TUNEL Assay : Un outil puissant pour l'évaluation des lésions rénales

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Résumé:Le test TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transférase dUTP nick-end labeling) est un test établi de longue date utilisé pour détecter la fragmentation de l'ADN associée à la mort cellulaire (3'-OH DNA termini) par les endonucléases. Parce que ces enzymes sont particulièrement actives dans le rein, TUNEL est largement utilisé pour identifier et quantifier la fragmentation de l'ADN et la mort cellulaire dans les culturesun rein cellules et reins animaux et humains issus de lablessure toxique ou hypoxique. La caractérisation précoce de TUNEL comme test apoptotique a conduit à de nombreuses interprétations erronées des mécanismes decellule rénale blessure.Néanmoins, TUNEL devient de plus en plus populaire pourlésion rénalecar il peut être utilisé universellement dans les cellules cultivées et tissulaires et pour tous les mécanismes de mort cellulaire. En outre, il est sensible, précis, quantitatif, facilement lié à des cellules ou à des compartiments tissulaires particuliers, et peut être combiné à l'immunohistochimie pour permettre une identification fiable des types de cellules ou des mécanismes probables de mort cellulaire. Traditionnellement, l'analyse TUNEL a été limitée à la présence ou à l'absence d'un signal TUNEL. Cependant, des informations supplémentaires sur le mécanisme de la mort cellulaire peuvent être obtenues à partir de l'analyse des modèles TUNEL.

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Introduction L'ADN est la seule molécule de la cellule qui peut être réparée, mais elle ne peut pas être complètement resynthétisée après un dommage. La destruction de l'ADN est l'une des étapes finales d'un processus de mort cellulaire en plusieurs étapes, qui est potentiellement réversible jusqu'au point de fragmentation terminale de l'ADN. Par conséquent, ce dernier est un attribut commun et un marqueur mécaniste de la mort cellulaire irréversible [1,2]. La fragmentation de l'ADN associée à la mort cellulaire est généralement "visualisée" par le test TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick-end labeling), l'échelle d'ADN ou le test des comètes [3]. L'électrophorèse en champ pulsé [4] et le test ROPS (Random Oligonucleotide-Primed Synthesis) [5] sont deux autres tests secondaires rarement utilisés. L'utilisation du test des comètes est limitée à in vitro (cellules cultivées) uniquement, et sa quantification demande beaucoup de travail [6]. La réalisation d'essais de comètes dans des noyaux cellulaires isolés est possible, mais elle est associée à des facteurs de confusion supplémentaires lors de l'isolement des noyaux. Le second, le test d'échelle d'ADN, n'est pas une méthode quantitative, et l'espoir initial que le modèle d'échelle par rapport au frottis ferait la distinction entre l'apoptose et la nécrose, respectivement, a été dissipé car cette approche s'est avérée peu fiable [7]. Des trois méthodes principales, TUNEL est la plus sensible, la moins chronophage et la plus universellement applicable. Il peut être utilisé dans les cellules et tissus cultivés et pour tous les mécanismes de mort cellulaire. Il est précis, quantitatif, facilement lié à des cellules ou à des compartiments tissulaires particuliers et peut être combiné à l'immunohistochimie pour permettre une identification fiable des types cellulaires ou des mécanismes de lésion cellulaire associés aux signaux TUNEL-positifs [2].

Les cassures d'ADN mesurables par TUNEL sont produites principalement par des endonucléases apoptotiques. Les endonucléases les plus actives dans le rein sont la désoxyribonucléase 1 (DNase I) et l'endonucléase G (EndoG) [8–10]. La DNase I est l'endonucléase apoptotique la plus active et la plus abondante chez les mammifères [11]. Le rein, les glandes salivaires, le pancréas et l'intestin sont des organes connus pour produire de grandes quantités de DNase I. Les cellules épithéliales des glandes salivaires, du pancréas et de l'intestin sécrètent la DNase I en tant qu'enzyme digestive dans le tube digestif. Certaines DNase I cellulaire luttent contre l'ADN « étranger » envahissant les cellules hôtes [12]. La DNase I non sécrétée présente un danger caché pour l'ADN de la cellule hôte, mais normalement les DNases n'agissent pas sur l'ADN de la cellule hôte jusqu'à la blessure ou la mort de la cellule. Dans le rein, la DNase I est sécrétée par les cellules épithéliales tubulaires, vraisemblablement pour détruire les virus et les bactéries dans l'urine. Cette fonction a probablement lieu en conjonction avec des protéinases, en particulier la méprine, qui est la principale protéinase dans l'urine [13]. Bien qu'il protège contre l'infection, la présence de DNase hautement active dans le rein rend cet organe vulnérable aux blessures, où l'activité de la DNase est connue pour être cytotoxique pour les cellules hôtes. Les DNases favorisent la mort cellulaire induite par des stimuli toxiques ou hypoxiques et détruisent toutes les cellules d'ADN du rein de l'hôte libérées à la suite de la mort cellulaire.

