La thrombomoduline améliore l'insuffisance rénale chronique médiée par le facteur de croissance transformant b1 via la voie du signal du récepteur couplé à la protéine G 15/Akt

Contact:joanna.jia@wecistanche.com/ Whatsapp : 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Uchida1 , Ryo Inoue6 , Liqiang Qin7 , Shujie Wang5, Valeria Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 et Esteban C. Gabazza2,9

1 Département du diabète, du métabolisme et de l'endocrinologie, École supérieure de médecine de l'Université de Mie, Tsu-city, Mie, Japon ; 2 Département d'immunologie, École supérieure de médecine de l'Université de Mie, Tsu-city, Mie, Japon ; 3 Département de médecine pulmonaire et de soins intensifs, École supérieure de médecine de l'Université de Mie, Tsu-city, Mie, Japon ; 4 Département de gastro-entérologie et d'hépatologie, École supérieure de médecine de l'Université de Mie, Tsu-city, Mie, Japon ; 5 Département de régénération neurale et de communication cellulaire, École supérieure de médecine de l'Université de Mie, Tsu-city, Mie, Japon ; 6 Institut central des animaux d'expérimentation, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japon ; et 7 Département de néphrologie, Hôpital de Taizhou, Université médicale de Wenzhou, Lihai, Province du Zhejiang, République populaire de Chine.

Rein International (2020) 98, 1179-1192 ; https://doi.org/10.1016/j.kint.2020.05.041

Copyright ª 2020, Société internationale de néphrologie. Publié par Elsevier Inc. Il s'agit d'un article en libre accès sous licence CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Correspondance : Esteban C. Gabazza, Département d'immunologie, École de médecine de l'Université de Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japon. E-mail : gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp ; ou Yutaka Yano, Diabetes, Metabolism and Endocrinology, Mie University Graduate School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japon. E-mail : yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT et TY ont contribué à parts égales à ce travail. 9 YY et ECG sont co-auteurs principaux. Reçu le 1er septembre 2019 ; révisé le 24 avril 2020 ; accepté le 7 mai 2020

MOTS CLÉS : apoptose ; maladie rénale chronique; récepteur couplé à la protéine G ; thrombomoduline humaine recombinante; facteur de croissance transformant-b1

La fibrose rénale est la conséquence courante des maladies rénales chroniques qui évoluent inexorablement vers une maladie rénale terminale avec défaillance d'organe traitable uniquement par une thérapie de remplacement. Étant donné que le facteur de croissance transformant-b1 est le principal acteur de la pathogenèse de la fibrose rénale, nous avons émis l'hypothèse que la thrombomoduline recombinante peut améliorer la fibrose et l'insuffisance rénales progressives médiées par le facteur de croissance transformant-b1. Pour interroger notre hypothèse, nous avons généré une nouvelle souris transgénique de facteur de croissance transformant humain spécifique au glomérule-b1 pour évaluer l'effet thérapeutique de la thrombomoduline recombinante. Cette souris transgénique a développé une sclérose glomérulaire progressive et une fibrose tubulo-interstitielle avec insuffisance rénale. La thérapie avec la thrombomoduline recombinante pendant quatre semaines a significativement inhibé la fibrose rénale et amélioré la fonction des organes par rapport aux souris transgéniques non traitées. Le traitement avec la thrombomoduline recombinante a significativement inhibé l'apoptose et la différenciation mésenchymateuse des podocytes en interagissant avec le récepteur couplé à la protéine G 15 pour activer la voie de signalisation Akt et réguler positivement l'expression des protéines anti-apoptotique, y compris la survivine. Ainsi, notre étude suggère fortement l'efficacité thérapeutique potentielle de la thrombomoduline recombinante pour le traitement demaladie rénale chroniqueet la défaillance d'organe subséquente.

cistancheboîtetraiter une maladie rénaleaméliorer la fonction rénale

Déclaration de traduction

Fibrose et dysfonctionnement dureinssont actuellement des problèmes de santé majeurs dans le monde. Il n'existe actuellement aucun médicament antifibrotique approuvé pour le traitement de la fibrose rénale. Le facteur de croissance transformant-b1 est le moteur principal et commun de la fibrogenèse rénale dans les maladies rénales chroniques causées par de nombreux troubles. Nous avons découvert ici que la thrombomoduline recombinante, un médicament approuvé au Japon pour traiter la coagulation intravasculaire disséminée, supprime la progression de la sclérose glomérulaire, de la fibrose tubulo-interstitielle et de l'insuffisance rénale causée par la surexpression du facteur de croissance transformant humain-b1, suggérant sa valeur thérapeutique potentielle pour le traitement. demaladies rénales chroniques.

Maladie rénale chroniqueest un problème de santé publique majeur associé à une morbidité et une mortalité élevées qui touche environ 13 % de la population adulte dans les pays développés.1 L'Organisation mondiale de la santé a signalé quemaladie rénale chronique(CKD) était la cause de 1,5 % des décès dans le monde en 2012.1 De plus, des données épidémiologiques récentes indiquent une augmentation mondiale constante du nombre de patients atteints de CKD.2,3 Dans la plupart des cas, le processus pathologique évolue progressivement, conduisant finalement à la fin l'insuffisance rénale de stade, qui peut être traitée uniquement par dialyse à vie ou transplantation rénale.4,5 Le diabète sucré (DM) et l'hypertension artérielle sont les causes les plus fréquentes d'IRC, suivis de l'ischémie, de la glomérulosclérose d'étiologie inconnue, des obstructions urologiques et des infections chroniques.6 Indépendamment de la maladie sous-jacente, la conséquence pathologique finale et courante de l'IRC est la fibrose des reins.7 La fibrose rénale est la cicatrisation et le remodelage aberrants des structures parenchymateuses des reins soumises à des lésions prolongées ou répétitives caractérisées par la présence d'une fibrose tubulo-interstitielle, la glomérulosclérose et l'atrophie tubulaire.8 Le principal moteur de la fibrogenèse rénale est la transformation du fait de la croissance ou (TGF)-b1.8,9 Le TGFb1 peut favoriser la fibrose en stimulant la sécrétion de protéines de la matrice extracellulaire et de facteurs chimiotactiques ou de facteurs de prolifération des fibroblastes, en inhibant les métalloprotéinases et en favorisant la transition épithéliale-mésenchymateuse.10 Outre le traitement de la maladie sous-jacente , un médicament approuvé qui cible spécifiquement la fibrose rénale n'est actuellement pas disponible.6

La thrombomoduline (TM) est une glycoprotéine transmembranaire dotée de multiples fonctions biologiques, notamment la modulation du système de coagulation, la réponse immunitaire, les réactions inflammatoires et la survie cellulaire.11 La structure moléculaire de la TM contient un domaine de type lectine, 6 domaines de type facteur de croissance épidermique , un domaine riche en sérine/thréonine, une partie transmembranaire et une queue cytoplasmique.12 La thrombine, un facteur procoagulant généré lors de l'activation du système de coagulation, devient un facteur anticoagulant et antifibrinolytique après liaison à la TM.13 Le complexe TM-thrombine augmente la génération de la protéine C activée (APC), un anticoagulant doté d'une activité anti-inflammatoire et cytoprotectrice, en activant la protéine C. De plus, la TM seule peut réguler directement à la baisse la réponse inflammatoire en inhibant l'activité de la protéine B du groupe à haute mobilité-1 (HMGB1), en supprimant les cellules dendritiques immunogènes, les éosinophiles, les mastocytes et le système du complément.13–18

Des résultats publiés montrent les effets préventifs de la MT dans la rénopathie diabétique et les lésions rénales d'ischémie-reperfusion.19-21 Cependant, aucune étude n'a évalué l'effet de la MT recombinante sur la fibrose rénale progressive induite par le TGFb1, un facteur courant de fibrose rénale chez les plusieurs maladies causant une MRC. Nous avons posé l'hypothèse que la TM peut améliorer la fibrose rénale et l'insuffisance rénale médiées par le TGFb1-. Pour interroger cette hypothèse, nous avons évalué l'effet thérapeutique de la TM recombinante chez une souris transgénique TGFb1 spécifique au glomérule nouvellement développée qui développe unefibrose rénale et insuffisance rénale.

