Architecture tridimensionnelle des néphrons dans le rein normal et kystique
Mar 17, 2022
pour plus d'informations :ali.ma@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7, Nicolas Goudin3,7, Mohamed Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traoré3, Franck Bienaime1,5,Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Clément Nguyen1, Martine Burtin1, Gérard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8et Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université de Paris, Institut Necker Enfants Malades, Département « Croissance et Signalisation », Paris, France ;2Service de Chirurgie Viscérale et Urologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, France ;3Structure Fédérative de Recherche Necker, États-Unis24-UMS3633, Paris, France ; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, France ;5Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paris, France ; et6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, Hôpital Européen Georges Pompidou, Paris, France
MOTS CLÉS : kystiqueun reinmaladie;un rein; néphron; néphronophtise; compensation des tissus
Déclaration de traduction
Les méthodes de compensation fournissent un outil unique pour comprendre comment les changements morphologiques conduisent à des conséquences pathologiques.Reinssont des organes critiques qui maintiennent l'homéostasie du corps grâce à la manipulation de l'eau, des métabolites et des électrolytes, qui dépendent de manière cruciale de la structure dimensionnelle 3-complexe denéphrons.Lorsque cette organisation structurale est altérée, la physiopathologie rénale s'ensuit. Dans la présente étude, nous avons développé une méthode puissante basée sur la compensation optique, la microscopie multiphotonique et le traçage numérique pour étudier leun reinau niveau du néphron unique dans des conditions physiologiques et pathologiques. En particulier, nous fournissons la première 3-reconstruction dimensionnelle d'un polycysticidney à l'échelle d'un seulnéphrons. Cette méthode peut être appliquée à plusieurs contextes pathologiques, nous permettant de mieux comprendre le processus complexe de détérioration des reins et, par conséquent, de développer des stratégies thérapeutiques plus ciblées
Le rein maintient l'homéostasie du corps via son complexe3-dimensionnel(3D) structure du néphron. Lorsque cette organisation structurale est altérée, la physiopathologie rénale s'ensuit. Chroniqueun reinles maladies sont caractérisées par le développement de lésions rénales. Curieusement, les pathologistes ont signalé une grande hétérogénéité dans la distribution des lésions pendant les maladies rénales chroniques. Pour résoudre ce problème, il est obligatoire de reconstruire le 3D (Tridimensionnel) forme denéphronsdans des contextes pathologiques.
A notre connaissance,néphronsn'ont été entièrement reconstruits qu'à l'aide de coupes 2D en série.3–5 Bien que la coupe histologique standard fournisse une haute résolution, les reconstructions 3D sont laborieuses et difficiles à obtenir. Ceci est principalement dû aux distorsions mécaniques, qui sont un effet inévitable de la procédure de tranchage. De plus, la reconstruction 3D à partir d'images 2D ne permet pas l'imagerie directe de structures 3D dans des tissus entiers.
La microscopie multiphotonique a amélioré notre capacité à détecter les changements morphologiques dans les coupes épaisses. Cependant, une limitation significative est la faible profondeur accessible due à la diffusion de la lumière. En minimisant les différences d'indice de réfraction, les agents de compensation ont considérablement amélioré la capacité d'imager les profondeurs.6,7 Malgré le fait que le premier agent de compensation ait été introduit il y a un siècle,8 ce n'est que récemment que plusieurs protocoles de compensation ont été développés, principalement pour le cerveau.9 –17Des études récentes ont démontré leur potentiel pour l'imagerie d'autres organes solides, tels que le foie, le pancréas ouun rein.18–26
polykystiqueun reinLa polykystose rénale, une maladie génétiquement hétérogène impliquant des mutations dans plusieurs gènes ciliaires, est la maladie rénale héréditaire la plus courante.27,28un reinla maladie se caractérise par le développement de kystes qui entraînent la destruction complète du rein.28 comme l'expansion extatique des tubes collecteurs (CD), comme dans la polykystose autosomique récessiveun reinmaladie; ou exclusivement dans les tubules médullaires, comme dans la néphronophtise (NPHP).27,29 Cependant, comment les kystes se développent en 3D (Tridimensionnel) et s'organisent les uns avec les autres et les tubulesis voisins normaux encore inconnus.
Ici, nous avons combiné la compensation optique avec la microscopie multiphotonique pour fournir de nouvelles informations sur la façon dontnéphronssont façonnés et organisés dans les conditions physiologiques et comment ils sont modifiés au cours de la maladie, comme la cystogenèse. Nos résultats montrent qu'il existe 3 types denéphronset que les vaisseaux peuvent influencer l'organisation spatiale des néphrons. Fait intéressant, nous avons observé que les néphrons ont tendance à se trouver dans des plans spécifiques. De manière inattendue, lorsque nous avons appliqué cette technique à des souris jck, nous avons observé que les kystes se développaient uniquement dans des segments de néphrons spécifiques avec des kystes fusiformes entremêlés avec des tubules normaux.
Cliquez pourCistancheEffets secondairespour les maladies rénales
RÉSULTATS
Montage expérimental
Pour étudier la forme de l'ensemblenéphronspar rapport à leur environnement, nous avons adopté une technique basée sur la compensation optique et la microscopie multiphotonique (Figure supplémentaire S1A). En comparant différents protocoles de compensation optique, nous avons déterminé que pour leun rein, l'alcool benzylique/benzoate de benzyle (BABB) était le plus approprié en termes d'efficacité (Figures supplémentaires S1B et C et Tableau supplémentaire S1).
3D (Tridimensionnel) la reconstruction et le traçage numérique nécessitent des images de haute qualité avec une haute résolution et un rapport signal/fond élevé. Nous avons observé que le signal optique fourni par la fluorescence native n'était pas uniforme sur les coupes de rein. En particulier, les images de la moelle étaient peu contrastées avec un faible rapport signal sur fond (Figure supplémentaire S2). Pour améliorer le rapport signal sur fond, nous avons coloré les sections avec de l'acide périodique–Schiff (SupplementaryFigure S1D), car nous avons constaté de manière empirique que cette coloration donnait lieu à un contraste élevé dans les sections minces pendant la 2-photonfluorescence. Cependant, le signal n'était pas uniforme tout au long de l'épaisseur de l'acide périodique Schiffun reinsections (Figure supplémentaire S1E). Par conséquent, nous avons coloré des coupes rénales avec des lectines couplées au fluorochrome : l'agglutinine d'arachide et l'agglutinine de germe de blé, qui colorent les glomérules et les tubules, et l'agglutinine de Griffonia simplicité I folia, qui marque les vaisseaux sanguins. a été considérablement augmenté dans les coupes de rein entier, avec une amélioration significative à la fois dans le plan XY et dans l'axe z (Figure supplémentaire S1E et Film supplémentaire S1).