Reinssont des organes filtrants qui éliminent les composés toxiques du corps. L'activité élevée de la DNase I dans les reins rend les cellules rénales très sensibles aux lésions causées par les composés toxiques et leurs produits métaboliques. Cela fait de TUNEL la méthode la plus appropriée et la plus applicable pour mesurer les lésions rénales. Dans cette revue, nous nous concentrerons sur TUNEL en tant qu'essai largement utilisé, informatif et précis pour la mesure de la mort cellulaire et des lésions tissulaires dans le rein. Nous discuterons des aspects de TUNEL tels qu'ils s'appliquent aux maladies et aux lésions rénales et identifierons les qualités, les techniques et les caractéristiques sous-utilisées de TUNEL pour promouvoir l'utilisation productive et appropriée de ce test puissant dans la recherche, le diagnostic et le traitement des maladies rénales. Nous discuterons également de divers modèles d'images TUNEL qui peuvent être liés aux mécanismes de mort cellulaire. Les points soulevés dans cette revue sont largement applicables à l'utilisation de TUNEL dans des organes autres que le rein.

Mots clés:TUNNEL ; mort cellulaire; un rein; les ADNases ; endonucléases; lésion tissulaire

Principes TUNELLe test TUNEL a été développé en 1992 par Gorczyca et al. [14] et Gavrieli et al. [15], utilisant respectivement un marquage au fluorochrome et à l'avidine-peroxydase. À cette époque, il y avait un besoin désespéré de nouvelles méthodes pour évaluer l'apoptose, et TUNEL a réussi à combler cette lacune. Initialement commercialisé comme test de rupture de brin d'ADN pendant ou associé à l'apoptose [14,16], en l'absence de meilleurs tests, TUNEL est rapidement devenu le test standard de l'apoptose [17,18]. Cependant, il a été reconnu presque immédiatement par les chercheurs que TUNEL mesurait sans discernement toute fragmentation de l'ADN, pas seulement celle associée à l'apoptose [19-21]. Néanmoins, le besoin de tests d'apoptose était si grand que les rares rapports indiquant que TUNEL n'était pas spécifique de l'apoptose étaient généralement ignorés. Cela a conduit à une énorme quantité de rapports faussement positifs d'apoptose dans le rein et d'autres organes, au point où jusqu'à 20 % des cellules totales ont été rapportées apoptotiques même sans blessure [22-25] lorsque des changements comme aussi petit que 0,01 % pourrait être une preuve statistiquement significative de lésion tissulaire.

Le test TUNEL a connu une renaissance ces dernières années depuis la fin du boom des études sur l'apoptose il y a quelques années. Notre recherche PubMed d'articles de revues impliquant les termes "rein" et "TUNEL" a produit plus de 1500 résultats de 1992 à 2020. En 2019, 170 articles ont été publiés, le nombre le plus élevé en une seule année au cours des 28 dernières années (Figure S1) et qui constituent la majorité des articles examinés pour cette revue. De nombreuses études ont utilisé la positivité TUNEL comme mesure universelle de la mort cellulaire associée à la fragmentation de l'ADN dans d'autres types de mort cellulaire en dehors de l'apoptose. Par exemple, la ferroptose, une forme nouvellement découverte de mort cellulaire programmée et non apoptotique déclenchée par des dommages oxydatifs qui se produit au cours de l'ischémie-reperfusion rénale (IR) chez la souris, peut être détectée par TUNEL [26]. La pyroptose, qui est une forme inflammatoire de mort cellulaire programmée distincte de l'apoptose et de la nécrose, est associée à des signaux TUNEL-positifs [27,28]. La positivité au TUNEL a été observée au cours de la nécroptose qui a contribué à la déplétion progressive des cellules du tubule rénal chez les rats soumis à une néphrectomie subtotale [29]. Dans le rein et d'autres tissus, des signaux TUNEL positifs ont été trouvés dans la nécrose [30,31], l'autophagie dérégulée [32–35], l'anoikis [36,37], la catastrophe mitotique [35,38], l'autolyse [39], la pautolyse [39], exophtalmie [40] et aponévrose [30], démontrant que TUNEL est un test vraiment universel pour la mort cellulaire irréversible.

Le test TUNEL est basé sur le marquage des extrémités 3'OH par une enzyme ADN spécifique à l'extrémité 3'OH, la désoxynucléotidyl transférase terminale (TdT) (Figure). L'utilisation de l'ADN polymérase ou de l'ADN polymérase du fragment de Klenow à la place du TdT peut aider à déterminer le type d'extrémités 3'OH (entailles, lacunes ou oligos en surplomb) car les ADN polymérases ont besoin d'une matrice (le brin d'ADN opposé) et ne marqueront donc pas extrémités d'ADN pendantes ou saillantes. Il est important de se rappeler que la production d'extrémités d'ADN 3ZOH n'est pas unique aux endonucléases apoptotiques (dégradant l'ADN). Les extrémités 3'OH de l'ADN sont un signal "communicateur" majeur, un dénominateur commun de la majorité des enzymes de l'ADN. Ils sont produits et utilisés par presque toutes les enzymes de l'ADN chez les eucaryotes, y compris les endonucléases de réparation de l'ADN (apurinique/apyrimidique, AP), les exonucléases, les ADN polymérases, les ADN ligases, les ADN transférases et les topoisomérases. De plus, les conjugués 3'Id 3z-sucre ou 3z-protéine peuvent être convertis en terminaisons 3'OH par des phosphatases, des glycosylases et des protéinases, respectivement. C'est pourquoi une compréhension précise de ce qui est mesuré est nécessaire pour l'application réussie de TUNEL et l'interprétation de ses résultats.