cistanche pour le rein

RÉSULTATS

L'augmentation des fragments de TM circulants est corrélée à un dysfonctionnement rénal

La TM, une glycoprotéine liée à la membrane des cellules endothéliales, est clivée en fragments, perdant ses fonctions protectrices lors d'une lésion endothéliale.22 La néphropathie diabétique est associée à une lésion endothéliale.23,24 Les patients atteints de DM avec néphropathie, par rapport aux patients sans néphropathie, ont montré des taux circulants de TM (4,4 contre 3,3 pg/ml) et de TGFb1 actif (0.28 contre 0.24 ng/ml) (tableau supplémentaire S1, figure supplémentaire S1A). La TM est significativement corrélée à la créatinine, au TGFb1 actif et à la podocine soluble (Figure supplémentaire S1B). Ces observations suggèrent qu'une perte de TM fonctionnelle liée à la membrane est associée à une libération accrue de TGFb1 actif et à un dysfonctionnement rénal.

Souris TG avec une expression spécifique du glomérule du gène TGFb1 humain complet

Nous avons développé une souris TG surexprimant le gène TGFb1 humain complet dans les podocytes. La souris a été générée en plaçant le TGFb1 humain sous le contrôle du promoteur de la podocine sur une construction de chromosome artificiel bactérien (BAC) (Figure supplémentaire S2 ; Figure supplémentaire S3). Nous avons obtenu 5 souris fondatrices exprimant 3 copies et 3 souris fondatrices exprimant 1 copie du transgène TGFb1 humain. L'expression du transgène était spécifique au rein et la progéniture des fondateurs était viable (Figure supplémentaire S3). Les souris avaient des grossesses à terme et la portée était de taille normale. Les souris sont nées dans le rapport mendélien attendu.

Pour caractériser les souris TG, nous avons mesuré plusieursparamètres rénauxtoutes les 4 semaines pendant une période de 16 semaines (Figure supplémentaire S4). Les concentrations plasmatiques et urinaires de TGFb1 ont été considérablement augmentées chez les souris TGFb 1- TG par rapport aux souris de type sauvage (WT) dès les premières semaines après la naissance, puis sont restées stables à un niveau élevé (Figure 1a). Les souris TGFb1-TG ont montré une augmentation significative de la teneur en hydroxyproline du tissu rénal à la 20e semaine (190.5 contre 96.0 mg/rein ), l'expansion mésangiale à partir de la 4e semaine (scores de 1,9 contre 1,1) et le dépôt de collagène à partir de la 12e semaine (0 0,9 % contre 0,1 %) après la naissance par rapport à leurs homologues WT (Figure 1a–f ). La microscopie optique conventionnelle a montré un élargissement de la membrane basale de la capsule de Bowman, un épaississement de la membrane basale glomérulaire, une augmentation du dépôt de collagène dans les espaces mésangiaux et interstitiels et une atrophie tubulaire (Figure 1bd). La microscopie électronique à transmission a montré une glomérulosclérose, y compris une transformation microvillositaire et un effacement des processus du pied des podocytes, une diminution de la fenestration endothéliale capillaire glomérulaire, un épaississement de la membrane basale glomérulaire et une augmentation du dépôt de matrice mésangiale (Figure 2a – i). Les concentrations urinaires des marqueurs précoces de la néphropathie Fatty acid-binding protein (185,1 vs. 87,0 pg/ml) etlésion rénalela molécule 1 (441,9 contre 256,9 pg/ml) ont été considérablement améliorées chez les souris TGFb1-TG à partir de la 4e et de la 8e semaine, respectivement, par rapport à leurs souris WT du même âge (Figure supplémentaire S5). La protéinurie totale et le rapport protéine-créatinine totale dans l'urine ont augmenté de manière significative aux 4e, 8e, 12e, 16e et 20e semaines chez les souris TGFb1-TG par rapport à leurs homologues WT (Figure 3a) . Le taux plasmatique d'azote uréique sanguin a été significativement élevé à partir de la 4e semaine (5,1 contre 4,1 mg/dl) et la concentration de créatinine à partir de la 8e semaine (1,1 contre 0,4 mg/dl) chez les souris TGFb1-TG par rapport à leurs homologues WT (Figure 3b).

rhTM inhibe la glomérulosclérose et la fibrose tubulo-interstitielle

Par rapport aux souris TGFb{{0}}TG traitées avec une solution saline (SAL) et aux souris WT traitées avec de la TM humaine recombinante (RH) ou SAL, les souris TGFb1-TG traitées avec le rythme ont montré une réduction significative de la mésangiale expansion/cellularité (score de 1,3 contre 3.{{30}}) et dépôt de collagène tubulo-interstitiel significativement faible et glomérulosclérose (121,3 % contre 139,7 %) (Figure 4a–e). Conformément à ces observations, la teneur en hydroxyproline (11,7 contre 19,9 mg/g), les concentrations tissulaires rénales de collagène I (101,3 contre 196,7 ng/mg de protéine) et de périostine (21,7 contre 40,8 ng/ mg de protéine), et l'expression relative de l'ARNm du collagène I ont été considérablement réduites dans les tissus rénaux des souris TGFb1-TG traitées avec rhTM par rapport aux tissus rénaux des souris témoins (Figure 4f, Tableaux supplémentaires S2 et S3). La microscopie électronique à transmission a montré une réduction significative de l'effacement des processus du pied des podocytes et de l'épaississement de la membrane basale glomérulaire chez les souris traitées avec rhTM par rapport aux souris traitées avec SAL seul (Figures supplémentaires S6AB et B). De plus, les concentrations dans les tissus rénaux de la protéine chimioattractante monocyte des cytokines profibrotiques-1 (45,0 contre 76,1 pg/mg de protéine), de l'interleukine-13 (612,1 contre 1002,0 pg/mg de protéine) et du TGFb1 actif (131,0 contre 151,5 pg/mg de protéine) ont été considérablement réduits chez les souris TGFb1-TG traitées avec rhTM par rapport aux souris témoins (Figure supplémentaire S7). La concentration de HMGB1 dans les tissus rénaux a également diminué de manière significative dans les tissus rénaux des souris TGFb1-TG traitées avec rhTM par rapport àtissus rénauxà partir de souris témoins (Figure supplémentaire S7). La concentration plasmatique du complexe thrombine-antithrombine a été significativement augmentée dans le groupe TGFb1-TG/SAL par rapport au groupe WT/SAL, mais aucune différence n'a été trouvée entre les groupes TGFb1-TG/rhTM et WT/rhTM (Figure supplémentaire S8A). Comme prévu, il y avait une forte concentration de TM dans le plasma des souris TGFb1-TG et WT traitées avec rhTM. La concentration plasmatique du complexe APC/antitrypsine a été significativement diminuée dans le groupe TGFb1-TG/SAL par rapport aux groupes WT/SAL et TGFb1-TG/rhTM (280,5 contre 384,6 pg/ml) , et il n'y avait aucune différence significative dans le niveau d'inhibiteur de l'activateur du plasminogène -1 (Figure supplémentaire S8A). Les taux de C5a dans le plasma, l'urine ettissu rénal(630.1 contre 1 075,0 pg/mg de protéine) et la podocine soluble dans le plasma ont été significativement réduites chez les souris TGFb1-TG traitées avec rhTM par rapport aux souris TGFb1-TG traitées avec SAL (Figure supplémentaire S8B). Le niveau de podocine dans l'urine était plus élevé dans le groupe TGFb1-TG/SAL que dans les groupes WT/SAL et TGFb1-TG/rhTM (Figure supplémentaire S9A–C).

