Effet de la médecine chinoise des herbes Cistanche sur le développement embryonnaire-fœtal précoce

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Li Yufang 1, Xu Qinwei 2, Zhang Li 2, Zhang Wenchang 2, Feng Shutang 3*

[Résumé]Utilisez le cochonEmbryonsde la fécondation in vitro pour la recherche et la comparaison. L’effet de l’ajoutChinoismédicamentingrédientsCistancheet l’astragale au développement deembryons précocesdans le moyen NCSU-23 a été prouvé. L’expérience a prouvé que: (1) Le rapport de volume de 0,10%Cistancheet 0,10 % d’astragale a été ajouté au bouillon de culture, et leCistancheGroupe d’addition Le taux de blastocystes (15,76 %) était significativement plus élevé que celui du groupe blanc (9,26 %) (P<0.05). the="" blastocyst="" rate="" of="" the="" astragalus-added="" group="" (10.09%)="" and="" the="" blank="" group="" (9.26%)="" were="" not="" significantly="" different="" (p="">0,05), indiquant queCistanchedeserticolapeut promouvoir de manière significativeembryonnaire précocedéveloppement. (2) Lorsque la concentration (V/V) deCistancheest de 0,05% et 0,10%, le taux de blastocystes (17,02% et 16,75%) est significativement plus élevé que le groupe vide (0) (P<0.01) and="" 0.15%="" group="" (8.94%)=""><0.05). (3)="" adding="" 0.10%="" traditional="">ChinoismédicamentCistanchedans le milieu de culture au stade à 2 cellules, le taux de développement des blastocystes (13,81 %) était significativement plus élevé qu’au stade à 4 cellules (7,53 %) (P<0.05), and="" compared="" with="" the="" addition="" of="">Cistancheavant clivage (13,67%) ) Est légèrement plus élevé, mais la différence n’est pas évidente (P>0,05).

En raison des différences dans l’environnement de développement in vivo et in vitro, leEmbryonsseront endommagés par les radicaux libres lors de la culture in vitro du porc précoceEmbryons, causant des troubles du métabolisme cellulaire ou des dommages à l’ADN, à l’ARN et aux protéines [1]. Afin d’améliorer encore le taux de développement de la fécondation in vitro par du sperme congelé, cette expérience a exploré l’ajout d’une certaine concentration deCistancheet l’astragale pour améliorer leembryonenvironnement de développement in vitro.

1. Matériel et méthodes

1. 1 Conditions de culture :

La maturation in vitro des ovocytes porcins, la fécondation in vitro et la culture in vitro d’embryons précoces ont toutes été réalisées dans un incubateur contenant 5 % de CO2 et une humidité saturée maximale de 39 °C.

1.2 Réactifs et milieu de culture :

Le liquide basal de maturation des ovocytes est NCSU-23, le liquide de lavage des ovocytes est un liquide PVA-TL-HEPES, le liquide de fécondation est un tampon Tris (mTBM) contenant 0,1% de BSA et le liquide de lavage des spermatozoïdes est celui de Dubecco avec 0,1% de BSA. Solution saline tamponnée au phosphate (DPBS), le liquide de décongélation des spermatozoïdes est BTS, le liquide cumulus est de 1 mg / mL de hyaluronidase PBS, le liquide d’opération ovocyte est tamponné HEPES NCSU-23, et le liquide de culture de base des embryons précoces est complété par 0,4 % BSA NCSU-23, ajouter (V / V) 0,05% ~ 0,15% Cistanche au besoin, utilisez BTS pour décongeler le sperme. Avant utilisation, préchauffer et équilibrer pendant plus de 4 h dans un incubateur contenant 5 % de CO2 de l’air et une humidité saturée maximale de 39 °C [2].