Par rapport à deux autres méthodes principales de mesure de la fragmentation de l'ADN, l'échelle d'ADN et le test des comètes, TUNEL a l'avantage d'être basé sur l'identification des terminaisons d'ADN plutôt que sur des fragments (Figure 2). Théoriquement, TUNEL devrait être plus sensible et linéaire pour l'identification de la fragmentation initiale (faible) de l'ADN que l'échelle ou la comète de l'ADN, qui ont toutes deux une période de latence d'accumulation de petits fragments à haute mobilité. Dans tous les cas, les études combinant TUNEL avec une comète )41,42] ou une échelle d'ADN [43,44] ont l'avantage de détecter la fragmentation précoce de l'ADN avec une sensibilité maximale.

Applications TUNELTUNEL est utilisé pour identifier et quantifier les lésions rénales dans les études toxicologiques cliniques et fondamentales dans une large gamme d'applications, y compris les traitements médicaux [45], les expositions environnementales [46], agricoles [41] et industrielles [47], et les expositions animales [48 ] et sciences alimentaires [49]. TUNEL est applicable à tous les types de cellules, organes et espèces qui ont de l'ADN et des DNases, ce qui inclut à peu près toutes les espèces. TUNEL a été utilisé pour identifier et quantifier les lésions rénales chez un large éventail d'animaux, y compris le poisson zèbre [50], le riz japonais [51], les poulets [48], les gerbilles [52], les souris [41], les rats [45], rabb its [53], mini-cochons [54] et humains [55]. Un avantage important de TUNEL est qu'il peut être utilisé aussi bien dans des cellules fixées en culture que dans des tissus fixés. Cela fournit une cohérence méthodologique pour la comparaison entre les résultats in vitro et in vivo dans des études dans lesquelles les mécanismes peuvent être étudiés dans des cellules rénales en culture, tandis que les implications in vivo sont évaluées dans les reins des animaux. Tout ce qui se situe entre les cellules entières et les tissus peut également être utilisé, y compris les sphéroïdes cellulaires en culture [56] et les tranches de rein ex vivo [57,58].

L'intensité de TUNEL en termes de puissance de signal ou de nombre de cellules TUNEL-positives peut varier d'une espèce à l'autre en fonction de l'activité des DNases. Dans notre expérience, le rein de rat a plus de DNase I active que le rein de souris, et la force du signal positif au TUNEL est en corrélation avec cela. Lorsque le rein est comparé à d'autres organes, son signal TUNEL-positif est très intense et similaire à d'autres organes à forte activité DNase I, tels que l'intestin et la glande salivaire. À l'autre extrémité du spectre, la plus faible intensité de signal positif au TUNEL est observée dans le cerveau et les cellules tumorales / cancéreuses, où l'expression de la DNase I est très probablement inactivée par l'épissage alternatif dans la région codante [59]. Le signal TUNEL-positif est observé dans tous les types de cellules du rein. En moyenne, l'épithélium tubulaire est endommagé plus souvent que les glomérules, en particulier dans les lésions aiguës (figure 3A). Cela correspond bien à l'activité DNase I qui prévaut dans ces types de cellules. À en juger par les différences de sexe et d'âge observées dans nos expériences, la DNase I est plus abondante et active chez les mâles que les femelles et les animaux d'âge moyen par rapport aux animaux âgés ou nouveau-nés. Cependant, aucune différence nette dans la positivité TUNEL n'est évidente par rapport au sexe ou à l'âge, probablement parce que le ou est prédominant par d'autres facteurs. Dans certains modèles rénaux (comme l'ischémie-reperfusion), la DNase I est induite [9] ; tandis que dans d'autres, il n'est pas et peut même être supprimé (par exemple, dans la toxicité du cisplatine) [10]. Il a été démontré que l'activation des endonucléases, si elles sont présentes, se produit dans les premières 24 heures après une lésion rénale [9, 60, 61]. Par conséquent, il n'est pas surprenant qu'au moins la moitié des applications TUNEL dans la recherche sur le rein dans cette revue aient été utilisées pour l'insuffisance rénale aiguë (IRA) puisque l'évaluation de l'IRA est souvent effectuée dans les 24 à 72 h après la blessure lorsque les endonucléases sont les plus actives. . La liste des études sur l'IRA est longue et comprend des lésions toxiques, septiques, de transplantation et hypoxiques. Dans ce travail, nous avons étudié les modèles, les types d'exposition, les traitements, les délais d'évaluation et les types de cellules concernés par ces études. Les études qui ont fait l'objet de l'enquête couvraient les modes aigus et mixtes aigus-chroniques de lésions rénales et d'insuffisance rénale chronique.