Figure 1|La souris transgénique (TG) du facteur de croissance transformant humain b1 (TGFb1) développe une fibrose rénale progressive. ( a ) Les concentrations de protéine TGFb1 dans le plasma et l'urine ont été mesurées par dosage immunitaire enzymatique et la teneur en hydroxyproline tissulaire par un dosage colorimétrique. (b–d) Des sections de tissu rénal ont été colorées avec (b) de l'acide périodique–Schiff (barres ¼ 20 mm) et avec (c,d) du trichrome de Masson (barres ¼ 10{{ 40}} mm) puis (e,f) quantifié à l'aide d'un système de notation ou du logiciel d'imagerie WinROOF (Mitani Corporation, Tokyo, Japon). Le nombre de souris pour l'évaluation des tissus rénaux : pour les souris de type sauvage (WT), n ¼ 4 à 4, 12 et 20 semaines ; pour les souris TG, n ¼ 7 à 4 semaines, n ¼ 8 à 16 semaines et n ¼ 9 à 20 semaines. Le nombre de souris pour l'évaluation du plasma et de l'urine : pour les souris WT, n ¼ 12 à 4 semaines, n ¼ 8 à 8 semaines, n ¼ 7 à 12 semaines et n ¼ 4 à 16 et 20 semaines ; pour les souris TG, n ¼ 24 à 4 semaines, n ¼ 17 à 8 et 12 semaines et n ¼ 9 à 16 et 20 semaines. Les données sont exprimées en écart interquartile médian. Analyse statistique par test U de Mann-Whitney. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p="">< 0,0001.="" ns,="" non="" significatif.="" pour="" optimiser="" la="" visualisation="" de="" cette="" image,="" veuillez="" consulter="" la="" version="" en="" ligne="" de="" cet="" article="" sur="">

Figure 2|Résultats au microscope électronique à transmission dans le modèle de fibrose rénale induite par le facteur de croissance transformant b1. La fixation, la manipulation et le retrait des reins des souris ont été effectués comme décrit dans les méthodes. (a,b) Transformation microvillositaire et (a,b,d,e,g) effacement du processus du pied (têtes de flèches blanches) des podocytes, (c–e) diminution de la fenestration endothéliale capillaire glomérulaire (têtes de flèches jaunes), (f) épaississement du la membrane basale glomérulaire (astérisques) et (h,i) un dépôt accru de matrice mésangiale (flèches blanches) sont présents. CL, lumière capillaire. Pour optimiser la visualisation de cette image, veuillez consulter la version en ligne de cet article sur www.kidney-international.org.

rhTM améliore la fonction rénale

Les niveaux de protéine de liaison aux acides gras L (197,0 contre 313,4 pg/ml),molécule de lésion rénale1 (299,9 contre 596,2 pg/ml), l'azote uréique du sang (12,9 contre 34,8 mg/dl), la créatinine (00,5 contre 1,4 mg/dl) et le rapport albumine-créatinine ont significativement diminué chez Souris TGFb1-TG atteintes de fibrose rénale traitées avec rhTM par rapport à leurs homologues TG non traités (Figure 5). Le taux de protéines totales dans l'urine et le rapport protéines totales créatinine ont également diminué chez les souris TGFb1-TG traitées avec rhTM par rapport à leurs homologues non traités (Figure 5).

rhTM réduit l'apoptose des cellules glomérulaires

La coloration terminale par marquage dUTP médiée par la désoxynucléotidyl transférase a montré une diminution significative du nombre de cellules apoptotiques dans les glomérules de souris TGFb1-TG traitées avec rhTM par rapport aux glomérules de souris TGFb1- TG traitées avec SAL (supplémentaire Figures S10A et B). Le clivage de la caspase-3 a également été considérablement réduit dans les tissus rénaux des souris TGFb1-TG traitées avec rhTM par rapport aux tissus rénaux des souris TGFb1-TG traitées avec SAL (Figure supplémentaire S10C). Latissus rénauxdes souris TGFb1-TG traitées avec rhTM, comparées à celles de TGFb1-TG traitées avec SAL, ont montré une élévation significative des niveaux d'ARNm du lymphome à cellules B 2 (Bcl-2), B -cell lymphoma-extra large (Bcl-XL), un inhibiteur baculoviral de l'apoptose contenant 5 répétitions (BIRC5, également connu sous le nom de survivine) et BIRC6 (Apollon) avec une augmentation du rapport Bcl-2–Bax (Figure supplémentaire S11 ).

Figure 3|La souris transgénique (TG) du facteur de croissance transformant humain b1 (TGFb1) a un dysfonctionnement rénal. (a) Les protéines totales et (b) l'azote uréique du sang (BUN) ont été mesurés par des méthodes colorimétriques et la créatinine par une méthode enzymatique. Le nombre de souris pour l'évaluation du plasma et de l'urine : pour les souris de type sauvage (WT), n ¼ 12 à 4 semaines, n=7 à 8 et 12 semaines, et n=4 à 16 et 2{ {21}} semaines ; pour les souris TG, n =24 à 4 semaines, n=17 à 8 et 12 semaines, et n=9 à 16 et 20 semaines. Les données sont exprimées sous forme de médiane ± écart interquartile. Analyse statistique par test U de Mann-Whitney. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ****p=""><>

rhTM inhibe l'apoptose des podocytes

Le prétraitement des podocytes avec du rhTM a considérablement réduit l'apoptose des podocytes cultivés en présence de TGFb1, tel qu'évalué par le nombre de cellules dans la phase subG1 (3,2 % contre 5,2 %) 1.0 contre 5,4 cellules/Fifield) et le degré de clivage de la caspase-3 (rapports 0.9 contre 1,1) (Figure 6a–e). Le criblage de facteurs anti-apoptotique dans des podocytes en culture a montré que le rhTM augmente de manière significative l'expression de l'ARNm du facteur anti-apoptotique Bcl -2 par rapport à l'expression dans des cellules non traitées (Figure supplémentaire S12). L'expression de l'ARNm du facteur anti-apoptotique BIRC5 a également augmenté dans les cellules traitées avec rhTM par rapport à l'expression dans les cellules non traitées (Figure supplémentaire S12). L'expression de l'ARNm du facteur pro-apoptotique Bax a été considérablement réduite par le traitement au rhTM par rapport à l'absence de traitement (Figure supplémentaire S12). Le traitement avec rhTM a également inhibé de manière significative l'expression de l'annexine V et de la coloration terminale de marquage dUTP médiée par la désoxynucléotidyl transférase dans les podocytes cultivés en présence de peroxyde d'hydrogène (Figure supplémentaire S13A – E) et dans des conditions de glucose élevé (Figure supplémentaire S14A – E ) confirmant en outre la propriété anti-apoptotique du rhTM sur les podocytes. L'exploration de la voie antiapoptotique de la protéine kinase B (Akt)25 a montré que le rhTM augmentait la phosphorylation d'Akt dans des podocytes primaires humains cultivés en présence de peroxyde d'hydrogène ou de TGFb1 (Figures supplémentaires S15A et B). Nous avons ensuite isolé les podocytes de chaque groupe de souris et évalué la phosphorylation d'Akt par Western blot. Il y avait une phosphorylation significativement améliorée d'Akt dans les podocytes isolés du groupe TGFb{{30}}TG/rhTM par rapport aux podocytes du groupe non traité (rapports de 1,1 contre 0,7) (Figures supplémentaires S16A et B).