1.3 La méthode d’ébullition de la médecine chinoise Cistanche:

Solution de Cistanche: Prendre 5 g et le mettre dans un bécher de 100 ml, ajouter de l’eau ultrapure et l’immerger dans de l’eau ultrapure, faire bouillir à feu vif et le garder bouillant pendant 20 minutes, puis recueillir la soupe; répétez le processus ci-dessus, collectez 3 fois de suite, volume constant à 100 mL, 0,22 μm de filtre de rechange. Solution d’astragale: Prendre 5 g et le mettre dans un bécher de 100 ml, ajouter de l’eau ultrapure et l’immerger, faire bouillir à feu vif et le garder bouillant pendant 20 minutes, puis recueillir la soupe médicinale; répétez le processus ci-dessus, collectez 3 fois de suite, réglez le volume à 100 mL, filtrez 0,22 μm de rechange.

Médecine chinoiseFines herbes:Cistanche

1.4 Maturation in vitro des ovocytes porcins :

Les ovaires des truies ont été prélevés à l’abattoir alimentaire de Beijing Pengcheng, placés dans une solution saline normale contenant des antibiotiques à 0,9% à environ 38 ° C, transportés au laboratoire dans les 4 heures et lavés avec une solution saline normale trois fois. Utilisez une seringue de 10 mL avec une aiguille de calibre 12 pour extraire les ovocytes avec des follicules de 2 à 6 mm de diamètre à la surface de l’ovaire. Laver 3 ~ 4 fois dans une solution TL-HEPES et 3 ~ 4 fois dans NCSU-23 qui a été équilibré dans un incubateur à dioxyde de carbone pendant plus de 4 heures. Transférer 20 ~ 30 ovocytes en groupe à 100 μL, ajouter 10% PFF, 10 UI / mL HCG, 10 UI / mL PMSG, 10 ng / mL EGF NCSU-23 gouttelettes et la culture pendant environ 22 heures , Changer le milieu en gouttelettes NCSU-23 avec 10% PFF, 10 ng / mL EGF et continuer à cultiver pendant 44 ~ 46 h [3].

1.5 Capacité des spermatozoïdes et fécondation in vitro :

Préparer la solution de mTBM sans caféine ni BSA et l’équilibrer pendant 48 heures dans un incubateur avec 5% de CO2 et une humidité saturée maximale de 39 ° C, en ajustant la valeur du pH dans la plage de 7,2 ~ 7,8; ajouter de la caféine et du BSA 44 heures avant utilisation et continuer à équilibrer. La qualité du sperme a été testée et 10 mL ont été centrifugés à 900 r/min pendant 3 min, 10 mL de solution de DPBS contenant 0,1 % de BSA ont été ajoutés pour la suspension, et centrifugés à 900 r/min pendant 3 min [3]; après suspension de 1 mL de solution de tunnelier, elle a été inclinée de 60 ° Le traitement de récupération d’énergie en amont est effectué dans un incubateur avec 5% de CO2 de l’air et une humidité saturée maximale de 39 ° C pendant 1 h [3 ~ 5]. Le complexe cellulaire ovocyte-cumulus qui mûrit à 44 ~ 46 est placé dans la solution de lavage des ovocytes contenant 0,1% de hyaluronidase, et les cellules du cumulus sont éliminées par pipetage, puis les ovocytes sont exposés. Lavez 3 fois dans le tunnelier équilibré, et enfin mettez chacun 10-15 morceaux dans un groupe de 50 μL TBM, et attendez le sperme [6, 7]. Injecter 50 μL de sperme en amont provenant de la capacité dans une gouttelette d’ovocytes contenant du TBM et effectuer la fécondation pendant 6 h dans un incubateur avec 5% de CO2 et une humidité saturée maximale de 39 °C.