Le fait qu'une lésion rénale avec un signal TUNEL-positif soit observé dans les tubules ou le glomérule dépend du type d'agent nocif ou de maladie. Par exemple, la néphrite lupique chez l'homme et les dommages causés par les nanoparticules de nickel ont été décrits comme ayant des signaux TUNEL strictement glomérulaires positifs [62,63]. D'autre part, l'ischémie-reperfusion et la néphropathie diabétique induite par la streptozotocine chez le rat ont produit des cellules TUNEL-positives uniquement dans les tubules [64,65]. Les tubules proximaux, l'anse de Henle, les tubules distaux et les conduits collectifs sont souvent TUNEL-positifs dans les modèles d'ischémie-reperfusion. Des cellules TUNEL-positives dans les glomérules et les tubules ont été décrites chez des rats exposés à des médicaments tels que la cyclosporine A [66] et la doxorubicine [67] ou des matériaux de produits de consommation tels que des nanoparticules d'oxyde de zinc [68] et dans un modèle de rat de diabète sucré [ 69]. L'IRA induite par un choc septique chez l'homme était également associée à des cellules TUNEL-positives glomérulaires et tubulaires [70]. une occlusion de l'intestin grêle en boucle fermée étranglée a provoqué une positivité TUNEL dans le rein en 3 heures [87].

L'IRA peut survenir après une greffe et des lésions hypoxiques. Le rejet d'allogreffe chez l'homme est couramment associé à l'élévation des cellules TUNEL-positives [88,89]. Après une ischémie froide, des cellules TUNEL-positives ont généralement été observées dans les 2 à 24 h pendant la reperfusion [90], ou plus étroitement, entre 14 et 17 h après l'ischémie [91], et parfois nous sommes encore observées jusqu'à 7 jours dans rejet de greffe [92]. De même, dans les modèles d'ischémie-reperfusion, les cellules TUNEL-positives étaient le plus souvent observées 24 h après la reperfusion [44,93,94], ou dans la fourchette entre 4 [95,96] et 72 h [97]. Dans les études de transplantation et d'IRA ischémique, les cellules TUNEL-positives ont été localisées dans les cellules épithéliales tubulaires distales et proximales [44, 93]. Chez la sourisreinsaprès lésion d'ischémie-reperfusion, les cellules TUNEL-positives ont été décrites comme concentrées dans la jonction corticomédullaire, cible habituelle de la lésion ischémique [98].

Des lésions mixtes aiguës et chroniques, où des expositions toxiques, des états pathologiques et/ou des évaluations étaient à la fois aiguës (c.-à-d. heures, jours) et chroniques (c.-à-d. semaines, mois, années) dans la même étude, ont été observées dans la transplantation humaine rejet (biopsie 1 semaine à 3 ans post-transplantation) [88], infection par le virus de l'hépatite E porcine (7 et 14 jours post-inoculation) [52], stress induit par le pneumopéritoine au CO2 chez les hydronéphrotiquesreins(hydronéphrose à 2 semaines, 2 jours post-pneumopéritoine) [53], glomérulonéphrite proliférative mésangiale induite par le venin de serpent (1 à 14 jours post-injection) [99], obstruction urétérale unilatérale (1 à 14 jours d'obstruction) [100], exposition à l'acétate d'uranyle (1 à 28 jours d'exposition) [101], néphropathie à l'acide aristocholique (exposition quotidienne de 5 et 30- jours) [102] et hyperoxie néonatale (testée 1 à 60 jours après la naissance, exposition à l'hyperoxie les 14 premiers jours) [103]. Quatorze jours après l'impact est un moment d'évaluation très courant pour ce type delésions rénales[52,53,99,101,103]. Dans la majorité des cas, les cellules TUNEL-positives étaient localisées dans les tubules et les conduits collectifs. La seule exception était la toxicité du venin de serpent, qui endommageait principalement les glomérules [99].