Médiation GPR15

Des études antérieures ont rapporté que la TM active les voies intracellulaires en interagissant avec le récepteur 1 du facteur de croissance des fibroblastes (FGFR1) etRécepteur couplé à la protéine G15 (GPR15).26,27 Les podocytes expriment le FGFR128 mais on ne sait pas s'ils expriment le GPR15. Ici, nous avons isolé des podocytes de chaque groupe de souris et montré que les podocytes expriment également GPR15 (Figure supplémentaire S17A – E). Nous avons constaté que les podocytes d'un témoin sain et d'un patient atteint de glomérulosclérose expriment également GPR15 (Figure supplémentaire S18). Pour clarifier si FGFR1 ou GPR15 médie l'activité inhibitrice de rhTM sur l'apoptose des podocytes, nous avons évalué l'activité anti-apoptotique de rhTM dans des podocytes traités au TGFb1- en présence d'inhibiteur de FGFR1 ou après transfection des cellules avec de petits ARN interférents (siRNA) contre FGFR1 ou GPR15. Le prétraitement des podocytes avec un inhibiteur de FGFR1 (Figures supplémentaires S19A et B) ou un siARN de FGFR1 (13,2 % contre 7,9 %) (Figures 7a et b) n'a pas pu abolir l'activité inhibitrice du rhTM sur l'apoptose des podocytes. Cependant, la transfection de cellules avec l'ARNsi GPR15 a complètement aboli l'activité inhibitrice de rhTM (14,6 % contre 13,8 %) surapoptose des podocytes(Figures 7a à c).

Figure 4|La thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) inhibe la glomérulosclérose et la fibrose tubulo-interstitielle. Des coupes de tissu rénal ont été colorées (a, b) avec de l'acide périodique de Schiff et (c, d) avec du trichrome de Masson et (e) ensuite quantifiées à l'aide d'un système de notation ou du logiciel d'imagerie WinROOF. (e) La valeur moyenne du groupe de type sauvage (WT)/saline (SAL) a été prise comme 100 pour cent. Analyse statistique par test U de Mann-Whitney. ( f ) La teneur en hydroxyproline des tissus a été mesurée par une méthode colorimétrique, la concentration de collagène I-a1 (Col1a1) et de périostine par dosage immunoenzymatique et l'expression de l'ARNm par réaction en chaîne de transcriptase inverse-polymérase. Analyse statistique par analyse de variance de Kruskal Wallis et test de Dunn corrigé. n=8 dans chaque groupe. Barres {{10}} (a,c) 50 mm et (d) 20 mm. Les données sont exprimées sous forme de médiane ± écart interquartile. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" tg,="" transgénique;="" tgfb1,="" facteur="" de="" croissance="" transformant="" b1.="" pour="" optimiser="" la="" visualisation="" de="" cette="" image,="" veuillez="" consulter="" la="" version="" en="" ligne="" de="" cet="" article="" sur="">

rhTM inhibe l'EMT des podocytes

Il y avait une zone considérablement augmentée avec une coloration positive pour la podocine et l'actine du muscle lisse (a-SMA) (1,4 % contre 11,2 %) chez les souris TGFb1-TG/SAL par rapport aux souris TGFb1-TG /souris rhTM (Figure 8a et b). Nous avons ensuite cultivé in vitro des podocytes humains primaires, prétraités avec du rhTM avant d'ajouter la protéine TGFb1 au milieu de culture. La morphologie de type fibroblaste et l'expression accrue de l'a-SMA ont été supprimées dans les podocytes traités avec le rhTM par rapport aux cellules non traitées (Figure supplémentaire S20A). De plus, le rhTM a inhibé l'expression de l'ARNm de la fibronectine et de la vimentine, bien qu'il ait amélioré l'expression de l'ARNm de la E-cadhérine dans les podocytes par rapport à l'expression dans les cellules non traitées (Figure supplémentaire S20B). Les membres de la famille SMAD 2 (Smad2) et Smad3 jouent un rôle essentiel dans la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) médiée par le TGFb1-.29 Le traitement par rhTM a supprimé de manière significative l'activation de Smad2 et Smad3 chez les souris TGFb1-TG par rapport aux souris TG non traitées (Figure 8c) et aux podocytes humains cultivés en présence de TGFb1 (Figure supplémentaire S20C).29 Les souris TG traitées avec rhTM (TGFb1-TG/rhTM) montrent également moins d'expression de l'a-SMA (3,7 % contre 17,2 %) dans les cellules épithéliales tubulaires par rapport à leurs homologues non traités (Figures supplémentaires S21A et B).

Figure 5|La thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) améliore les lésions rénales et le dysfonctionnement rénal. La créatinine a été mesurée par une méthode enzymatique ; protéine totale par méthode colorimétrique; et l'azote uréique du sang (BUN) et l'albumine, la molécule 1 de lésion rénale (KIM -1), la protéine de liaison aux acides gras L (L-FABP) et le facteur de croissance transformant total b1 (TGFb1) par dosage immunitaire enzymatique. n=8 dans chaque groupe. Les données sont exprimées en médiane ± intervalle interquartile. Analyse statistique par analyse de variance de Kruskal-Wallis et test de Dunn non corrigé. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0.001,="" ****="" p="">< 0.0001,="" #p="0.06." ns,="" non="" significatif ;="" sal,="" solution="" saline ;="" tg,="" transgénique;="" wt,="" type="">

GPR15 médie l'activité inhibitrice de rhTM sur EMT

La transfection de podocytes avec l'ARNsi du FGFR1 n'a pas été en mesure d'abolir l'activité inhibitrice du rhTM sur les expressions relatives de l'ARNm du collagène I-a1 et de l'a-SMA dans les podocytes traités au TGFb1- (Figure supplémentaire S22). Cependant, la transfection de cellules avec l'ARNsi GPR15 a considérablement aboli l'activité inhibitrice du rhTM sur les expressions relatives de l'ARNm du collagène I-a1 et de l'a-SMA dans les podocytes traités au TGFb 1- (Figure supplémentaire S22).

DISCUSSION

TGFb1 et lésion des cellules glomérulaires

La conséquence courante des troubles causant l'IRC est la fibrose rénale.8,30,31 Le TGFb1 est le moteur commun de la fibrogenèse dans les reins associée à l'IRC causée par des maladies telles que le diabète sucré, l'hypertension artérielle et les maladies auto-immunes.10 Cellules du glomérule et des espaces tubulo-interstitiels peut sécréter les formes latentes de TGFb1 qui, lorsqu'elles sont activées de manière excessive lors d'une lésion tissulaire, peuvent entraîner une cicatrisation rénale.32 Comme le TGFb1 peut stimuler sa propre sécrétion, le processus fibrotique devient généralement un cercle vicieux.8 Un événement précoce dans le processus pathogène du TGFb 1- médiatiséfibrose rénaleest une lésion des podocytes et des cellules endothéliales glomérulaires.33–35 Le taux plasmatique de TM soluble est un marqueur de lésion endothéliale. Conformément au rôle du TGFb1 dans les lésions des cellules rénales, nous avons trouvé ici une corrélation significative du TGFb1 actif avec la TM soluble, la podocine soluble et la créatinine dans le plasma de patients atteints de DM. Interaction entre les cellules endothéliales glomérulaires et les podocytes au cours d'unelésion rénaleconduit à une expression locale de protéases provoquant une dégradation de la membrane basale glomérulaire.34–36 Cela peut expliquer la détection de podocine soluble et sa corrélation significative avec la TM soluble chez nos patients atteints de diabète.