Visualisation 3D du segment de néphron
Pour visualiser la forme de l'ensemblenéphrons, nous avons tracé les chemins, commençant au pôle urinaire du glomérule et se terminant à la jonction CD (Supplémentaire Film S2). Malgré le fait que les lectines utilisées lient globalement tous les segments de néphron, nous avons remarqué que lorsqu'elles étaient soigneusement inspectées, les sélectines étaient caractérisées par un motif spécifique dans la manière dont elles coloraient les membranes basales ou luminales dans les différents segments de néphron. En d'autres termes, nous avons profité du modèle stéréotypé de coloration de la lectine pour identifier les différents segments de néphron. De cette manière, nous avons pu facilement identifier 6 entités : tubule proximal (PT), branche mince (TL) du Henleloop (HL), branche ascendante épaisse (TAL) du HL, tubule contourné distal (DCT), tubule de connexion (CNT), et CD. La transition entre PT et TL a été caractérisée par la perte soudaine du signal typique de bordure en brosse PT et par la diminution de la largeur de la lumière, qui était presque pratiquement absente dans TL (Figure 1a). À l'inverse, la transition entre TL et TAL a été caractérisée par une augmentation significative du diamètre tubulaire externe et une largeur de lumière relativement constante (Figure 1b). Dans tous les néphrons, la transition de TAL à DCT a été systématiquement trouvée au pôle vasculaire du glomérule. Cette transition a été caractérisée par un élargissement soudain du diamètre tubulaire externe qui était principalement dû à une augmentation significative du diamètre de la lumière (Figure 1c). La transition entre le DCT et le CNT a été caractérisée par une réduction du diamètre tubulaire et de la lumière (Figure 1d). Enfin, la connexion entre le CNT et le CD cortical a été caractérisée par une augmentation soudaine du diamètre tubulaire et de la lumière (Figure 1e). La quantification de ces transitions morphologiques était statistiquement significative (Figure 1f) et sa pertinence a été vérifiée avec une coloration avec des marqueurs tubulaires spécifiques (Figures supplémentaires S3-S5 et Film supplémentaire S3-S5).
La forme et la taille des PT diffèrent selon leur profondeur
La coloration d'épaisseurun reinLes coupes nous ont permis de tracer les coordonnées de l'évolution spatiale de segments PT entiers. Fait intéressant, nous avons découvert que leur forme était extrêmement variable et déterminée par la position de leurs glomérules dans le cortex. Globalement, nous avons identifié 3 modèles. Le premier correspondait au plus superficielnéphrons(SN) (Figure 2a ; Film supplémentaire S6), qui occupait la partie la plus externe du cortex (les 30 % les plus externes à proximité de la capsule rénale). Leurs parties alambiquées formaient des structures compactes avec seulement 6 à 7 circonvolutions autour de leur propre glomérule, occupant des espaces très petits et serrés. La convolution de ces SN se terminait par une pars recta longue et droite qui descendait dans la moelle. À l'extrémité opposée de ce spectre, nous avons observé un deuxième modèle de néphrons situés dans la partie la plus profonde du cortex (40 % de profondeur interne en plus), à côté de la moelle (néphrons juxtamédullaires [JN]) (Figure 2a ; Figure supplémentaire S6 et Film supplémentaire S6). Leurs TP étaient caractérisés par une première boucle courte qui descendait systématiquement vers la papille puis se tournait en U pour remonter vers la capsule rénale. Contrairement aux SN, les tubules contournés proximaux de JN étaient caractérisés par de grandes bobines qui évoluaient autour de leur propre glomérule et occupaient de grands domaines lâches dans le cortex juxtamédullaire. La partie alambiquée du PT des JN avait 10 à 15 circonvolutions, formant de grands domaines. Enfin, le troisième modèle comprenait des néphrons situés dans la partie médiane du cortex (néphrons moyens [MN]) (Figure 2a ; Film supplémentaire S6). Fait intéressant, ces tubules avaient une forme et une orientation spatiale qui représentaient une transition entre les SN et les JN. En fait, ils contenaient 8 à 9 convolutions avec des bobines plus grandes que les SN, mais plus petites que les JN. De plus, les MN avaient une pars recta plus longue que les JN. Il est intéressant de noter qu'une comparaison globale des formes des PT a montré que les SN et les MN avaient un schéma homogène, tandis que les JN étaient extrêmement hétérogènes (Figure supplémentaire S6). De plus, la reconstruction spatiale de plusieursnéphrons a révélé que les PT ne se mélangent jamais (SupplementaryMovie S6), indiquant que chaque néphron occupe son propre espace individuel dans le cortex.
Les analyses morphométriques ont confirmé les grandes différences de taille et de forme des SN et des JN, avec un aspect intermédiaire pour les MN. Le PT des JN était plus de 2- fois plus long que le PT des SN (Figure 2b) ; cependant, la rectitude était plus grande dans les SN que dans les JN (Figure 2c), ce qui correspond à l'observation selon laquelle les tubules JN étaient beaucoup plus tortueux (Figure 2a; Figure supplémentaire S6).
Figure 1|Critères morphologiques utilisés pour identifier les segments de néphron. ( a - e ) Morphologie des différents segments des souris néphron incontrol.Néphronsont été tracées du pôle urinaire du glomérule au tube collecteur (tubule proximal [PT] : turquoise ; branche fine [TL] de l'anse de Henle : gris clair ; branche ascendante épaisse [TAL] de l'anse de Henle : gris foncé ; partie distale tubule contourné [DCT] : rose ; tube conjonctif [CNT] : jaune ; canal collecteur cortical [CCD] : orange). Les flèches indiquent le diamètre des différents segments de néphron. (A continué)
Figure 1|(Suite) (f) Quantification du diamètre tubulaire externe des différents segments de néphron. Les données sont exprimées en moyenne±MEB.Analyse de la variance suivie du test de Tukey-Kramer : **P < 0.01, ***P < 0,001.
