent et offrent une alternative aux cellules souches embryonnaires (CSE), qui s'accompagne de considérations éthiques et de préoccupations sociales. Il existe actuellement plusieurs référentiels hiPSC qui collectent et distribuent des lignées hiPSC dérivées de patients atteints de NDD et de contrôles du même âge afin de centraliser les échantillons et de les rendre facilement accessibles aux chercheurs (tableau S2).

L’une des principales applications des hiPSC est la différenciation en types de cellules spécifiques, qui ont par conséquent été utilisées dans divers contextes biologiques, notamment des études sur le développement neurologique152 et la neurodégénérescence,144 la transplantation ex vivo,153,154 la modélisation de maladies, la validation de cibles et la découverte de médicaments.155.

À ce jour, plusieurs protocoles de différenciation cellulaire ont été développés qui génèrent non seulement des neurones génériques, mais également des populations de types de cellules neuronales spécifiques, notamment des neurones excitateurs, cholinergiques, DA et inhibiteurs GABAergiques.156–158 Une variété de sous-populations gliales spécifiques ont également été dérivées des hiPSC, y compris les astrocytes,159-161, les oligodendrocytes,162,163 et les microglies.164-166.

Plusieurs nouvelles techniques d'édition de gènes, notamment CRISPR-Cas9, les nucléases à doigts de zinc (ZFN) et les nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENS), ont introduit une dimension supplémentaire au système dérivé de hiPSC : la création de modèles isogéniques possédant le même bagage génétique. et ne diffèrent que par la mutation choisie.167

La diversité des protocoles de différenciation cellulaire a facilité les études mécanistiques et la disponibilité de lignées isogéniques a soutenu les analyses génétiques de la fonction des gènes et de leur rôle pathogène dans les NDD. Les modèles dérivés de hiPSC conviennent à ces investigations, car ils présentent des caractéristiques clés liées à la maladie.

Par exemple, les modèles neuronaux hiPSC dérivés de fAD et de sAD portant des mutations PS1 et PS2 (A246E et N14II, respectivement)168 et une mutation de duplication APP169 présentent des caractéristiques biochimiques importantes de la MA, notamment la sécrétion d'Ab, une augmentation du rapport Ab42:Ab40 et une protéine tau hyperphosphorylée élevée.

Il est important de noter que l'utilisation de modèles hiPSC qui génèrent des phénotypes liés aux Ab représente un moyen plus précis d'explorer le rôle de l'expression d'Ab dans la neurodégénérescence de la MA par rapport aux modèles d'expression ectopique traditionnels ou aux modèles qui nécessitent un supplément et/ou une induction d'agrégats d'Ab, comme ceux-ci adoptent les processus pathologiques « naturels » liés aux dépôts d’Ab.

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