Figure 6|La thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) supprime l'apoptose des podocytes induite par le facteur de croissance transformant b1 (TGFb1). (a) rhTM a été ajouté au milieu de culture des podocytes 1 heure avant d'induire l'apoptose avec 10 ng/ml de TGFb1 pendant 48 heures. ( b ) Le pourcentage de cellules dans la phase subG1 a été détecté par une autre cytométrie. (a,b) n=3 dans chaque groupe. ( c, d ) Le nombre de cellules avec fragmentation de l'ADN a été mesuré par analyse TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick nick end-labeling) (n=3 dans les groupes salins [SAL]/SAL et rhTM/SAL ; n=6 dans les groupes SAL/TGFb1 et rhTM/TGFb1), et (e) le degré de clivage de la caspase-3 a été mesuré par Western blot (n=4 dans chaque groupe). Barres=100 mm. Les données sont exprimées sous forme de médiane ± écart interquartile. Analyse statistique par test U de Mann-Whitney. *P < 0,05.="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-phénylindole ;="" hpf,="" champ="" haute="" puissance ;="" ns,="" non="" significatif.="" les="" histogrammes="" sont="" affichés="" en="" pourcentage="" max="" (pourcentage="" de="" la="" valeur="" maximale),="" mettant="" chaque="" courbe="" à="" l'échelle="" en="" mode="100" pourcentage="" .="" pour="" optimiser="" la="" visualisation="" de="" cette="" image,="" veuillez="" consulter="" la="" version="" en="" ligne="" de="" cet="" article="" sur="">

Fifibrose rénale associée à la surexpression de TGFb1 humain spécifique aux podocytes

Un médicament capable de contrecarrer l'effet du TGFb1 serait idéal pour bloquer la fibrose rénale. Ici, nous avons généré une souris TG surexprimant le gène TGFb1 humain dans le glomérule qui développe une sclérose glomérulaire spontanée et progressive et une fibrose tubulo-interstitielle avec insuffisance rénale dès 4 semaines après la naissance. Le modèle montre une glomérulopathie avancée avec lésion des podocytes et des cellules endothéliales glomérulaires ; épaississement de la membrane basale glomérulaire et expansion mésangiale avec cicatrices interstitielles ; augmentation des marqueurs de lésion des tissus rénaux et de dysfonctionnement rénal ; et augmentation du TGFb1 dans le plasma,tissu rénal, et les urines. L'augmentation de l'excrétion urinaire des protéines, TGFb1, et l'activation du système du complément peuvent expliquer le développement simultané de cicatrices interstitielles dans notre modèle actuel.37–40 D'autres expériences ont révélé une augmentation des cellules apoptotiques et l'activation des protéines Smad dans le tissu rénal à partir de TGFb non traité{ {3}} Souris TG par rapport aux souris WT. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que cette nouvelle souris TGFb1-TG est un modèle approprié pour la découverte de médicaments dansfibrose rénale.

Figure 7|Le récepteur couplé à la protéine G (GPR15) induit l'inhibition de l'apoptose de la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) dans les podocytes. Des cellules de podocytes primaires humains ont été transfectées avec le petit ARN interférent (ARNsi) du récepteur du facteur de croissance des fibroblastes 1 (FGFR1), l'ARNsi GPR15 ou l'ARNsi brouillé pendant 48 heures, puis le rhTM a été ajouté à la culture cellulaire 1 heure avant le traitement avec le facteur de croissance transformant b1 (TGFb1). Les cellules apoptotiques ont été (a) évaluées par une autre cytométrie et (b) ensuite quantifiées. ( c ) Des lysats cellulaires ont été préparés pour le Western blot. n{{10}} dans chaque groupe. Les données sont exprimées sous forme de médiane ± écart interquartile. Analyse statistique par test U de Mann-Whitney. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="" solution="">

Figure 8|Inhibition de la transition épithéliale-mésenchymateuse par la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM). ( a ) La podocine et l'actine musculaire lisse (a-SMA) ont été colorées comme décrit dans les méthodes. (b) La zone positive pour la coloration a-SMA a été quantifiée par le logiciel de traitement d'image WinROOF. n=3 dans les groupes de type sauvage (WT)/solution saline (SAL) et WT/rhTM et n=5 dansfacteur de croissance transformant-b1–transgénique(TGFb{{0}}TG)/SAL et TGFb1-TG/rhTM. ( c ) Les protéines totales ( t ) et phosphorylées ( p ) des membres de la famille SMAD (Smad) ont été évaluées par Western blot. n=8 dans chaque groupe. Les données sont exprimées sous forme de médiane ± écart interquartile. Analyse statistique par analyse de variance de Kruskal-Wallis et test de Dunn corrigé. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0.08." pour="" optimiser="" la="" visualisation="" de="" cette="" image,="" veuillez="" consulter="" la="" version="" en="" ligne="" de="" cet="" article="" sur="">

rhTM améliore la fibrose rénale

Nous avons montré que la rhTM améliore la fibrose pulmonaire développée chez les souris surexprimant le TGFb1 humain dans les poumons en supprimant l'apoptose des cellules épithéliales alvéolaires.41 Des essais cliniques ont également démontré une amélioration de la fibrose pulmonaire idiopathique après un traitement par la rhTM.42,43 Ces observations précédentes suggèrent le potentiel de la rhTM. pour le traitement de la fibrose organique. Nous avons émis l'hypothèse que la rhTM serait efficace dans la fibrose rénale associée au TGFb1-. Pour tester cette hypothèse, nous avons traité des souris TGFb1-TG spécifiques du rein avec du rhTM.44 L'administration de rhTM pendant 4 semaines a considérablement atténué les lésions, le dysfonctionnement et la fibrose des reins. Les souris traitées avec le rhTM ont montré de faibles niveaux urinaires de protéines totales, d'albumine, de TGFb1, de C5a et des niveaux rénaux réduits de cytokines profibrotiques, C5a et HMGB1.45 La thérapie avec le rhTM a également inhibé à la fois l'apoptose et l'EMT des podocytes. Cependant, la rhTM n'a exercé aucun effet sur le complexe thrombine-antithrombine, un marqueur d'activation de la coagulation, bien qu'elle ait augmenté la génération d'APC, un facteur anticoagulant ayant une activité anti-inflammatoire et anti-apoptotique.23 Il convient de noter que la thrombine, l'enzyme procoagulante, peut favorisent paradoxalement l'anticoagulation dans les états prothrombotiques de bas grade en formant le complexe TM/thrombine, qui augmente la génération de l'APC anticoagulant. Cependant, la thrombine agit principalement comme procoagulant dans des états prothrombotiques excessifs (par exemple, septicémie).46 Cet effet double et paradoxal de la thrombine peut expliquer l'inefficacité apparente de la rhTM pour inhiber l'activation de la coagulation dans notre modèle, qui est dans un état prothrombotique de bas grade. . Dans l'ensemble, ces observations suggèrent que la rhTM améliore la fibrose progressive et le dysfonctionnement dureinsen prolongeant la survie ou en prévenant l'EMT des cellules glomérulaires et en supprimant l'inflammation, l'activation du complément et l'activité du facteur de croissance directement ou indirectement via l'activation de la voie de la protéine C et la réduction de l'expression de HMGB1. L'amélioration de la néphropathie diabétique chez les souris avec une augmentation du domaine circulant de type lectine TM et la détérioration de la maladie chez les souris dépourvues du domaine de type lectine soutiennent l'effet bénéfique de la rhTM sur la fibrose rénale.20,21

Inhibition de l'apoptose des podocytes

Les podocytes jouent un rôle essentiel dans le maintien de la barrière de filtration glomérulaire et la formation du diaphragme à fente pour prévenir la perte de protéines circulantes essentielles.47Lésion rénalecausée par des espèces réactives de l'oxygène, une glycémie élevée ou des médiateurs inflammatoires, y compris le TGFb1, induit l'apoptose des podocytes entraînant une déplétion des podocytes qui peut éventuellement entraîner un dysfonctionnement rénal. , TGFb1 émet des signaux intracellulaires via la famille Smad de facteurs de transcription ou via des voies de signalisation indépendantes de Smad.48 L'activation de la voie dépendante de Smad se produit lorsque le récepteur TGFb1 activé phosphoryle Smad2 et Smad3, qui, avec Smad4, se transloquent vers le noyau.49 Le Smad2/ Le complexe Smad3/Smad4 stimule la transcription des facteurs pro-apoptotique et réduit celle des facteurs anti-apoptotique conduisant à l'apoptose cellulaire.49 Conformément à cela, nous avons trouvé le niveau rénal élevé du facteur pro-apoptotique Bax et un faible niveau des facteurs anti-apoptotique Bcl2 et Bcl-XL chez les souris TGFb1- TG. La TM peut inhiber l'apoptose de différents types de cellules.21,41,49 Conformément à cela, nous avons constaté ici que la rhTM inhibe l'apoptose des podocytes induite par le peroxyde d'hydrogène, le glucose élevé ou le TGFb1, et cette découverte peut expliquer l'effet bénéfique de la rhTM dans l'IRC. . De plus, rhTM a fait pencher la balance vers l'inhibition de l'apoptose en réduisant l'expression de Bax, en augmentant l'expression de Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 et BIRC6, et en augmentant l'activation de la voie Akt cheztissus rénaux. Dans l'ensemble, ces observations suggèrent que la rhTM stimule la survie des podocytes en favorisant l'activation de l'Akt et l'expression du facteur anti-apoptotique.