1.6 Développement précoce et détection des œufs fécondés :

Après 6 heures de fécondation, les ovocytes ont été traités avec NCSU-23 tamponné avec le liquide opératoire HEPES ou NCSU-23 avec 0,4% de BSA dans le liquide de culture embryonnaire. 23 Rincer 3 fois, changer le milieu en une gouttelette équilibrée de 0,4% de BSA NCSU-23 et incuber pendant plus de 8 jours. Vérifiez le taux fractionné d’œufs fécondés hypothétiques le 2ème jour, vérifiez le taux de morula (+ taux de blastocyste) le 6ème jour et vérifiez le taux de blastocyste le 8ème jour [8]. Tous ont été examinés et enregistrés sous le miroir corporel.

1.7 Conception expérimentale :

1.7.1 L’effet des ingrédients de la médecine traditionnelle chinoise Cistanche sur le développement embryonnaire précoce.

Porc Wuzhishan[8] Après la capacitation, la fécondation in vitro, la fécondation est terminée et après le clivage, les embryons sont échangés jusqu’à ce qu’ils soient ajoutés à 0,1% (V / V). Cistanche, 0,1% d’astragale, et NCSU-23 (0,4% BSA) sans ingrédients importants (groupe vierge) ont été cultivés pour observer le développement d’ovules fécondés et d’embryons précoces, et juger des effets des deux composants de la médecine traditionnelle chinoise sur l’influence précoce du développement embryonnaire in vitro.

1.7.2 L’effet de la concentration de Cistanche sur le développement précoce des embryons.

Le sperme de porc Wuzhishan est capacité et subit une fécondation in vitro. Une fois la fécondation terminée, le liquide est changé à 0% (groupe vierge), 0,05%, 0,1% et 0,1%, respectivement. Dans 15% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA), observer le développement d’ovules fécondés et juger de l’influence de différentes concentrations de Cistanche composant de la médecine chinoise sur le développement embryonnaire in vitro précoce.

1.7.3 L’effet de la période d’addition de Cistanche sur le développement embryonnaire précoce.

Le sperme de porc Wuzhishan est capacitation et subit une fécondation in vitro. Après la fin de la fécondation, l’œuf fécondé se divise au stade à 2 cellules et l’œuf fécondé se divise au stade à 4 cellules, le liquide est échangé et ajouté séparément. 0,1% Cistanche NCSU-23 (0,4% BSA), observer le développement des ovules fécondés et juger de l’effet de l’ajout de cistanche sur le développement embryonnaire in vitro précoce à différents stades.

1.8 Analyse statistique :

Utilisez le test SPSS13.0 chi carré (χ2) et l’analyse unidirectionnelle de la variance.

Effets de l’extrait de cistanche

2. Résultat de l’analyse

2. 1 L’influence des ingrédients de la médecine traditionnelle chinoise sur le développement embryonnaire précoce

Comme le montre le tableau 1, dans le groupe Cistanche et Astragale, le taux de morula n’était pas significativement différent de celui du groupe vierge (P>0,05). Le taux de blastocystes des deux groupes était plus élevé que celui du groupe blanc, et le taux de blastocyste du groupe Cistanche était différent de celui du groupe blanc. Significatif (P<0.05). it="" is="" believed="" that="" cistanche="" has="" a="" better="" effect="" on="" promoting="" early="" embryonic="">

2.2 L’influence de la concentration de l’ingrédient de médecine chinoise Cistanche sur le développement embryonnaire précoce

Comme le montre le tableau 2, l’ajout de Cistanche à une concentration volumique de 0,05 % à 0,10 % dans le liquide de culture embryonnaire a un meilleur effet favorable sur les embryons de fécondation in vitro liquides de spermatozoïdes congelés WZSP, et le taux de développement des blastocystes est significativement différent de celui du groupe vierge (P<0.05); the="" blastocyst="" development="" rate="" of="" 0.15%="" cistanche="" deserticola="" was="" 0,="" which="" was="" significantly="" different="" from="" other="" groups=""><0.01). it="" means="" that="" if="" the="" concentration="" of="" cistanche="" is="" too="" high,="" it="" may="" cause="">

