Mutations UMOD dans l'insuffisance rénale chronique à Taiwan

Abstrait:UMODest le premier gène identifié et le plus fréquemment muté responsable de la transmission autosomique dominante.maladie rénale tubulo-interstitielle(ADTKD). Des études récentes ont montré que l'ADTKD-UMODest une cause relativement fréquente demaladie rénale chronique(IRC). Cependant, le statut de l'ADTKD-UMODà Taiwan reste inconnu. Dans cette étude, nous avons identifié trois hétérozygotesUMODvariantes faux-sens, c.121T > C (p.Cys41Arg), c.179G > A (p.Gly60Asp) et c.817G > T (p.Val273Phe), dans un total de 221 familles CKD sélectionnées (1,36 %). Deux de ces variantes faux-sens, p.Cys41Arg et p.Gly60Asp, n'ont pas été rapportées auparavant. In vitro, des études ont montré que les deux variantes d'uromoduline présentent des défauts dans le trafic membranaire cellulaire et l'excrétion vers le milieu de culture. Le modèle de structure prédit une formation altérée de liaisons disulfure dans les deux variantes, mais seul p.Gly60Asp devrait provoquer une déstabilisation des protéines. Nos résultats étendent le spectre des mutations et indiquent que l'ADTKD-UMODcontribué à une cause petite mais significative d’IRC dans la population taïwanaise.

Mots clés : uromoduline ;maladie rénale chronique(IRC); tubulo-interstitiel autosomique dominantmaladie du rein(ADTKD); insuffisance rénale (KF).

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1. Introduction

L'ADTKD est une maladie héréditaire dominante rare causée par des mutations hétérozygotes de UMOD [1], MUC1 [2], HNF1B [3], REN [4] et SEC61A1 [5]. L'UMOD est la première cause identifiée et la plus fréquente d'ADTKD, et elle a fait l'objet d'enquêtes approfondies [1,6]. Bien que rare, l’ADTKD est le troisième syndrome monogénique le plus courant.maladie du reinsuite à une PKD et une néphropathie au collagène de type IV, mais la prévalence de l'ADTKD-UMOD reste incertaine, et des études récentes montrent qu'elle représente jusqu'à 2 % des patients atteints de KF ou 0,3 % de tous les individus atteints d'IRC [7, 8]. UMOD code pour l’uromoduline et est la protéine la plus abondante dans l’urine humaine [9]. L'uromoduline est une protéine spécifique du rein produite par les cellules épithéliales de la branche ascendante épaisse de l'anse de Henle et de la partie précoce du tube contourné distal [10], et elle se forme sous forme de polymère de haut poids moléculaire via sa zone. domaine pellucida [11]. De plus, l'uromoduline est une protéine hautement glycosylée, avec sept sites de N-glycosylation et un clivage à l'extrémité du C-terminal par la sérine protéase hepsine, avant d'être excrétée dans la lumière tubulaire [9,12,13]. La fonction de l'uromoduline comprend la protection contre la cristallisation de l'oxalate de calcium [14], la défense contre les infections des voies urinaires causées par des bactéries uropathogènes [15-18] et la régulation du canal ionique Ca2+-K+ [19]. L'effet des mutations de l'UMOD est un retard de maturation, une rétention dans le réticulum endoplasmique (RE), une expression réduite au niveau de la membrane plasmique et une diminution de l'excrétion urinaire, ce qui conduit au stress du RE et à la réponse protéique dépliée (20-22).

Les phénotypes cliniques de l'ADTKD-UMOD ne sont pas spécifiques et incluent l'IRC, la goutte, l'hyperuricémie, la protéinurie normale à légère, la présence ou l'absence d'antécédents familiaux et la plupart des individus touchés entrant dans la KF entre 30 et 50 ans [23]. L'histologie rénale montre une dilatation ou une atrophie tubulaire, une annulation ou un épaississement de la membrane basale tubulaire, une fibrose interstitielle et une accumulation d'uromoduline mutée sous forme de matériaux polymorphes non structurés révélés par la coloration au PAS [24,25].