Figure 2 |Tridimensionnel(3D) la reconstruction du tubule proximal révèle 3 formes et organisations différentes. (a) Images de reconstruction 3D représentatives des tubules proximaux à travers tout le cortex rénal, divisés en 3 niveaux (lignes blanches) selon la forme des tubules proximaux (PT) : cortex superficiel (bleu), moyen (vert) et juxtamédullaire (rouge), correspondant respectivement aux 30 % externes, aux 30 % moyens et aux 40 % internes du cortex. Notez les différentes formes des 3 types denéphronset en particulier la longueur et la tortuosité des tubules juxtamédullaires. Barre{{0}} mm. (b,c) Quantification de la longueur (b) et (c) de la rectitude des 3 types de tubules proximaux. (d) Quantification du volume de glomérules de chaque région du cortex. Les données sont exprimées en moyenne SEM. Analyse de variance suivie du test de Tukey-Kramer : TP juxtamédullaire versus TP superficiel : ###P < 0.001 ;="" pt="" juxtamédullaire="" versus="" pt="" moyen="" :="" ***p="">< 0,001="" ;="" pt="" superficiel="" versus="" pt="" moyen="" :="" $$$p=""><>
Figure 3 |Tridimensionnel(3D) la reconstruction du néphron révèle 3 types différents de néphrons. ( a ) Images 3D représentatives d'un néphron entier (panneaux de gauche) des glomérules au canal collecteur dans le cortex superficiel (bleu), le cortex moyen (vert) et la région juxtamedullaire (rouge) chez les souris témoins. Segmentation des néphrons (panneaux de droite) pour les 3 différents types de néphrons. Barre=150 mm. (b) Quantification de la distance interne entre les 2 membres de la boucle de Henle pour les 3 types de néphrons. (c) Quantification de la longueur du néphron pour le (suite)
Figure 3|(suite) 3 types denéphrons. (d) Quantification de la longueur des différents segments du néphron selon le type de néphron. Les données sont exprimées en moyenne±SEM. Analyse de variance suivie du test de Tukey-Kramer : néphron juxtamédullaire (JN) versus néphron superficiel (SN) : ###P < 0.001 ;="" jn="" versus="" néphron="" moyen="" (mn)="" :="" *p="">< 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" tubule="" de="" connexion ;="" dct,="" tubule="" contourné="" distal ;="" pt,="" tubule="" proximal ;="" tal,="" branche="" ascendante="" épaisse="" de="" l'anse="" de="" henle ;="" tl,="" branche="" fine="" de="" l'anse="" de="">
La taille des glomérules varie avec la profondeur
Nous avons ensuite analysé la profondeur et le diamètre des glomérules choisis au hasard dans chacune des 3 zones. Les analyses morphométriques ont révélé que les glomérules étaient situés en moyenne à 783 et 355 mm de la capsule rénale chez les JN et les SN, respectivement. Comme indiqué précédemment, nous avons observé que la taille des glomérules variait en fonction de leur profondeur. En particulier, le volume glomérulaire des JN était 3 fois supérieur à celui des SN et des MN (Figure 2d).
Reconstruction de néphron 3D
Nous avons ensuite retracé l'évolution spatiale de l'ensemblenéphronsde PT à CNT. La vue globale de leur 3D (Tridimensionnel) La reconstruction a confirmé que la forme du néphron différait entre les SN, les MN et les JN (Figure 3a ; Film supplémentaire S7). Cette différence était principalement due à la structure de PT. De plus, nous avons observé que HL avait une organisation spatiale 3D différente. En particulier, TL et TAL étaient plus éloignés dans les JN que dans les SN et les MN (Figure 3b). Les analyses morphométriques ont révélé que les JN étaient globalement 2- fois plus longs que les SN (Figure 3c). La longueur accrue était proportionnellement distribuée dans tous les segments, à l'exception de TAL et DCT, qui avaient tendance à avoir une longueur absolue similaire dans tous les types de néphrons (Figure 3d). Cela suggère que l'allongement du néphron est un processus étonnamment homogène.
Les vaisseaux arqués influencent la convolution PT juxtamédullaire
Pour avoir une vision plus globale de laun reinstructure, nous avons profité de la coloration Griffonia simplicifoliaagglutinine, qui nous a permis de tracer les vaisseaux arqués et leurs branches dans les vaisseaux corticaux radiés (Figure 4a; Film supplémentaire S8). Fait intéressant, la 3D concomitante (Tridimensionnel) la reconstruction des néphrons et des vaisseaux a montré que les vaisseaux arqués ont tendance à être dans une organisation spatiale parallèle surprenante avec des tubules à proximité. En particulier, nous avons observé que la trajectoire suivie par des JN spécifiques (JN contraints) a tendance à suivre la trajectoire du navire à proximité (Figure 4b ; Film supplémentaire S9). Remarquablement, ce biais (observé uniquement dans un sous-ensemble de JNnéphrons) expliquait la grande hétérogénéité des formes de PT (SupplementaryFigure S6). Les analyses morphométriques ont révélé que les PT "contraints" étaient significativement plus longs et plus tortueux (rectitude réduite) que les "non contraints" (Figure 4c et d). Il convient de noter que les parties alambiquées des SN et des MN étaient positionnées au-dessus des vaisseaux arqués et n'étaient pas contraintes.