2.3 L’effet de l’ajout d’une période d’ingrédient de médecine chinoise Cistanche sur le développement embryonnaire précoce

Comme le montre le tableau 3, après test et analyse, l’ajout de Cistanche à une concentration volumique de 0,10% au stade à 2 cellules a un effet plus favorable sur l’embryon de fécondation in vitro liquide de spermatozoïdes congelés WZSP, et il n’y a pas de différence significative par rapport à l’addition avant le clivage (P>0,05). Cependant, il y avait une différence significative par rapport à l’ajout de 4 cellules (P<0.05); it="" indicated="" that="" the="" addition="" of="" cistanche="" at="" a="" volume="" concentration="" of="" 0.10%="" in="" the="" 2="" cell="" stage="" was="" most="" suitable="" for="" early="" embryo="">

3. Discussion

Par rapport au développement normalEmbryonsin vivo, l’environnement de développement de la FIV fécondéeEmbryonsest significativement différent. Au cours du processus deembryonla croissance et la division, une grande quantité de No., des radicaux libres et certaines substances toxiques sont produites, ce qui est défavorable à la croissance embryonnaire. Normalement, le développement d’embryons dans le corps peut éliminer ces facteurs défavorables grâce au métabolisme de l’environnement interne; ces facteurs défavorables s’accumuleront toujours dans l’environnement de croissance embryonnaire de la fécondation in vitro. Le traditionnelChinoismédicamentingrédientCistanchepeut avoir pour fonction de réduire l’absence de concentration et d’éliminer certains radicaux libres, afin d’améliorer encore le taux de développement de la fécondation in vitro par sperme congelé. L’expérience a exploré l’ajout d’une certaine concentration deCistancheet Astragale. Les résultats ont confirmé que l’astragale n’avait aucun effet efficace sur l’amélioration de l’environnement de culture in vitro. Une concentration correcte deCistanchea un certain effet de promotion surembryon précocedéveloppement, mais lorsque la concentration deCistanchedépasse une certaine concentration, il a également un effet inhibiteur surembryondéveloppement.

Nous avons exploré plus en détail les différents effets deCistanche, unChinoismédicament, à divers stades, et l’expérience a révélé que leembryons précocesont un taux de développement plus élevé à un stade ultérieur lorsquecistancheest ajouté à l’étape à 2 cellules. La raison possible est due à l’environnement externe du récepteur. L’oxyde nitrique (NO) est une molécule de signal et un facteur cytotoxique avec un large éventail d’activités biologiques. L’effet du NO surembryon précocel’évolution devrait remonter à l'embryonnaire précocestade de développement, qui peut être causé par l’une des causes du bloc 2 cellules (bloc 2 cellules) dans la culture embryonnaire de mammifères, et le bloc in vitro des porcs se produit au stade 4 cellules [9]. L’ajout deChinoismédicamentles ingrédients peuvent éliminer les radicaux libres du NO dans une certaine mesure et atténuer les facteurs défavorables deembryoncroissance [10].

Cistanche

Références

[1] Comport M. Trois modèles de cellules induites par les radicaux libres[J]. Chem Biol Interact, 1989, 72( 1/2) :1- 56.

[2] Pan Dengke. Étude sur les facteurs affectant le développement des cellules somatiques porcines clonéesEmbryons[D]. Beijing: Université agricole de Chine, 2005.

[3] Zhang Yunhai. Recherche sur la production de porcs clonésEmbryonsen utilisant la technologie de transfert nucléaire des cellules somatiques [D]. Beijing: Université agricole de Chine, 2005.

[4] Lu Shengsheng, Zhang Yanling, Shi Deshun, et al. Effets de l’ajout d’un sérum bovin et d’un liquide folliculaire porcin pendant la maturation sur la maturation nucléaire des ovocytes porcins etembryonnaire précocedéveloppement après fécondation in vitro [J]. Heilongjiang Animal Husbandry and Veterinary Medicine, 2002, (8):1-3.