Taiwan a l'incidence et la prévalence les plus élevées d'IRC et de KF sur la base des comparaisons internationales du rapport USRDS [26]. Cependant, aucune étude ne s'est concentrée sur le statut de l'ADTKD-UMOD dans la population IRC à Taiwan. Dans cette étude, nous avons examiné la prévalence des mutations ADTKD-UMOD dans une cohorte sélectionnée d'IRC dans un seul centre tertiaire de Taiwan.

2. Matériels et méthodes

2.1. Individus CKD et préparation de l'ADN

Cette étude a recruté 221 familles d'IRC (228 individus) du programme de soins de l'IRC de l'hôpital universitaire médical de Kaohsiung. Les critères d'inclusion incluaient des épisodes de goutte ou d'hyperuricémie avec un DFGe inférieur à 90 ml/min/1,73 m2 avant l'âge de 40 ans. Des échantillons de sang, des informations généalogiques et l'accès aux résultats des travaux de laboratoire ont été obtenus auprès des individus après avoir donné leur consentement éclairé. L'étude a été menée à la suite de la Déclaration d'Helsinki et approuvée par le comité d'examen institutionnel du KMUH (KMUHIRB-G(II)-20160024). L'ADN des échantillons de sang périphérique a été extrait selon la méthode standard.

2.2. Séquençage de l’exome et analyse bioinformatique

Le panneau Nextera Flex for Enrichment and Exome (CEX V2, Illumina, San Diego, CA, USA) a été utilisé pour la création de la bibliothèque exome. La sélection de la taille, la capture de séquence, l'enrichissement et l'élution ont été effectués conformément aux instructions du fabricant. La distribution de taille des bibliothèques d'ADN a ensuite été mesurée à l'aide de TapeStation 4150 (Agilent, Santa Clara, Californie, États-Unis), suivie d'un séquençage sur un Illumina NovaSeq 6000 avec des lectures à extrémités appariées de 150 pb. Les données fastq résultantes ont été alignées sur la séquence de référence du génome humain (GRCh37/hg19) et nous avons effectué un appel de variants nucléotidiques à l'aide de la plateforme DRAGEN Bio-IT (Illumina). Le fichier VCF a été analysé dans CLC Genomics Workbench (Qiagen, Germantown, MD, USA). Les variantes identifiées ont été étiquetées comme pathogènes/probablement pathogènes, de signification incertaine (VUS) ou bénignes, selon la classification de l'American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG), à l'aide du logiciel VarSome, et nous avons comparé les variantes qui existaient dans le ClinVar. , HGMD et dbSNP. Les variantes pathogènes, probablement pathogènes et VUS détectées ont été confirmées par séquençage de Sanger. Pour le séquençage Sanger, les produits de PCR ont été purifiés par traitement à la phosphatase alcaline/exonucléase I de crevette (78390, USB Products, Affymetrix, Santa Clara, CA, USA), puis soumis au séquençage des deux extrémités par séquençage par thermocycleur à l'aide du séquençage BigDye® terminateur 3.1. kit (4337458, Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) après analyse sur un analyseur d'ADN ABI 3730XL (Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific). Une analyse de ségrégation a été effectuée si l'ADN des membres de la famille était disponible. Les exons 2, 3, 4 et 5 de l'UMOD ont été criblés par séquençage de Sanger chez le proposant de 221 familles CKD, à l'exception de la famille DY5, qui a reçu un séquençage de l'exome. La séquence NCBI Ref NM_003361.4 est utilisée pour UMOD. La nomenclature standard recommandée par la Human Genome Variation Society (//www.hgvs.org/ ; consultée le 18 juillet 2022.) a été utilisée pour numéroter les nucléotides et nommer les mutations ou les variantes.