Cistanche-maladie rénale chronique
Les tubules ont tendance à se trouver dans des plans
Fait intéressant, une inspection de la 3D (Tridimensionnel) formes denéphronsont indiqué qu'ils ont tendance à se trouver dans des avions (Figure 5a ; Film supplémentaire S10). Pour quantifier ce paramètre et évaluer l'éventuel biais statistique de cette conformation, nous avons mesuré la tendance générale des tubules à se courber hors du plan défini par leurs boucles. Nos mesures ont montré que par rapport à un modèle simulé de marche aléatoire généré avec le même ensemble d'angles mesurés consécutifs et de longueur entre des points consécutifs (Figure 5b), les tubules avaient tendance à évoluer avec une plus petite déviation par rapport à un plan (Figure 5c). Cela indiquait que les tubulus tendaient à restreindre leur trajectoire le long d'un plan. Les différences observées étaient hautement statistiquement significatives (P <>
La reconstruction 3D du néphron révèle un schéma spécifique de développement des kystes
Pour déterminer si notre protocole permet de tracer des néphrons dans des tissus pathologiques désorganisés, nous avons caractérisé les formes et la distribution spatiale des kystes chez les souris jack, un modèle largement utilisé de NPHP et de maladie kystique.31–33 3Les images D ont montré qu'en dépit de la apparition de kystes proéminents, la 3D générale (Tridimensionnel) le cours des néphrons ne différait pas significativement de celui des souris témoins (film supplémentaire S11). De même, des analyses morphométriques ont confirmé que la longueur globale denéphrons, le volume glomérulaire et la longueur de chaque segment de néphron étaient comparables à ceux des souris témoins (Figure supplémentaire S7). Il convient de noter qu'en raison du développement de kystes, nous n'avons pas pu différencier TL de TAL dans HL. Tous les néphrons ont développé des kystes fusiformes (SupplementaryMovies S11 et S12). L'une des caractéristiques les plus frappantes était l'observation que des dilatations kystiques fusiformes se produisaient à plusieurs endroits le long du même segment de néphron (films supplémentaires S12 et S13). Curieusement, nous avons observé que les kystes ne se sont jamais développés dans les membres PT et HL descendants (Figure 6a ; Film supplémentaire S12). En revanche, ils ont été principalement détectés dans les membres ascendants HL, les DCT, les CNT et dans la partie supérieure des CD, en continuité avec le CNT (Figure 6a; Film supplémentaire S12). En particulier, nous avons observé que les segments DCT, ainsi que les segments CNT, avaient une probabilité particulièrement accrue de développer des kystes dans leurs parties respectives plus distales (Figure 6b). Des analyses morphométriques quantitatives d'images de reconstruction 3D ont révélé que le volume total de kyste par néphron était particulièrement élevé dans le CNT (Figure 7a). De plus, nous avons observé que les élargissements de kystes dans HL et DCT étaient plus importants dans les JN que dans les SN et les MN (Figure 7a; Film supplémentaire S12). De plus, l'incidence des kystes était significativement plus élevée dans les JN que dans les autres types denéphrons(Figure 7b). Nous avons également observé que la distance interglomérulaire moyenne (calculée sur les 5 glomérules les plus proches) avait tendance à être particulièrement augmentée chez les souris inkystiques, en particulier dans le cortex plus superficiel (Figure supplémentaire S8).
Figure 4|Les vaisseaux déterminent la forme du néphron. (un)Tridimensionnelreconstruction de l'architecture des vaisseaux depuis les vaisseaux arqués jusqu'aux vaisseaux corticaux radiés. Barre ¼ 200 mm. (b) Images représentatives des tubules proximaux juxtamédullaires "non contraints" (panneau supérieur) et "contraints" (panneau inférieur). Barre ¼ 100 mm. (c, d) Quantification de la longueur (c) et (d) de la rectitude des tubules proximaux juxtamédullaires "non contraints" et "contraints". Les données sont exprimées en moyenne±SEM. Test de Mann-Whitney : "contraint" versus "non contraint" :*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Tridimensionnel) la reconstruction de nombreux kystes a révélé qu'ils étaient extrêmement variables en forme et en volume (Figure 6c ; Films supplémentaires S11 et S13). Dans le membre ascendant HL, les kystes avaient une forme fusiforme avec un petit diamètre. Dans la DCT, les kystes avaient une forme plutôt sphérique et plus grande et étaient intercalés parmi des tubules non dilatés. De manière intéressante, la transition entre DCT et CNT était systématiquement caractérisée par une structure normale non dilatée. En revanche, en CNT, nous avons systématiquement observé une structure kystique dilatée contiguë directement au contact de la CD. Fait intéressant, dans la CD, cette structure s'est progressivement réduite à une taille de tubule normale. Plus distalement, aucun autre kyste n'a pu être détecté dans la partie contiguë du CD. Une autre caractéristique constante était l'organisation spatiale particulière des kystes dans le membre ascendant HL. En fait, bien que les kystes soient plus profonds et plus proches de la boucle dans les SN, ils étaient plus superficiels et plus proches du DCT dans les JN (Figure 6c). Encore une fois, les kystes occupaient une position intermédiaire dans les MN (Figure 6c).
Figure 5|Les tubules de néphron ont tendance à évoluer comme une structure plate. (a) Un trajet typique d'un tubule proximal de néphron. Ce chemin illustre sa tendance à se situer dans un avion. La planéité de l'évolution de la trajectoire peut être mieux vue lorsqu'elle est correctement tournée et alignée avec le point de vue de l'observateur (voir la représentation de droite du même segment tubulaire, qui, sur le côté gauche, est représenté sous un angle différent) . (b) Représentation schématique d'un chemin tubulaire composé de 4 segments (entre 5 points définissant un chemin tubulaire donné montré à titre d'exemple). Le degré auquel les trajectoires ont tendance à « sortir de leur plan » peut être représenté par l'angle indiqué ici par « bêta ». (A continué)
Figure 5|(Suite) Cet angle est mesuré entre le segment p3-p4 par rapport au plan (défini par les points immédiatement précédents p3, p2 et p1) et représenté par un rectangle gris foncé dans le schéma. Le calcul des angles bêta a ensuite été calculé de manière récursive tout au long de l'ensemble des points d'un trajet tubulaire. Pour évaluer l'ampleur du biais de ces angles bêta, nous avons simulé une marche aléatoire (simulation de Monte Carlos [MCs]) en utilisant le même ensemble d'angles alpha consécutifs de chaque trajet tubulaire (mesurés entre tous les segments consécutifs). Cette marche aléatoire a généré un chemin avec un ensemble identique d'angles alpha et d'angles bêta aléatoires. ( c ) Graphiques en violon de la distribution globale des angles bêta et du résultat des MC dans le tubule proximal (PT), le membre mince (TL) de l'anse de Henle, le membre ascendant épais (TAL) de l'anse de Henle, le tubule contourné distal (DCT ), et tubule conjonctif (CNT). MC, P <>
DISCUSSION
Les méthodes histologiques traditionnelles sont limitées dans leur capacité à détecter les changements pathologiques qui affectent la forme globale denéphrons. Ici, nous présentons une approche puissante basée sur la clarification des problèmes qui a le potentiel de répondre à des questions cruciales surun reinarchitecture avec des détails spatiaux sans précédent dans des conditions normales et pathologiques. Nos résultats ont confirmé l'existence de 3 types de néphrons, qui diffèrent par leur emplacement, leur forme et leur taille, en accord avec leurs spécificités fonctionnelles. De plus, nous avons démontré que les néphrons ont tendance à se situer dans des plans et à s'adapter à l'organisation spatiale des vaisseaux. Curieusement, lorsque nous avons appliqué cette technique à un modèle de maladie rénale kystique, nous avons observé que les kystes se développent dans tous les néphrons, mais seulement dans des segments spécifiques. De manière intéressante, nous avons montré que la forme des kystes varie selon le segment du néphron et que le long d'un même néphron, les kystes s'intercalent avec les tubules normaux non dilatés. Au total, ces résultats fournissent la première 3D (Tridimensionnel) caractérisation de l'agencement spatial denéphronset les vaisseaux et surtout fournir la base pour comprendre un processus pathologique, tel que la cystogenèse.