Chroniqueun reinmaladie chronique (CKD), définie comme la présence deun reindommages ou une diminution du taux de filtration glomérulaire (DFG) chez l'homme pendant plus de 3 mois, est également un sujet commun pour l'évaluation TUNEL, qui peut déterminer si l'IRC est associée à une progressionlésions rénales.L'IRC la plus couramment étudiée dans laquelle TUNEL est appliqué est la néphropathie diabétique. La lésion identifiée par la positivité TUNEL s'est produite dans les tubules et les podocytes [69] chez les patients diabétiques présentant un diabète avant le test TUNEL allant de 7 à 30 ans [104,105] et 2 à 16 semaines après le traitement à la streptozotocine chez les rongeurs [106,107]. Une histopathologie similaire TUNEL-positive a été rapportée dans la néphropathie à immunoglobuline A [22]. Dans la néphrite lupique et la glomérulonéphrite membranoproliférative, la positivité TUNEL a été observée principalement dans les glomérules [62, 108, 109]. D'autre part, les études de sécurité des médicaments sur le cisplatine [110], la chloroquine [45], la doxorubicine [67], le finastéride [23], le tacrolimus [111] et le lévétiracétam [24] ont observé principalement des lésions tubulaires. De même, les lésions aiguës continues identifiées par les cellules tubulaires positives au TUNEL ont été décrites dans des études sur la néphropathie à l'acide urique [112], la carence en méthionine [48], l'exposition aux toxines environnementales microcystine-LR [50] et le cadmium [113], et dans association avec l'oxalate de calcium induiteun reinpierres [114] et nanoparticules calcifiantes [115]. Bien que l'identification des lésions rénales progressives au cours de l'IRC à l'aide du test TUNEL soit un outil de diagnostic utile, la combinaison du test TUNEL avec l'immunohistochimie (IHC) serait peut-être encore plus informative pour déterminer le mécanisme de la blessure.

Techniques de quantification et de colocalisation TUNEL

Les méthodes de quantification TUNEL varient. Dans la majorité des rapports, les cellules/noyaux positifs au TUNEL sont quantifiés en pourcentage du nombre total de cellules/noyaux [83, 116, 117]. Cela semble être la bonne chose à faire, bien que le nombre de cellules TUNEL-positives ne corresponde probablement pas exactement au nombre de cellules mortes. Certaines cellules peuvent ne pas avoir atteint des niveaux identifiables de fragmentation de l'ADN, tandis que d'autres peuvent déjà avoir été éliminées par les macrophages. La quantification du nombre de cellules TUNEL-positives par unité carrée (mm2) est également utilisée [118], mais cette méthode semble moins précise car elle dépend de la localisation et du contenu cellulaire des zones. Les sections corticales contiennent principalement des glomérules, des tubules, des vaisseaux sanguins et des rayons médullaires, tandis que les sections médullaires contiennent principalement des anses de Henle, des conduits collecteurs et des vaisseaux sanguins. La quantification "par Fifield" dépend certainement de ce qu'est le champ [72,119], et la quantification "par section" est, plus encore, indéfinie [61,120]. Des mesures mal identifiées, telles que « score histologique » [121], « indice d'apoptose » [113], « taux d'apoptose » [92], « pourcentage d'apoptose » [122], ou pourcentage de contrôle non traité [123, 124], semblent être encore moins approprié, et rendre l'interprétation difficile et non comparable avec la majorité des études.

La mort cellulaire dans les cellules voisines commence de manière inégale car elle dépend de la vascularisation, du cycle cellulaire et d'autres variables. Cela se traduit souvent par une coloration TUNEL inégale des cellules dans le tissu [45, 96, 125]. Étonnamment, l'intensité générale du signal TUNEL-positif n'est pas utilisée pour la mesure TUNEL, bien qu'elle dépende directement du degré de fragmentation de l'ADN. C'est peut-être parce que les cellules sont considérées comme mortes indépendamment de l'intensité du signal TUNEL, car une cellule ne peut pas être "plus morte" si la coloration TUNEL est plus intense. Bien qu'il soit difficile de comparer des études qui utilisent une grande variété de méthodes pour quantifier les résultats TUNEL, la quantité de cellules TUNEL-positives chez les animaux témoins est généralement inférieure à 2 % [75, 99, 100, 116, 126]. Une blessure aiguë est associée à une augmentation d'environ 5 à 40 × de la positivité TUNEL [79, 126, 127]. Au cours d'une blessure chronique, l'augmentation du nombre de cellules TUNEL-positives est légèrement inférieure, ~ 2–20- fois, [29, 43, 65] par rapport aux témoins non traités.

Le test TUNEL initial basé sur la coloration à la diaminobenzidine (DAB) a été conçu pour la microscopie optique [14,15]. Cette méthode traditionnelle était encore utilisée dans les deux tiers des études examinées dans cette revue et dans l'écrasante majorité des études de biopsie humaine. La quantification se fait par comptage manuel des cellules et, bien que précise, elle prend du temps. Souvent, la quantification n'est pas du tout utilisée et les résultats sont présentés à l'aide d'images d'échantillons traités et colorés comme simple preuve que la mort cellulaire a eu lieu. L'automatisation peut accélérer le processus de quantification [128,129]. Cependant, le DAB ne peut être combiné à aucune autre coloration dans le même échantillon, et donc TUNEL basé sur le DAB ne peut fournir que le nombre de cellules mortes, sans aucune identification du type de cellule (sauf la reconnaissance visuelle) ou du mécanisme de mort cellulaire.