2.3. Culture cellulaire et transfection transitoire

Les cellules HEK293 (CRL-1573, ATCC, Manassas, VA, USA) ont été cultivées dans la modification par Kaighn du milieu F-12 de Ham (F-12K) (N3520, Merck/Millipore Sigma, Burlington , MA, USA) complété par 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (10437028, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), 100 unités/mL de pénicilline, 100 µg/mL de streptomycine (10378016, Gibco, Thermo Fisher Scientific ) et 10 unités/mL d'interféron (IF002, Merck/Millipore Sigma). Les cellules ont été maintenues à 37 ◦C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2.

La transfection transitoire de cellules HEK293 a été réalisée à l'aide de Lipofectamine 2000 (11668027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). En bref, 2,5 µL de Lipofectamine 2000 ont été ajoutés directement dans 100 µL de milieu Optimum (31985062, Gibco, Thermo Fisher Scientific) et incubés pendant 5 min à température ambiante. Un total de 1 µg d'ADN a été ajouté au mélange Lipofectamine 2000 – Optimum et incubé pendant 20 minutes supplémentaires. Le mélange d'ADN a été ajouté goutte à goutte à des plaques de culture cellulaire avec un milieu sans sérum à la fin de l'incubation. Pour l'état de santé des cellules après transfection transitoire, nous avons utilisé le compteur de cellules automatisé LUNA-II ™ (Aligned Genetics, Anyang-si, Gyeonggi-do, Corée) pour détecter la viabilité cellulaire par coloration au bleu trypan à un moment différent, et la plupart les cellules transfectées sont restées en vie malgré différentes surexpressions d'uromoduline (données non présentées).

2.4. Mutagenèse dirigée sur site

Le vecteur uromoduline de type sauvage marqué par HA a été obtenu auprès du Dr Rampoldi (27). Les constructions de mutation de p.Cys41Arg et p.Gly60Asp ont été créées à l'aide du kit de mutagenèse dirigée sur site QuikChange II (200523, Agilent) conformément aux instructions du fabricant. Les mutations ont été confirmées par séquençage de Sanger

2.5. ELISA et fractionnement

Les constructions d'expression de vecteur vide, d'uromoduline de type sauvage, d'uromoduline p.Cys41Arg et d'uromoduline p.Gly60Asp ont été transfectées de manière transitoire dans des cellules HEK293. Après transfection transitoire, le milieu de culture a été collecté à 8, 24 et 32 ​​h, puis stocké à -80 ◦C avant mesure. Pour l'immunotransfert, le milieu de culture a été condensé par Centri con (YM3, icône, Merck/Millipore Sigma) avant l'électrophorèse SDS-PAGE. ELISA a été utilisé pour réaliser des mesures de l'uromoduline dans le milieu de culture selon les instructions du fabricant (EHUMOD, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). En bref, le milieu de culture et les standards ont été dilués dans un diluant de test fourni dans le kit et ajoutés aux puits en double. Après 2,5 heures d'incubation à température ambiante, les puits ont été lavés avec du PBS et l'anticorps uromoduline biotinylé a été ajouté. Après 1 heure d'incubation à température ambiante, les puits ont été lavés à nouveau et un anticorps secondaire streptavidine-peroxydase de raifort a été ajouté. Après 45 minutes d'incubation à température ambiante, les puits ont été lavés à nouveau et la couleur a été développée en ajoutant une solution de substrat TMB et en incubant dans l'obscurité à température ambiante pendant 30 minutes. La réaction a été arrêtée par ajout de la solution d'arrêt fournie dans le kit, suivie d'une lecture immédiate de la DO450 et de la DO550. La concentration en uromoduline du milieu de culture a été déterminée par interpolation sur la courbe étalon.