La compensation optique du rein est difficile en raison des niveaux élevés d'autofluorescence et de la densité cellulaire. En comparant différents protocoles de dégagement, nous avons identifié dans BABB une technique puissante pour mettre en œuvre la visualisation et la reconstruction des structures situées dans la partie la plus profonde duun rein, c'est-à-dire la moelle. De plus, BABB est rapide et évolutif et, une fois effacés, les échantillons peuvent être stockés pendant des mois avant l'acquisition des images. Un autre avantage principal de cette technique est son faible coût. Les agents de compensation peuvent entraîner un rétrécissement ou un élargissement des structures.9–17 Cependant, étant donné que ces modifications de la taille des reins sont isotropes, les mesures relatives ne devraient pas être affectées ou biaiser leur interprétation. L'une des limitations les plus importantes est l'annotation des structures qui est très chronophage. Néanmoins, il existe un nombre croissant de techniques basées sur l'apprentissage en profondeur qui devraient rapidement dépasser cette limitation.
Conformément aux résultats obtenus par les techniques classiques, notre étude a montré que les néphrons diffèrent par leur forme et leur longueur selon leur position. En particulier, nous avons observé que les JN ont des PT contournés plus développés et des glomérules plus grands et sont 2 fois plus longs que les SN. L'augmentation de la longueur est le résultat d'un processus harmonieux car l'allongement affecte proportionnellement tous les segments du néphron. Nous avons également observé que les JN ont un HL plus grand. Dans l'ensemble, ces données montrent clairement que la microanatomie des SN et des JN est significativement différente et que les MN présentent des caractéristiques intermédiaires. Fait intéressant, des études physiologiques ont montré quenéphronssont également fonctionnellement différents.2 Les événements morphogénétiques qui sous-tendent ces différences ne sont pas encore connus. Il est donc tentant de supposer que la structure particulière des JN pourrait expliquer la spécificité de leurs fonctions.
Fait intéressant, en fournissant pour la première fois la 3D (Tridimensionnel) reconstruction denéphronset leurs vaisseaux environnants, nous avons découvert une contrainte spatiale entre les vaisseaux arqués et un sous-groupe de néphrons. Ainsi, il est concevable de penser que les vaisseaux peuvent dicter la façon dont les néphrons s'allongent pendant le développement.34,35 L'inspection des formes 3D des néphrons combinée à des simulations informatiques a également révélé que les néphrons ne se mélangent jamais et que chaque néphron a tendance à se situer dans un plan. La signification fonctionnelle de cette observation reste à élucider.
Développement de kystes pendant la polykystoseun reinla maladie est toujours un processus intrigant. Le NPHP, une condition pathologique caractérisée par le développement de kystes, est la maladie génétique la plus courante causant une insuffisance rénale terminale chez les enfants et les adolescents. Vingt gènes NPHP ont été identifiés à ce jour.36 Parmi eux, NEK8 code pour un membre de la famille des kinases liées à l'inmitose A, qui joue un rôle dans la fonction ciliaire et la progression du cycle cellulaire.37 Nek8 était à l'origine caractérisé comme le gène muté chez la souris jck.32 Notamment, il a été démontré qu'une mutation dans le même domaine protéique conduisait à NPHP9 chez l'homme.38 2Des études D ont suggéré que le développement des kystes diffère considérablement entre les différentes formes de maladie polykystique des reins.27,29 En particulier, dans le NPHP, les kystes semblent être dérivés exclusivement à partir de CD et de DCT.31 Bien qu'informatives, ces études immunohistochimiques ne peuvent pas réfuter la possibilité que la perte de marqueurs tubulaires spécifiques39 explique artificiellement cette observation. Ainsi, notre 3D (Tridimensionnel) fournit la première preuve claire que le développement de kystes est un processus qui peut n'impliquer que des segments de néphrons spécifiques. Fait intéressant, bien que NIMA (Never In mitosisgene A) – Related Kinase 8 (NEK8) soit exprimée dans le cytoplasme de tous les segments de néphron, son expression dans les cils est limitée à DCT et CD. Parce que seuls ces segments sont susceptibles de développer des kystes,31 nous pouvons postuler que la perturbation de la fonction ciliaire NEK8 est l'événement crucial pour la formation de kystes. Curieusement, nous avons également observé que les kystes fusiformes sont en continuité avec les tubules normaux non dilatés. Le fait qu'une mutation germinale récessive ne conduise à un phénotype pathologique que dans un sous-ensemble de cellules suggère qu'un second événement pourrait déclencher le développement de kystes dans ces cellules, comme suggéré pour la polykystose autosomique dominante.un reinmaladie.40,41
Figure 6 |TridimensionnelLa reconstruction du néphron (3D) révèle que les kystes ne se développent que dans des segments spécifiques du néphron. (a) Images 3D représentatives avec rendu du volume de kyste d'un néphron entier (panneaux de gauche) des glomérules au canal collecteur dans le cortex superficiel (bleu), le cortex moyen (vert) et la région juxtamédullaire (rouge) chez les souris jack. Segmentation des néphrons (panneaux de droite) pour les 3 types différents denéphrons. Barre=150 mm. ( b ) Probabilité de développer des kystes dans les différents segments de néphron chez les souris jack. (A continué)
Figure 6|(Suite) L'axe horizontal est une longueur normalisée de néphrons correspondant à 50 bacs (tubule proximal [PT], turquoise ; Henleloop [HL], blanc ; tubule contourné distal [DCT], rose ; tubule de connexion [CNT], jaune). ( c ) Images de reconstruction de kystes 3D représentatives avec rendu du volume de kyste du membre ascendant de HL (panneaux de gauche), DCT (panneaux du milieu) et CNT et canaux collecteurs corticaux (CCD) (panneaux de droite) en surface (panneaux supérieurs), moyen (moyen panneaux) et des néphrons juxtamédullaires (panneaux inférieurs) chez les souris jack. Barre= 50 mm.