Alors que les études humaines s'appuient massivement sur TUNEL basé sur DAB utilisant la microscopie optique, environ la moitié des études animales utilisent la microscopie fluorescente FL (Figure 3). Le TUNEL fluorescent est visuellement attrayant, facilement interprétable et présente plusieurs avantages majeurs. En plus de la quantification précise par identification des noyaux TUNEL-positifs ou de l'intensité moyenne de la couleur, le signal TUNEL fluorescent FL peut être colocalisé avec d'autres couleurs pour l'histochimie (par exemple, DAPI) (Figure 3A) ou IHC (Figure 3B). Dans ce dernier cas, l'utilisation de marqueurs protéiques peut aider à identifier les signaux TUNEL-positifs associés à différentsun reincompartiments ou donner des informations sur le type de mort cellulaire. Nous n'avons trouvé aucun exemple de TUNEL combiné à une double coloration d'anticorps IHC. Alors qu'une telle combinaison serait très instructive, par exemple, pour l'identification d'un mécanisme de mort cellulaire dans certains types de cellules, les difficultés techniques associées à une telle coloration peuvent l'emporter sur les avantages.

Identification deun reinle type de cellule n'est certainement pas un problème pour une personne expérimentéeun reinpathologiste [104]. Pour cette raison, l'utilisation de marqueurs supplémentaires pour l'identification du type cellulaire, par exemple, en utilisant CD31 pour l'identification des cellules endothéliales [130], est rare. Cependant, l'utilisation de marqueurs protéiques IHC pour la caractérisation des lésions tissulaires est souvent utilisée. La plupart des études utilisent la positivité TUNEL comme seule preuve de l'apoptose. Dans d'autres études, la reconnaissance que la positivité TUNEL n'est pas spécifique de l'apoptose a conduit à de nombreux marqueurs morphologiques (par exemple, coloration à l'hématoxyline et à l'éosine ou à l'acide périodique Schiff), biochimiques et IHC à combiner avec la coloration TUNEL pour confirmer l'apoptose. Le marqueur le plus couramment utilisé pour l'apoptose caspase-dépendante est la caspase clivée (active)-3 en utilisant un anticorps qui ne reconnaît pas la caspase pleine taille-3 [131, 132]. Les tests TUNEL et caspase clivée -3 ont montré une coloration exclusivement tubulaire, non glomérulaire, dans l'ischémie-reperfusion chez le rat [64]. D'autres études sur la caspase ont utilisé la caspase-1 [27], -9 [53], -11 [28] et -12 [75]. D'autres marqueurs apoptotiques comprenaient la famille de protéines Bcl-2 [27], Bcl2L1 [43], Bcl-xl [71], Bax [99], Bak [49] et Bad [43] ; récepteur apoptotique Fas [52] et récepteur apoptotique-ligand FasL [66] ; les facteurs de transcription de la protéine Forkhead Box (FOX) Fox01 [133] et Fox03 [27] ; et le cytochrome c [53]. L'inflammation a été identifiée par l'IHC du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF) [134] ; les facteurs de croissance tumorale TGF [66] et TGF- 1 [135] ; sérine/thréonine kinase 1 (SGK1) [135] ; flavoprotéine de transfert d'électrons, sous-unité bêta (ETF) [136] ; Janus kinase-2 (JAK2) [137] ; transducteur de signal et activateur de transcription 3 (STAT3) [137] ; activateur de la chaîne légère kappa du facteur nucléaire des cellules B activées (NF-κB) [137] et sa protéine inhibitrice IκB [137]. Pourun reinévaluation des lésions, molécule de lésion rénale-1 (KIM-1) [24], canal aquaporine-1 (AQP-1) [45], facteur inductible par l'hypoxie {{7} }facteur de transcription alpha (HIF-1) ​​[103], transporteur d'acides aminés de type Asc-1 (Asc-1) [121], cible mammifère de la rapamycine (mTOR) [131] kinase , et la transglutaminase II [89] ont été utilisées. Les lésions rénales oxydatives ont été étudiées à l'aide de marqueurs tels que l'8-hydroxyguanosine (8OHdG) [102], la lipocaline associée à la gélatinase des neutrophiles (NGAL) [102], la sirtuine désacétylase dépendante du NAD-1 (SIRT1) [138] , et hème oxygénase 1 (HO-1) [90]. Les kinases ont été étudiées de manière intensive, y compris la voie de la kinase c-Jun N-terminale (JNK) [101], la phosphoinositide 3-kinase/protéine kinase B/facteur nucléaire érythroïde 2-facteur de transcription lié au facteur 2 (PI3K/ Akt/Nrf2) [46], pannexine-1 (PANX1) plasma membrane gap junction protein [26] et mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase (MAPK/ERK) [26]. Les études sur les endonucléases apoptotiques impliquaient la DNase activée par la caspase (CAD) [139], la DNase I [108] et l'EndoG [139], et les marqueurs de dommages à l'ADN comprenaient la protéine tumorale p53 (p53) [99] et la protéine 1 liée à la dynamine (PARP1 ) [66]. Certaines études ont également trouvé l'évaluation de l'apoptose médiée par le stress du réticulum endoplasmique et des lésions tissulaires utiles [75].