cistanche pour les maladies rénales chroniques

Inhibition de l'EMT

L'EMT des podocytes contribue également à la fibrose rénale. Les podocytes soumis à l'EMT libèrent des protéines de la matrice extracellulaire qui s'accumulent et se déposent au cours de la fibrogenèse rénale associée au TGFb1-.50 Le TGFb1 favorise l'EMT par l'activation médiée par les récepteurs du complexe Smad2/Smad3/Smad4. Smad3 phosphorylé favorise l'EMT en stimulant la transcription des protéines de la matrice et en réduisant l'expression des marqueurs épithéliaux.51 Conformément à cela, nous avons trouvé une augmentation de l'EMT des podocytes chez les souris TGFb1-TG et les podocytes cultivés en présence de TGFb1 ou sous conditions d'oxydation ou de glucose élevé. Des rapports antérieurs suggéraient que la rhTM supprime l'EMT.52,53 Ici, nous avons constaté que la rhTM inhibe l'EMT des podocytes et des cellules épithéliales tubulo-interstitielles chez les souris TGFb1-TG. L'inhibition de l'activation de la protéine Smad semble être le mécanisme de l'effet bénéfique du rhTM sur l'EMT, car les souris TGFb1-TG et les podocytes primaires traités avec le rhTM ont représenté une phosphorylation significativement réduite de Smad2 et Smad3 par rapport aux conditions non traitées. Ces résultats confirment l'activité inhibitrice de TM sur EMT.

Médiation des récepteurs dans l'activité protectrice de rhTM

Des études antérieures ont montré que GPR15 ou FGFR1 médiaient l'activité cytoprotectrice de TM.26,27,54 Nous avons testé si ces récepteurs médiaient l'activité protectrice de rhTM contre l'apoptose et l'EMT. Alors que la régulation à la baisse de la protéine GPR15 par l'ARNsi a complètement aboli l'activité suppressive du rhTM sur l'apoptose médiée par le TGFb1- des podocytes, ni l'ARNsi FGFR1 ni son inhibiteur ne l'ont aboli, ce qui suggère que le GPR15 assure la médiation de l'activité protectrice du rhTM. Il y avait une phosphorylation accrue d'Akt dans les podocytes en culture et les podocytes isolés de souris TGFb1-TG après traitement avec rhTM, suggérant l'implication de la voie Akt intracellulaire. Un travail montrant que le rhTM active la voie Akt dans les cellules endothéliales corrobore cette découverte.55 L'activation de la voie de signalisation Akt peut encore potentialiser l'effet du rhTM en augmentant l'expression de surface du GPR15.56 Ces observations indiquent que le rhTM protège les podocytes de l'apoptose dans notre TGFb{ {13}} Souris TG en activant l'axe GPR15/Akt conduisant à une expression accrue des facteurs anti-apoptotiques et à une diminution de l'expression des facteurs pro-apoptotiques.57 D'autre part, des études antérieures ont démontré que les anaphylatoxines C3a et C5a via leurs GPR peuvent contribuer à CKD en blessant les podocytes et que l'APC peut inhiber l'apoptose des podocytes et la fibrose rénale via son récepteur endothélial de la protéine C et son récepteur activé par la protéase Par conséquent, outre l'activation de la voie GPR15/Akt, l'inhibition des facteurs du complément et l'activation accrue de la protéine C et de ses récepteurs peuvent également expliquer les effets bénéfiques du rhTM dans notre TGFb1-associémodèle de fibrose rénale.

De plus, la régulation à la baisse de GPR15 mais pas celle de FGFR1 a bloqué l'effet inhibiteur de rhTM sur l'EMT, suggérant que GPR15 médie également cette activité protectrice de rhTM. L'inhibition des protéines Smad est impliquée dans la suppression de l'EMT car le traitement avec rhTM a inhibé la phosphorylation de Smad2 et Smad3 chez les souris TGFb1-TG et les podocytes en culture. Cependant, le mécanisme précis de l'inhibition de la protéine Smad via GPR15 n'est pas clair. Certaines preuves montrent que la voie Akt peut interagir avec et réguler la voie de signalisation Smad,62–64 et qu'Akt peut empêcher la phosphorylation de Smad3 en interagissant directement avec Smad3 non phosphorylé pour le séquestrer à l'extérieur du noyau, entraînant une inhibition de la transcription et de l'EMT.62– 64 Sur la base de ces rapports, il est concevable que Akt activé après la liaison de rhTM à GPR15 séquestre Smad3 non phosphorylé conduisant à l'inhibition de l'EMT des podocytes. Il convient de noter que cet effet bénéfique médié par Akt n'est observé que dans les cellules non malignes.65–67 Dans les cellules malignes, l'interaction du TGFb1 avec ses récepteurs peut activer directement la voie phosphoinositide 3-kinase/Akt/Snail et provoquer EMT.65–67 Dans l'ensemble, les résultats de notre étude confirment le rôle de GPR15 en tant que récepteur médiant les effets bénéfiques de la rhTM sur les podocytes.

Conclusion

En résumé, nous rapportons ici pour la première fois une nouvelle souris TG transgénique surexprimant la pleine longueur du gène TGFb1 humain spécifiquement dans les glomérules qui développent une sclérose glomérulaire spontanée et progressive, une fibrose tubulo-interstitielle etinsuffisance rénale, et amélioration de la fibrose rénale établie/insuffisance rénale par l'interaction rhTM avec GPR15 qui inhibe l'apoptose et la transition mésenchymateuse des podocytes.

MÉTHODES

Génération de la souris TGFb1 BAC TG

La souris TGFb1-BAC-TG exprimant le gène TGFb1 humain complet sous le contrôle du promoteur de la podocine de souris a été générée par injection pronucléaire dans 392 embryons de souris C57BL/6J (CLEA Japan, Inc., Tokyo, Japon). Nous avons évalué les fondateurs de TG et la transmission germinale de la construction BAC TG par Southern blot (matériels et méthodes supplémentaires).

Animaux d'expérimentation

Les souris TGFb1-TG ont été élevées pendant plus de 10 générations sous un fond C57BL/6 avant d'être utilisées dans les expériences. Des compagnons de portée WT ont été utilisés comme animaux témoins. Tous les animaux ont été maintenus dans un environnement exempt d'agents pathogènes spécifiques et soumis à un cycle lumière-obscurité de 12- heures à une température et une humidité ambiantes comprises entre 22 degrés et 26 degrés et 40 % et 70 %, et avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau dans l'animalerie de l'Université de Mie (Matériel et méthodes supplémentaires).

Déclaration éthique

Le Recombinant DNA Experiment Safety Committee (approbation n° I-629 ; date : 19 septembre 2013) et le Committee on Animal Investigation of Mie University (approbation n° 27-4 ; date : 19 août 2015) approuvé les protocoles de l'étude. Toutes les procédures animales ont été effectuées conformément aux directives institutionnelles de l'Université de Mie et en suivant les principes internationalement approuvés de soins aux animaux de laboratoire publiés par l'Institut national de la santé (https://olaw.nih.gov/).

Pour l'investigation clinique, un consentement éclairé écrit a été donné par tous les patients et sujets sains, et le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique pour l'investigation clinique de l'Université de Mie (approbation n° 1043 et 2194).