Figure 7|Caractérisation de la distribution et du volume des kystes dans tout le néphron. (a) Quantification du volume total du kyste (somme des kystes par néphron) pour chaque segment de néphron (boucle de Henle [HL], blanc ; tubule contourné distal [DCT], rose ; tubule de connexion [CNT], jaune) et (b) longueur du tubule occupé par les kystes pour chaque type de néphron (superficiel : bleu ; moyen : vert ; juxtamédullaire : rouge) chez le jackmice. Les données sont exprimées en moyenne±SEM. Analyse de variance suivie du test de Tukey-Kramer : néphron juxtamédullaire [JN] versus néphron superficiel [SN] : #P < 0.05 ;="" jn="" versus="" néphron="" moyen="" [mn]="" :="" *p="">< 0.05,="" **p=""><>
Nous avons également observé que l'élargissement du kyste est plus prédominant chez les JN que chez les SN, du moins en considérant les kystes qui se situent entre le PT et le CNT. De manière constante, il a été rapporté que dans le contexte de la glomérulosclérose, les lésions glomérulaires se retrouvent plus fréquemment dans les JN que dans les SN. se détériorer est une hypothèse intéressante qui mérite d'être approfondie.
En résumé, nous décrivons une nouvelle technique d'imageriereinsen 3D (Tridimensionnel) avec une spécificité moléculaire et une résolution suffisantes pour enregistrer directement la distribution spatiale et quantitative de structures internes spécifiquement marquées(néphrons, vaisseaux et kystes). Compte tenu de la commodité, de la rapidité et de la capacité de quantification directe, nous prévoyons que cette technique deviendra un outil puissant pour comprendre la physiopathologie rénale.
MÉTHODES
Animaux
Toutes les procédures animales ont été approuvées par les "Services Vétérinaires de la Préfecture de Police de Paris" et par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes. Des souris FVB/N âgées de deux mois (n=20) ont été utilisées pour établir la condition expérimentale deun reincompensation. L'étude a ensuite été réalisée chez des souris mâles jack âgées de 2- semaines (n=4) et des compagnons de portée témoins (n = 3).
Préparation des tissus rénaux
Avant de tuer, les souris ont été perfusées, par cathétérisme intracardiaque, avec 25 ml de solution saline héparinée (1000 UI/l) suivis de 75 ml de paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les expériences ont été menées sous anesthésie à la xylazine (Rompun 2 %, Bayer, Leverkusen, Allemagne, 6 mg/g de poids corporel) et à la kétamine (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, France, 120 mg/g de poids corporel).
Pour les études de dégagement,reinsont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 4 heures et incorporés dans de l'agarose à 4 % et des sections de 1,5- mm d'épaisseur entourant le hile rénal ont été coupées et stockées dans du PBS à 4diplôme. Les sections de rein ont d'abord été colorées puis nettoyées.
Pour les études immunohistochimiques sur des sections minces, les reins ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit et des sections incluses dans la paraffine et 4- mm ont été coupées.
Coloration
Acide périodique–Schiff coloration. Le 1,5-mmun reinles coupes ont été incubées dans de l'acide périodique Schiff pur ou dilué à 1:100 avec du PBS pendant 5 minutes à température ambiante avant d'être nettoyées.
Immunohistochimie sur coupes minces incluses en paraffine. Des sections de quatre micromètres de reins inclus en paraffine ont été chauffées pour la récupération de l'antigène et incubées pendant une nuit à 44 degrésavec des lectines couplées au flfluorochrome pour tracer les tubules (rhodamine agglutinine d'arachide [RL-1072-5] et rhodamine agglutinine de germe de blé [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, diluée à 1:200) et segmenter- anticorps primaire spécifique pour représenter des segments tubulaires distincts (lectine de Lotus tetragonolobus biotinylée [B-1325], Vector Laboratories, diluée à 1:100 ; souris anti-calbindine D28K[D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Allemagne, dilué au 1 :200 ; anti-AQP2 de chèvre [C-17], Santa Cruz, dilué au 1 :200). Le lendemain, les coupes ont été incubées avec l'anticorps secondaire pendant 1 heure à température ambiante (conjugué Alexa Fluor 488 [S32354], Invitrogen ; anti-chèvre Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen ; anti-souris AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA ; le tout dilué à 1:500) avant d'être coloré avec du 40,6-diamidino-2-phénylindole. Toutes les images ont été acquises avec un microscope Nikon Eclipse E800 (Champignysur Marne, France) et préparées à l'aide du logiciel Fiji (version 1.50). Coloration de lectine sur coupes épaisses. L'épaisseur de 1,5- mmun reinles coupes ont été incubées à 44 degréspendant 1 mois dans du Texas Red ou des lectines couplées à l'isothiocyanate de fluorescéine : agglutinine d'arachide (RL-1072-5) et agglutinine de germe de blé (RL-1022-5), diluées au 1 : 100 dans 0,1 % d'azoture de PBS et 0,1 % de Triton-X. Les sections ont ensuite été lavées tous les jours pendant 2 semaines avec du PBS avant d'être nettoyées.
Fonction cistanche-rein
Dégagement optique
Pour la compensation de l'échelle, 1.5- mmun reinles sections ont été incubées dans ScaleA2 (urée 4 M, 0.1 % Triton X-100, 10 % glycérol) ou ScaleB4 (8 Murea, 0,1 % Triton X-100 ) pendant 2 semaines, jusqu'à 1 an, à 4diplôme.
Pour la compensation BABB, des sections de rein de 1,5- mm ont été déshydratées dans des rinçages séquentiels d'éthanol à température ambiante. Les échantillons ont ensuite été incubés dans BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) dans un rapport 1:2 pendant au moins 2 jours à 4 degrés.
Acquisition d'images en microscopie biphotonique
Les tissus ont été imagés avec un gel aqueux sur un microscope multiphoton inversé (LaVision BioTec) équipé d'un laser Mai Tai HP Titanium-Sapphire (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (Figure supplémentaire S1A). La longueur d'onde d'excitation était de 815 nm à 8 % de la puissance. Nous avons utilisé un 20Xobjectif à immersion dans l'eau (XLUMPLFL20XW,Olympus [Tokyo, Japon] ; ouverture numérique, 0.95 ; distance de travail, 2,0 mm). Pour l'acquisition de fluorescence, nous avons utilisé un détecteur non décanné à 80 % avec un filtre passe-bande de 593/40 nm.