Une fois le milieu de culture collecté, les cellules attachées à la boîte de culture ont été fractionnées à l'aide d'un kit de fractionnement de protéines subcellulaires (78840, Thermo Fisher Scientific) conformément aux instructions du fabricant. En bref, nous avons collecté des quantités égales de trois types différents de lysat cellulaire d'uromoduline et retiré tout le surnageant jusqu'à ce qu'il soit aussi sec que possible. Nous avons ajouté un tampon d'extraction cytoplasmique glacé contenant des inhibiteurs de protéase au culot cellulaire, incubé à 4 ◦C pendant 10 min avec un mélange doux, puis centrifugé à 500 × g pendant 5 min. Nous avons immédiatement retiré le surnageant (extrait cytoplasmique) dans un tube propre et pré-refroidi sur de la glace et ajouté un tampon d'extraction sur membrane glacée contenant des inhibiteurs de protéase au culot. La partie membranaire a été vortexée pendant 5 s au réglage le plus élevé et incubée à 4 °C pendant 10 min sous agitation douce. Nous avons transféré le surnageant (extrait membranaire) dans un tube propre et pré-refroidi sur de la glace après centrifugation à 3 000 × g pendant 5 min. La membrane subcellulaire et les protéines cytoplasmiques ont été analysées par Western Blot.

2.6. Analyse d'immunotransfert

Les échantillons de protéines ont été collectés à partir des cellules avec un tampon RIPA (R0278, Merck/Millipore Sigma) ou par l'étape de fractionnement. Par la suite, la concentration en protéines a été déterminée à l'aide d'un colorant pour dosage de protéines (5000006, BIO-RAD, Hercules, CA, USA) et en accès à une quantité égale de protéine, puis séparée par électrophorèse sur SDS-PAGE. Après avoir transféré les protéines sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (PVDF) (1620177, BIO-RAD), la membrane PVDF a été immergée dans du lait écrémé à 5 % à 1X TBST, bloquante pendant 1 h à température ambiante, et lavée trois fois avec 1X TBST pendant 5 minutes. Ensuite, nous avons incubé la membrane PVDF avec l'anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit, l'avons lavée trois fois avec 1X TBST pendant 5 min et l'avons incubée avec l'anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante. Il a été lavé trois fois avec 1X TBST pendant 5 min après l'incubation de l'anticorps secondaire, puis nous avons ajouté le kit de substrat de chimiluminescence améliorée (ECL) (GERPN2134, Merck/Millipore Sigma) et détecté le signal protéique à l'aide d'un processeur à rayons X (MXP{{ 19}}, KODAK, Rochester, NY, USA) sur film radiographique (Super RX, FUJIFILM, Minato-ku, TKY, JPN). Les anticorps primaires et secondaires ont été dilués avec 5 % de lait écrémé dans 1X TBST, et les informations détaillées sont les suivantes : 1 : 2000 pour l'uromoduline (sc-20631, Santa Cruz, Dallas, TX, USA) et 1 : 20 000 pour le lapin. HRP 2ème anticorps (GTX213110-01, GeneTex, Irvine, CA, USA).

2.7. Prédiction de la structure des protéines

Dynamite a été appliqué pour la prédiction de la structure 3D de l'uromoduline sauvage et mutante (//biosig.unimelb.edu.au/dynamut/; consulté le 15 juin 2022.) en utilisant la structure complète de l'uromoduline humaine native (Protein Banque de données : 7PFP) [28]. DiANNA a été utilisé pour la prédiction de la liaison disulfure (//clavius.bc.edu/~clotelab/ DiANNA/ ; consulté le 16 juin 2022.) de l'uromoduline de type sauvage et mutante (29-31).

2.8. Analyse statistique

Le logiciel d’analyse ImageJ a analysé et quantifié les bandes de transfert Western. Les analyses statistiques et les graphiques ont été réalisés et préparés à l'aide du logiciel GraphPad Prism8 (GraphPad Software Incorporation, San Diego, CA, USA), et la moyenne ± SEM a été présentée. Un test t non apparié a été appliqué pour une comparaison à deux groupes. Les résultats statistiques ont été marqués comme suit : * p < 0.05 ; ** p < 0.01 ; *** p < 0,001. Chaque expérience a été répétée au moins trois fois.

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