Conception expérimentale

Pour la caractérisation de laun reinmodèle de fibrose, nous avons réparti des souris mâles TGFb{{0}}TG (n=24) et des souris mâles WT (n=12) âgées de 4 semaines et pesant de 20 à 23 g en 3 groupes avec 8 souris TGF b1-TG et 4 souris WT dans chaque groupe. Les souris de chaque groupe WT et TGFb1-TG ont été euthanasiées aux semaines 0, 8 ou 16 pour prélever des échantillons d'urine, de sang et de rein afin d'évaluer les modifications des paramètres de la fibrose et de la fonction rénale au fil du temps.

Pour évaluer l'efficacité thérapeutique du rhTM (le rhTM a été gracieusement fourni par Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokyo, Japon) dans la fibrose rénale, des souris TGFb1-TG (n= 8) ou des compagnons de portée WT (n {{2 }}) ont été traités avec du rhTM (3 mg/kg) par injection ip, 3 fois par semaine pendant les 4 semaines précédant l'abattage des souris. Des souris TGFb1-TG (n =8) ou des souris WT (n= 8) ​​recevant une quantité égale de SAL physiologique par injection ip ont été utilisées comme souris témoins négatives.

Le protocole de la présente étude a suivi les directives ARRIVE (Reporting of In Vivo Experiments) pour l'investigation animale. Les souris ont été randomisées et les chercheurs qui ont mesuré les paramètres ont été aveuglés aux groupes de traitement.

Analyse biochimique

Les concentrations de protéines totales (kit de dosage de protéines BCA ; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), protéine chimiotactique des monocytes -1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), complexe thrombine antithrombine (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canada) ont été mesurés à l'aide de kits d'immunodosage enzymatique commerciaux en suivant les instructions du fabricant (Matériel et méthodes supplémentaires).

Culture de cellules

Les cellules primaires de podocytes humains ont été achetées auprès de CELPR OGEN (Torrance, CA). Des cellules primaires de podocytes humains ont été cultivées dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 à 37 °C. Le milieu a été complété avec 10 % de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 UI/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine et de la L-glutamine (Matériel et méthodes supplémentaires).

analyses statistiques

Les données sont exprimées en médiane ± intervalle interquartile. La différence statistique entre les variables a été calculée par analyse de variance de Kruskal-Wallis avec analyse post hoc en utilisant le test de Dunn. Le test U de Mann-Whitney a été utilisé pour évaluer les différences entre les 2 groupes. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism version 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). La signification statistique a été considérée comme P <>

DIVULGATION

ECG, CND-G et YY ont un brevet sur la souris TGFb1-TG avecfibrose rénaleutilisé dans la présente étude. CND-G et YY ont reçu une subvention du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie du Japon pour la présente étude. ECG, TY, CND-G et MT ont reçu une subvention de Shionogi Pharmaceuticals. Tous les autres auteurs n'ont déclaré aucun intérêt concurrent.

REMERCIEMENTS

Cette recherche a été financée en partie par des subventions du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie du Japon (Kakenhi n° 17K09824 pour YY ; Kakenhi n° 17K08442 pour CND-G), et en partie par une subvention de Shionogi & Co, Ltd., Japon. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Une partie de ce travail a été publiée sous forme de résumé.

LES CONTRIBUTIONS DE L'AUTEUR

AT a préparé le modèle de la maladie et rédigé la première ébauche du manuscrit. TY, KN, TT, RI et CND-G ont préparé les modèles de maladie et les paramètres mesurés. AM et SW ont réalisé l'étude microscopique en transmission. MT, YO et AU ont mesuré les paramètres et réalisé les expériences in vitro. YT, LQ, TK et VFD ont fourni des contributions intellectuelles. YY et ECG ont corrigé le brouillon du manuscrit et conçu l'étude.

cistanche pour les symptômes d'insuffisance rénale

MATÉRIEL COMPLÉMENTAIRE

Fichier supplémentaire (PDF) Matériels et méthodes supplémentaires.

Tableau S1. Caractéristiques des sujets.

Tableau S2. Amorces pour RT-PCR de tissus de souris.

Tableau S3. Amorces pour RT-PCR de podocytes humains.

Figure S1. Les fragments de thrombomoduline solubles sont en corrélation avec le TGFb1 et la créatinine chez les patients atteints de diabète.

Figure S2. Construction TGFb1 humain–chromosome artificiel bactérien (BAC). Figure S3. Souris fondatrices exprimant la pleine longueur du gène TGFb1 humain.

Figure S4. Caractérisation de la souris transgénique glomerulus-specific transforming growth factor b1.

Figure S5. La souris transgénique humaine TGFb1 a augmenté les marqueurs de lésions rénales.

Figure S6. La thérapie avec la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) réduit l'effacement des processus du pied des podocytes et l'épaississement de la membrane basale glomérulaire.

Figure S7. Les souris transgéniques TGFb1 traitées avec de la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) ont une faible concentration de facteurs profibrotiques et de HMGB1 dans le tissu rénal. Figure S8. La thérapie avec la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) augmente la génération de protéine C activée, inhibe le système du complément, diminue la podocine soluble circulante, bien qu'elle n'exerce aucun effet sur le système de coagulation chez les souris transgéniques TGFb1.

Figure S9. Le traitement par thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) réduit la concentration urinaire de podocine.

Figure S10. La thérapie avec la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) réduit l'apoptose des cellules glomérulaires.

Figure S11. Le traitement de la fibrose rénale associée à la surexpression de TGFb1- avec de la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) inhibe l'apoptose dans le tissu rénal.

Figure S12. La thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) augmente l'expression des facteurs anti-apoptotiques dans les podocytes.

Figure S13. La thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) supprime l'apoptose des podocytes induite par le peroxyde d'hydrogène.

Figure S14. La thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) supprime l'apoptose des podocytes induite par des taux de glucose élevés.

Figure S15. La thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) augmente l'activation des voies Akt dans les podocytes.

Figure S16. La thérapie avec la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) augmente la phosphorylation d'Akt dans les podocytes de souris TGFb1-TG.

Figure S17. Les podocytes de chaque groupe de traitement de souris expriment l'ARNm de GPR15.

Figure S18. Coloration de GPR15 dans les podocytes d'un individu sain et d'un patient atteint de glomérulosclérose segmentaire focale.

Figure S19. Le récepteur du facteur de croissance des fibroblastes -1 n'est pas impliqué dans l'activité inhibitrice de la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) dans les podocytes.

Figure S20. La thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) inhibe la transition épithéliale-mésenchymateuse des podocytes.

Figure S21. La thérapie avec la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) inhibe l'expression de l'actine du muscle lisse a dans les tubules rénaux.

Figure S22. Le récepteur couplé à la protéine G (GPR15) médie l'activité inhibitrice de la thrombomoduline humaine recombinante (rhTM) sur la transition épithéliale-mésenchymateuse des podocytes.

Références supplémentaires.

RÉFÉRENCES

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Maladie rénale chronique. Lancette. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, et al. Évaluation de l'état mondial des soins de santé rénale. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, et al. Santé rénale mondiale 2017 et au-delà : une feuille de route pour combler les lacunes dans les soins, la recherche et les politiques. Lancette. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Prévalence, détection, évaluation et prise en charge de l'insuffisance rénale chronique. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Traitement de la maladie rénale chronique. Rein Int. 2012;81 :351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. La prochaine génération de thérapies pour les maladies rénales chroniques. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Fifibrose rénale : nouvelles connaissances sur la pathogenèse et la thérapeutique. Rein Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. Mécanismes cellulaires et moléculaires de la fibrose rénale. Nat Rev Néphrol. 2011;7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. La réduction de la signalisation endothéliale TGF-bêta est suffisante pour réduire la transition endothéliale-mésenchymateuse et la fibrose dans l'IRC. J Am Soc Néphrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et al. Signalisation TGF-beta1/p53 dans la fibrogenèse rénale. Signal cellulaire. 2018 ;43 : 1–10.