La première étape consistait en l'acquisition d'images en mosaïque 2D au niveau de la pile z du milieu en utilisant des paramètres d'acquisition sous-optimaux (400 mm x 400 mm et 1 011 x 1 011 pixels, avec un chevauchement de 10 % et une moyenne linéaire à 2) pour guider la sélection des champs centraux les plus pertinents (Figure supplémentaire S9A ). Une fois la grille XY et les champs d'intérêt z définis, les paramètres ont été ajustés pour acquérir des images de haute qualité. Une telle approche réduisait la région d'intérêt à5X12 champs par pile z. Ensuite, nous avons acquis 850 piles z/tranches optiques (taille de pas de 1- mm) entourant le hile rénal dans la partie médiane duun reinsection.
Assemblage, traitement et traçage des images sc/Fidji). Parce que nous avons observé un décalage important entre 2 images adjacentes après l'assemblage, nous avons écrit un programme de correspondance personnalisé en Python. Ce programme compense le décalage d'image, ce qui nous permet d'aligner correctement les images (Figure supplémentaire S9B). Les tubules et les vaisseaux étaient tracés à l'aide du mode manuel du package de traceurs de filaments d'Imaris et joints par un Imaris Xtension que nous avons développé avec MATLAB (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone_Join_ Filament_Tool.zip?dl=0) (Figure supplémentaire S9C). Les glomérules et les kystes ont été reconstruits en 3D en utilisant le mode manuel du package de surface d'Imaris. La 3D (Tridimensionnel) l'organisation spatiale des glomérules a été affichée à l'aide du mode manuel du package de spots d'Imaris.
Morphométrie
La longueur du segment tubulaire, la longueur du néphron et la rectitude ont été déterminées à l'aide du package de traceurs de filaments d'Imaris. Selon le logiciel Imaris, la rectitude a été quantifiée comme le rapport entre la distance entre 2 points et la longueur du trajet du segment de néphron. Trente et un PT et 12 entiersnéphronsont été reconstruits et mesurés chez 3 souris de type sauvage, tandis que 37 PT et 17 néphrons entiers ont été reconstruits et mesurés chez 4 souris jack. Les volumes des kystes et des glomérules ont été déterminés en utilisant le "package de surface" d'Imaris. Trente et un et 34 glomérules ont été mesurés chez des souris de type sauvage et des souris jack, respectivement. Soixante-quatorze kystes ont été mesurés au total.
Les angles "hors du plan" des virages tubulaires (indiqués par "bêta") ont été mesurés entre le plan (défini par 3 points consécutifs) et la direction avec le quatrième point consécutif suivant dans l'espace (Figure 5b). Pour évaluer la signification statistique du biais observé, nous avons simulé la distribution des angles bêta avec une rotation aléatoire des angles bêta (simulation de Monte Carlo) dans des structures composées des mêmes segments avec le même ensemble d'angles alpha.
Pour le calcul de la probabilité de développer une lésion kystique avec des segments de néphron, nous avons représenté chaque néphron par un ensemble de points dans l'espace. Chaque point était annoté en fonction de la présence de kyste par rapport à la structure normale et du type de segment. La probabilité à chaque longueur standardisée (fixée à 50 bacs) a été calculée comme le rapport entre le nombre de points avec annotation kystique et le nombre total de points dans le bac.
Pour le calcul de l'interdistance glomérulaire moyenne, nous avons considéré pour chaque glomérule l'interdistance glomérulaire moyenne calculée sur les 5 glomérules les plus proches.
Analyses de données et statistiques
Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. Les différences entre les groupes expérimentaux ont été évaluées à l'aide d'une analyse de variance suivie, lorsqu'elles sont significatives (P <{{0}}.05), du="" test="" de="" tukey-kramer.="" lorsque="" seulement="" 2="" groupes="" ont="" été="" comparés,="" le="" test="" de="" mann-whitney="" a="" été="" utilisé.="" les="" analyses="" statistiques="" ont="" été="" effectuées="" à="" l'aide="" du="" logiciel="" graph="" prism="" (sandiego,="" ca,="" version="">
DIVULGATION
Tous les auteurs n'ont déclaré aucun intérêt concurrent.
REMERCIEMENTS
Nous remercions le Laboratoire d'Expérimentation Animale et Transgenèse (LEAT), les Plateformes d'Histologie et d'Imagerie de la Structure Fédérative de Recherche Necker pour l'assistance technique. Nous remercions Pierre Isnard, Marie-Claire Gubler et Nicolas Kuperwasser pour la relecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par l'Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de la Recherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Qui suis-je, RochePharma Recherche et Développement Précoce (Bâle, Suisse) , etInstitut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paris,France).
LES CONTRIBUTIONS DE L'AUTEUR
TB, NG et MZ ont conçu et réalisé les expériences et analysé les données. FB, LT, MGT et SG ont également effectué des expériences et analysé les données. MB et CN ont effectué les expériences sur la souris. TB et MZ ont également contribué à la rédaction du manuscrit. GF a révisé le manuscrit. FT et MP ont fourni le cadre conceptuel et conçu l'étude, supervisé le projet et rédigé l'article.
Cistanche-Architecture tridimensionnelle du rein des néphrons
MATÉRIEL COMPLÉMENTAIRE
Fichier supplémentaire (PDF)
Figure S1. Montage expérimental, procédure d'acquisition et traitement d'images.
Figure S2. Limites du signal d'autofluorescence dans les résolutions XY et z.
Figure S3. Une image bidimensionnelle de la transition entre PT et TL sur 4- mm inclus en paraffineun reinsections.
Figure S4. Une image bidimensionnelle de la transition entre TAL et DCT sur des coupes de rein de 4- mm incluses en paraffine.
Figure S5. Une image bidimensionnelle de la transition entre DCT et CNT sur des coupes de rein de 4- mm incluses en paraffine.
Figure S6. La reconstruction tridimensionnelle révèle 3 formes différentes de tubules proximaux.
Figure S7.Tridimensionnelreconstruction révèle que la longueur et la segmentation desnéphronsne sont pas affectés par les kystes.
Figure S8. La densité des glomérules chez les témoins et les kystiquesreins.
Figure S9. Procédure d'acquisition et traitement d'image post-traitement. Tableau S1. Comparaison des méthodes de compensation.Fichier supplémentaire (films)
Film S1. La coloration à la lectine améliore nettement la résolution et le rapport signal sur fond.
Film S2. Tracé du trajet d'un tubule.
Film S3. Reconstruction tridimensionnelle d'un rein dégagé montrant la jonction entre le tubule proximal et la branche fine de l'anse de Henle.