Compte tenu du grand nombre d'études mécanistes étudiées et de l'avantage de combiner TUNEL avec des marqueurs IHC pour l'identification des mécanismes de mort cellulaire, on pourrait s'attendre à de nombreuses études utilisant la colocalisation entre les deux. L'analyse peut être effectuée par une colocalisation pixel par pixel entre les cellules TUNEL-positives et les marqueurs IHC, l'intensité moyenne du marqueur IHC dans les zones TUNEL-positives, ou le signal TUNEL-positif signifie l'intensité dans les zones positives du marqueur IHC. Malheureusement, cet avantage de TUNEL n'a été utilisé que dans quelques études. Les cellules TUNEL-positives ont été colocalisées avec la caspase clivée -3 dansun reintubules lors de la toxicité du paracétamol chez le rat [74]. La colocalisation IHC avec le signal TUNEL-positif a permis l'identification de la mort cellulaire des cellules mésangiales au cours de la néphrite de Habu [99]. En microscopie optique, la colocalisation avec des marqueurs mécanistes de toxicité a été effectuée dans des coupes en série, comme indiqué par Ott et al. [89].

Problèmes et limites de TUNEL

Plusieurs problèmes potentiels peuvent survenir et doivent être attendus lorsque vous travaillez avec TUNEL. La première est que les terminaisons d'ADN 30OH se produisent non seulement pendant la mort cellulaire en raison de l'action de l'endonucléase, mais également en tant que métabolite intermédiaire normal dans presque toutes les réactions enzymatiques avec l'ADN. Une fonction cellulaire primaire qui produit les terminaisons 30OH est la synthèse d'ADN, dans laquelle de nombreux fragments d'Okazaki peuvent théoriquement produire un signal TUNEL faussement positif, en particulier dans les modifications très sensibles du test. Durantlésion rénale,La réparation de l'ADN peut également contribuer à de faux signaux TUNEL-positifs à la suite d'une action de l'endonucléase AP. Une lésion rénale oxydative massive induite par une lésion chimique (peroxyde d'hydrogène, bléomycine) ou physique (irradiation gamma) peut augmenter le nombre d'extrémités 30OH, augmentant les lectures TUNEL faussement positives en dehors de la fragmentation de l'ADN médiée par l'endonucléase.

Plus souvent et plus probablement, des conditions expérimentales mal définies de la réaction TdT (temps, température, activité enzymatique ou cofacteurs) peuvent entraîner un fond de signal TUNEL-positif artificiellement élevé. Bien qu'il reste indéfini quant à ce qui est considéré comme la ligne de base normale pour les échantillons de tissus rénaux non traités, il semble plausible qu'environ 1 % du total des cellules soit un nombre raisonnable. Certes, un bruit de fond de 10 % ou plus est une preuve claire de conditions de test non caractérisées et non raffinées ou d'un écart par rapport aux conditions de stockage d'échantillon appropriées.

Un autre problème auquel il faut s'attendre est la faible activité de la DNase I dans certains types de cellules (par exemple, l'endothélium),un reincompartiments (p. ex., glomérules) ou tissus pathologiques (p. ex., tumeurs). On devrait s'attendre à ce que ces cellules présentent une faible positivité TUNEL, non pas parce qu'elles sont résistantes aux blessures, mais parce qu'il n'y a pas suffisamment d'activité d'endonucléase pour produire un signal mesurable dans TUNEL. D'après notre expérience, même des changements entre {{0}},01 % et 0,1 % des cellules positives au TUNEL peuvent être statistiquement significatifs et utilisés comme preuve solide d'une lésion rénale (d'un autre tissu).

Enfin, un problème de quantification de la coloration TUNEL survient lorsque la quantité de fragmentation de l'ADN est trop élevée, par exemple, à des stades avancés de la mort cellulaire ou lors de blessures de haute intensité, où l'ADN restant ne peut pas être correctement contre-coloré avec du DAPI en raison du démontage du double hélice (Figure 3D). Dans ces cas, les signaux TUNEL-positifs sont "suspendus dans l'air", et apparemment non associés à un noyau. Il devient de la responsabilité d'un pathologiste de les interpréter comme des cellules TUNEL-positives plutôt que comme un artefact. Avec TUNEL marqué à la fluorescéine, il existe un risque d'identifier l'autofluorescence de fond dans les tissus comme une positivité TUNEL [140]. Dans ces cas, un passage au spectre rouge TUNEL [51,54] est recommandé.