11. Conway EM. Thrombomoduline et son rôle dans l'inflammation. Semin Immunopathol. 2012;34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Thrombomoduline et endothélium vasculaire : aperçu des aspects fonctionnels, réglementaires et thérapeutiques. Suis J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. La thrombomoduline relie la coagulation à l'inflammation et à l'immunité. Cibles actuelles des médicaments. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. La thrombomoduline inhibe l'activation des éosinophiles et des mastocytes. Immunol cellulaire. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. L'inhibition de l'asthme bronchique allergique par la thrombomoduline est médiée par les cellules dendritiques. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Fonctions de modulation doubles de la thrombomoduline dans la voie alternative du complément. Tendances bioscientifiques. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. La thrombomoduline module les cellules dendritiques via à la fois des antagonismes de la protéine B1 du groupe à haute mobilité et un mécanisme indépendant. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Le domaine de type lectine de la thrombomoduline interfère avec l'activation du complément et protège contre l'arthrite. J Thromb Haemost. 2006;4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, et al. La thrombomoduline soluble protège les reins ischémiques. J Am Soc Néphrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, et al. Le domaine de type lectine de la thrombomoduline améliore la glomérulopathie diabétique via l'inhibition du complément. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL, et al. Le domaine 1 de la thrombomoduline améliore la néphropathie diabétique chez la souris via l'inflammation médiée par l'inflammasome anti-NF-kappaB/NLRP3, l'amélioration de l'activité antioxydante de NRF2 et l'inhibition de l'apoptose. Diabétologie. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Activité thrombomoduline soluble et antigène thrombomoduline soluble dans le plasma. J Thromb Haemost. 2005;3 : 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. La protéine C activée exogène inhibe la progression de la néphropathie diabétique. J Thromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Amélioration du diabète par la protéine S. Diabète. 2016 ;65 :1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptose et lésion rénale aiguë. Rein Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK, et al. FGFR1 intervient dans l'angiogenèse recombinante induite par le domaine de la thrombomoduline. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, et al. La cinquième région de la thrombomoduline, semblable au facteur de croissance épidermique, atténue la septicémie induite par le LPS en interagissant avec le GPR15. Thromb Haemost. 2017;117:570– 579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W, et al. Identification à l'échelle du génome des gènes essentiels aux cytosquelettes de podocytes basée sur le séquençage d'ARN unicellulaire. Rein Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, et al. La signalisation BMP canonique dans les cellules tubulaires assure la récupération après une lésion rénale aiguë. Rein Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Hypoxie chronique et lésion tubulo-interstitielle : une dernière voie commune vers l'insuffisance rénale terminale. J Am Soc Néphrol. 2006;17 : 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. L'insuffisance rénale chronique et ses complications. Premier soin. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, et al. Expression rénale des protéines de la matrice fibreuse et des isoformes du facteur de croissance transformant bêta (TGF-bêta) chez des souris transgéniques TGF-bêta. J Am Soc Néphrol. 1999;10:271– 280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. La protéine motrice Myo1c régule la signalisation par le facteur de croissance transformant et la fibrose dans les podocytes. Rein Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, et al. Le récepteur de l'endothéline A médie la dégradation de la couche de surface endothéliale glomérulaire via une diaphonie pathologique entre les podocytes activés et les cellules endothéliales glomérulaires. Rein Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Lésion des cellules endothéliales glomérulaires et diaphonie dans l'insuffisance rénale diabétique. Am J Physiol Physiol rénal. 2015;308:F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA, et al. La microscopie électronique à balayage modifiée révèle une diaphonie pathologique entre les cellules endothéliales et les podocytes dans un modèle murin de glomérulonéphrite membranoproliférative. Sci Rep. 2018;8:10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Les cellules tubulaires proximales favorisent la fifibrogenèse par induction médiée par le TGF-bêta1- de myofifibroblastes péritubulaires. Rein Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Lésion des tubules rénaux: une force motrice vers la maladie rénale chronique. Rein Int. 2018;93:568–579.

39. Loefflfler I, Wolf G. Transformer le facteur de croissance bêta et la progression de la maladie rénale. Greffe de cadran néphrol. 2014;29(supplément 1):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S, et al. Urinary transforming growth factor-beta chez les patients atteints de maladies glomérulaires. Pédiatre Néphrol. 1997;11:334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Inhibition de l'apoptose cellulaire et amélioration de la fibrose pulmonaire par la thrombomoduline. Suis J Pathol. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Thrombomoduline humaine recombinante dans l'exacerbation aiguë de la fibrose pulmonaire idiopathique. Poitrine. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Thrombomoduline pour les exacerbations aiguës de la fibrose pulmonaire idiopathique : une étude de preuve de concept. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Sélection optimale des patients pour un traitement anticoagulant dans le sepsis : une proposition fondée sur des données probantes du Japon. J Thromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X, et al. Le rôle du groupe de haute mobilité box 1 (HMGB1) dans la pathogenèse des maladies rénales. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Effets différentiels dose-dépendants de la thrombine dans l'asthme bronchique allergique. J Thromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, et al. De nouvelles connaissances sur la biologie des podocytes dans la santé et la maladie glomérulaire. J Am Soc Néphrol. 2017;28 : 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Voies Smad-dépendantes et indépendantes de Smad dans la signalisation de la famille TGF-bêta. La nature. 2003;425 :577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Mécanismes de l'apoptose médiée par le TGF-bêta. Tissu cellulaire Res. 2002 ;307 : 1–14.

50. Greka A, Mundel P. Biologie cellulaire et pathologie des podocytes. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. Ciblage de la signalisation TGF-bêta dans la fibrose rénale. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, et al. La thrombomoduline influence la survie des patients atteints d'un cancer colorectal non métastatique par la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, et al. La thrombomoduline réduit le potentiel tumorigène et métastatique des cellules cancéreuses du poumon par régulation positive de la E-cadhérine et régulation négative de l'expression de la N-cadhérine. Biochem Biophys Res Commun. 2016 ;476 : 252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, et al. Le récepteur 15 couplé à la protéine G assure la médiation de l'angiogenèse et de la fonction cytoprotectrice de la thrombomoduline. Sci Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, et al. La thrombomoduline recombinante exerce une action anti-autophagique dans les cellules endothéliales et fournit un effet anti-athérosclérose chez les souris déficientes en apolipoprotéine E. Sci Rep. 2017;7 : 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, et al. Expression de surface de protéine médiée par la signalisation PI3K/Akt détectée par le motif d'interaction 14-3-3. FEB J. 2009;276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Double rôle du TGF-beta1 dans l'apoptose. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.

58. Griffinin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Protéine C activée, récepteur 1 activé par la protéase et neuroprotection. Sang. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, et al. La protéine C activée protège contre la néphropathie diabétique en inhibant l'apoptose endothéliale et podocytaire. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Le rôle des anaphylatoxines dans la santé et la maladie. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D, et al. Le blocage des récepteurs C3a protège les podocytes des lésions de la néphropathie diabétique. Aperçu JCI. 2020;5 : e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, et al. Akt interagit directement avec Smad3 pour réguler la sensibilité à l'apoptose induite par le TGF-bêta. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Coopération des voies de signalisation dans la transition épithéliale-mésenchymateuse induite par le TGF-bêta. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt module la signalisation TGF-bêta par une interaction directe avec Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6 : 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. Le TGF-bêta favorise la signalisation PI3K-AKT et la migration des cellules cancéreuses de la prostate par l'intermédiaire de l'ubiquitylation de p85alpha médiée par TRAF6-. Sci-Signal. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z, et al. Effets de dichotomie de la signalisation Akt dans le cancer du sein. Mol Cancer. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, et al. La signalisation FAM83A induit la transition mésenchymateuse épithéliale par la voie PI3K/AKT/Snail dans le NSCLC. Vieillissement (Albany NY). 2019;11:6069–6088.