Film S4. Reconstruction tridimensionnelle d'un rein dégagé montrant la jonction entre la branche ascendante épaisse du Henleloop et le tubule contourné distal.
Film S5.Tridimensionnelreconstruction d'un défrichéun reinmontrant la jonction entre le tubule contourné distal et le tubule de connexion.
Film S6. La forme et la taille des tubules proximaux diffèrent selon leur profondeur.
Film S7. Reconstruction tridimensionnelle du néphron chez la souris témoin.
Film S8. Traçage du trajet d'un vaisseau d'un vaisseau arqué à un vaisseau acortical radié.
Film S9. Les vaisseaux arqués modélisent la forme des tubules proximaux juxtamédullaires.
Film S10.Néphronsont tendance à se coucher dans un avion.
Film S11. La reconstruction tridimensionnelle du néphron montre un schéma spécifique de développement du kyste.
Film S12.TridimensionnelLa segmentation du néphron révèle que les kystes se développent dans des segments spécifiques du néphron.
Film S13. Disposition spatiale et interrelations desnéphronset vaisseaux dans une polykystoseun rein.
RÉFÉRENCES
1. RA riche. Une vulnérabilité jusqu'ici non décrite des glomérules juxtamédullaires dans la néphrose lipoïde. Hôpital Bull Johns Hopkins. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Hétérogénéité de la néphronanatomie. Rein Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al.Tridimensionnelreconstruction du néphron du rat. Suis J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB, et al. Reconstruction tridimensionnelle numérique et ultrastructure du tubule proximal de souris. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, et al. Reconstruction tridimensionnelle du néphron de souris. J Am Soc Néphrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Nous pouvons voir clairement maintenant : la compensation optique etun reinmorphométrie. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Techniques de compensation et de marquage des tissus biologiques à grande échelle. Cellules Mol. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Leipzig, Allemagne : S. Hierzel ; 1914.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Échelle : une approche chimique pour l'imagerie par fluorescence et la reconstruction du cerveau transparent de la souris.Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Erturk A, Becker K, Jährling N, et al.Tridimensionnelimagerie d'organes débarrassés du solvant à l'aide de 3DISCO. Protocole Nat. 2012;7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT : une méthode de nettoyage sans détergent ni solvant pour les tissus neuronaux et non neuronaux.Développement. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Compensation optique d'échantillons de cerveau fixes à l'aide de SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY pour cartographier le système nerveux. NatMethods. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY pour une imagerie rapide et haute résolution des tissus intacts. Protocole Nat. 2014;9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Phénotypage unicellulaire dans un tissu intact transparent grâce à la compensation du corps entier. Cellule. 2014;158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, et al. Imagerie du cerveau entier avec résolution unicellulaire utilisant des cocktails chimiques et une analyse informatique. Cell.2014;157:726–739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Imagerie moléculaire tomographique et quantification 3D dans les organes de souris adultes. Nat Methods.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP, et al. Microscopie multiphotonique d'organes de souris nettoyés. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ, et al. iDISCO : une méthode simple et rapide pour immunomarquer de grands échantillons de tissus pour l'imagerie volumique. Cellule. 2014;159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I, et al. Application améliorée de la technologie de compensation électrophorétique des tissus, CLARITY, aux organes solides intacts, y compris le cerveau, le pancréas, le foie,un rein, poumon et intestin. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Augmentation de la pression capillaire glomérulaire et de la taille médiant la glomérulosclérose dans le cortex juxtamédullaire des SHR. Suis J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Imagerie du rein : de la lumière à la microscopie à super-résolution. Nephrol Dial Transplant.2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validation d'une méthode tridimensionnelle de comptage et de dimensionnement des podocytes dans les glomérules entiers. J Am Soc Néphrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Rôle detridimensionnelarchitecture dans le mécanisme de concentration de l'urine de la médullaire interne du rein du rat. Suis J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT, et al. La compensation optique dans le rein révèle un remodelage des tubules médié par le potassium. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. L'imagerie structurale et fonctionnelle combinée du rein révèle des différences axiales importantes dans l'endocytose des tubules proximaux. J Am Soc Néphrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopathies. Cold Spring Harb Perspective Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC, et al. polykystiqueun reinmaladie. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.
29. Wilson PD. Polykystose rénale. N Engl J Méd. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Modifications du schéma de glycosylation au cours du développement embryonnaire du rein de souris révélées par des conjugués de lectine. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Développement de la maladie polycystictidney chez les souris rénales kystiques juvéniles : aperçu de la pathogenèse, des anomalies ciliaires et des caractéristiques communes à la maladie humaine. J AmSoc Néphrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T, et al. Un défaut dans une nouvelle kinase de la famille Nek provoque une maladie rénale kystique chez la souris et le poisson zèbre. Development.2002;129:5839–5846.
33. Franke M, Baeßler B, Bechtel J, et al. Cartographie T2 par résonance magnétique et imagerie pondérée en diffusion pour la détection précoce de la cystogenèse et la réponse au traitement dans un modèle murin de polykystose rénale.Un reinInt. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B, et al. Déterminants moléculaires de la spécialisation vasculaire des néphrons dans leun rein. Nat Commun. 2019;10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Communication endothélio-épithéliale chez les polykystiquesun reinmaladie : rôle de la signalisation du facteur de croissance endothéliale vasculaire. Signal cellulaire. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. De nombreux gènes, une maladie? Génétique de la néphronophtise (NPHP) et des troubles associés à la NPHP. Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Régulation du cycle cellulaire par la famille NEK des protéines kinases. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Les mutations NEK8 affectent la localisation ciliaire et centrosomale et peuvent provoquer une néphronophtise. J Am SocNephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Polarité apico-basale dans les épithéliums de polykystose rénale.Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Les lésions tubulaires toxiques dans les reins des souris à suppression Pkd1-accélèrent la cystogenèse accompagnée d'une dérégulation de la polarité des cellules planaires et des voies de signalisation canonique Wnt. Hum Mol Genet. 2009;18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Un commutateur de développement critique définit la cinétique de la formation de kystes rénaux après la perte de Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mécanisme de l'unique susceptibilité des glomérules corticaux profonds de maturationreinsà la sclérose glomérulaire focale sévère. Pediatr Res. 1990;28:270–276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomancak P. Assemblage globalement optimal de la 3D en mosaïque (Tridimensionnel) acquisitions d'images microscopiques. Bioinformatique. 2009;25:1463–1465.