Modèles TUNEL comme source d'informations supplémentaires

Plusieurs modèles TUNEL peuvent être clairement distingués et utilisés pour déterminer un mécanisme potentiel et le degré de blessure (tableau 1, figure 3). Habituellement, un type de motif TUNEL uniquement pour les noyaux est produit par une blessure légère, tandis qu'une blessure plus forte (c'est-à-dire une exposition élevée) entraîne une coloration et une désintégration plus fortes des noyaux ou des cellules. Un motif TUNEL strictement apoptotique est la fragmentation nucléaire résultant de la formation de corps apoptotiques (Figure 3E). De petits fragments de noyaux TUNEL-positifs, qui sont probablement des corps apoptotiques, ont été observés dans l'ischémie-reperfusion du rat à 24–72 h [97]. Des corps apoptotiques ont également été observés avec le marquage TUNEL des noyaux dans l'épithélium tubulaire rénal et l'interstitium 14 jours après une lésion d'ischémie-reperfusion chez le rat [141]. L'augmentation des doses d'huile de lavande a réduit les schémas TUNEL des noyaux uniquement et les a convertis en TUNEL de type nécrose avec fuite cytoplasmique [94]. Ce dernier était le résultat de la destruction de l'enveloppe nucléaire due à l'action des protéinases et des lipases dans la nécrose. Le TUNEL cytoplasmique (Figure 3F) vu comme un cytoplasme TUNEL-positif a été observé en microscopie optique dans le modèle de rhabdomyolyse dans les tubules de rat [142] et dans les podocytes cultivés en présence de glucose élevé et dans la néphropathie diabétique chez la souris [135]. Le TUNEL cytoplasmique a également été décrit dans l'ischémie-reperfusion rénale chez la souris en utilisant le TUNEL fluorescent FL [98] et dans l'ischémie-reperfusion chez le rat en utilisant la microscopie optique [143]. Lésions profondes et exclusivement tubulaires induites par le chlorure mercurique avec une forte coloration TUNEL cytoplasmique indiquant une lésion de la membrane nucléaire [60]. Si la blessure continue ou si la dose de l'agent nocif augmente, le TUNEL cytoplasmique peut être converti en une image "désordonnée" du TUNEL dispersé (Figure 3G) attribué aux derniers stades de la destruction cellulaire due à la nécrose et au déversement de cytoplasme cellulaire et de débris. Par exemple, des TUNEL cytoplasmiques et dispersés ont été observés chez les souris traitées au cisplatine [71, 72] et les rats [144], et dans les lésions des podocytes chez les rats diabétiques induits par la streptozotocine [145]. Des TUNEL nécrotiques dispersés ont également été observés au cours de la néphrotoxicité induite par l'acétate d'uranyle chez la souris [101]. Enfin, une autre variable de signal TUNEL à laquelle il faut prêter attention est l'intensité des signaux TUNEL-positifs, qui peuvent dévier d'une cellule à l'autre en fonction du nombre de pauses (degré de blessure) subies par chaque cellule, comme documenté par certaines études [45, 96, 125 ]. Pour les modèles dans lesquels une intensité variable du signal TUNEL est observée, la quantification à la fois par le nombre d'objets TUNEL-positifs et l'intensité moyenne de la coloration est recommandée.

conclusion

En raison de la forte activité des endonucléases apoptotiques dans le rein, en particulier la DNase I et EndoG, l'utilisation de TUNEL pourrecherche et diagnostic du reinest très instructif. Cela peut devenir encore plus utile si TUNEL est appliqué au-delà de son utilisation initiale comme méthode d'identification de l'apoptose. L'application de TUNEL exclusivement pour les études sur l'apoptose est un bon exemple de la manière dont la science peut être détournée par inadvertance par une méthode utilisée de manière inappropriée. Malgré son utilisation comme test de blessure principalement aiguë, TUNEL peut être appliqué avec succès pour évaluer à la fois l'IRA et l'IRC. Cependant, dans l'IRC, le degré de positivité TUNEL devrait être inférieur à celui des lésions aiguës. Étant donné que l'activité des endonucléases (principalement la DNase I) est beaucoup plus élevée dans l'épithélium tubulaire que dans les autres compartiments rénaux, les lésions des tubules rénaux sont généralement considérées comme plus importantes. Cependant, les lésions glomérulaires ou vasculaires peuvent également être étudiées à l'aide de TUNEL si la lésion survient effectivement dans ces compartiments. La colocalisation de FL fluorescent TUNEL avec des marqueurs IHC permet l'identification et l'association de types de cellules et de mécanismes de mort cellulaire avec des signaux TUNEL. La quantification TUNEL peut apporter des informations précieuses sur le degré de mort cellulaire, et l'application d'un logiciel d'analyse d'image peut être très utile à cet égard. Compte tenu de la variété des modèles TUNEL, des images représentatives sont fortement suggérées pour établir et démontrer

Signaux TUNEL considérés comme positifs. Enfin, les modèles TUNEL doivent être utilisés comme source d'informations supplémentaires, telles que le mécanisme de mort cellulaire et le degré de toxicité. Par exemple, la distinction entre les corps apoptotiques TUNEL-positifs, la présence de signaux TUNEL cytoplasmiques ou les modèles TUNEL dispersés peut aider à identifier les cellules apoptotiques par rapport aux cellules nécrotiques TUNEL-positives pour des interprétations plus précises des résultats de recherche et de diagnostic.

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